小豆蔻明靶向作用于mtor抑制血管平滑肌细胞增殖的研究

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1、小豆蔻明靶向作ffj丁．mTOR抑制衄管平滑肌细胞增殖的研究小豆蔻明靶向作用于mTOR抑制血管平滑肌细胞增殖的研究郑炜中文摘要f研究背景及目的1胰岛素抵抗(InsulinResistance，IR)是糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等疾病的共同病理生理基础，常引起中央或外周血管结构和功能的改变，导致血管张力的异常增加以及血管平滑肌细胞(VascularSmoothMuscularCells，VSMCs)的异常增殖。因此，改善IR，逆转或抑制VSMCs增殖是防治血管增殖性疾病的重要措施。哺乳类雷帕霉素靶蛋白

2、(MammalianTargetOfRapamycin，roTOR)为胰岛素(Insulin，Ins)信号通路中的重要分子，参与基因转录、蛋白质起始翻译、核糖体生物合成及细胞增殖等多种生物学效应，是细胞生长过程中极为重要的靶标。研究表明，血管增殖性疾病、代谢综合症等诸多疾病的发生发展均与mTOR的表达及功能改变有关。常用的抗排斥药物雷帕霉素(Rapamycin，‘RAP)为mTOR特异性抑制剂，能够抑制VSMCs增殖，提示mTOR可能成为防治血管增殖性病变的重要靶标。然而，RAP主要用于抗移植排异，不

3、良反应较多，限制全身性应用。中药资源丰富，基于mTOR筛选抑制抗增殖的中药有效成分的研究，国内外少见。．因此，以mTOR为靶标改善IR所致血管病变的药物研发具有广阔前景。小豆蔻明(Cardamonin，Car)为豆蔻属植物中的查尔酮类单体，化学结构为2，4．双羟基．6’甲氧基查尔酮。研究显示，Car具有心血管保护作用，能明显舒张血管。目前，Car在IR状态下对VSMCs增殖影响的研究国内外少有报道。本研究以高糖高胰岛素模拟lR状态培养人脐动脉平滑肌细胞(HumanUmbilicalArterySmoo

4、thMuscleCells，HUASMCs)，探讨Car对高糖高胰岛素诱导HUASMCs增殖的影响，通过检测mTOR及其结合蛋白Raptor、Rictor的mRNA表达，深入探讨Car抑制细胞增殖的作用机制，同时考察Car免疫抑制活性，为寻找改善IR、治疗血管增殖性病变的药物提供实验基础。【方法11．细胞培养采用组织贴块法培养原代HUASMCs，传代细胞分别用含10％小牛缸清的矿常RPMI1640培养基和高糖高胰岛素模拟IR培养基(含2．5mol·L1葡萄糖和100U·L。胰岛素的RPMI1640培养

5、基)在37。C、5％C02饱和湿度培养箱中培养。采用密度梯度离心法分离健康人外周

6、fJI淋巴细胞。淋巴细胞用含lO％4、牛衄清的ir常RPMI1640培养基，在370(2、5％CO：饱和湿度培养箱一}J培养。2．分组‘j给药HUASMCs按小常培养和模拟IR培≥i后，分别i殳细胞对!l!{ffli、PD98059(3x10。福建中医学院硕十学位论文t001．L1)组、PD98059+LY294002(10～tool-L-1)组、PD98059+LY294002+PA(104m01．L-I)组、RAP(

7、10～m01．L-1)组及Car(10一m01．L-1、10～t001．L-1、10一mol·L-1、10jt001．L1、10一t001．L．1)组。人淋巴细胞按正常培养及PHA(5mg·L．1)刺激培养后，设细胞对照组、PHA组、阳性药物RAP及CsA(10～m01．L-1、10～t001．L1)对照组、Car(10一mol·L-1、3x10～mol·L-1、10一t001．L-1、3xlO—t001．L-1、10～t001．L-1、3xlO～tool·L1、10～tool·L．1)组。3．测定指

8、标‘经不同试药处理3d，用不含细胞的培养基空白孑L调零，MTr法(九=490rim)测定HUASMCs增殖。采用ELISA法测定人淋巴细胞分泌的IL-2水平。利用Trizol试剂，一步法提取HUASMCs总RNA，经Real．timePCR扩增mTOR、Raptor和Rictor，以8-actin作内参，采用Livak法计算mRNA表达量。【结果】1．高糖高胰岛素培养基较正常培养基明显促进HUASMCs的增殖(O．545±0．028灌0．422±0．047，P<0．01)。对于正常及模拟IR培养的HU

9、ASMCs，10一tool·L1、10。7tool·L-1、10～t001．L．1Car对细胞增殖无影响，高剂量Car(10专tool·L-1、104tool·L-1)抑制细胞增殖(P<0．01)。PD98059抑制HUASMCs增殖，RAP及Car(104tool·L1)能加强该作用(P<0．05，P<0．01)。同时加入PD98059及LY294002，并进一步采用PA诱导HUASMCs增殖，该作用可被RAP及高低剂量Car(10～tool·L-1、