PCR技术在食品安全检测上的应用

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1、PCR技术在食品安全检测上的应用陈倩仪（广东第二师范学院生物系，广东广州510310）摘要：介绍聚合酶链式反应（PCR）技术的原理、特点及其在食品微生物检测、转基因食品检验等食品工程领域的应用情况。关键词：PCR技术；检测；微生物；成分；转基因食品PCR（PolymeraseChainReaction），聚合酶链式反应，由美国PE—Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis，在1985年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法[1]，又称为多聚酶链反应、无细胞克隆技术等[2]。PCR技术主要由高温变性、低温退火和适温延伸3个步骤反复循环而完成，

2、是一个在特异耐热酶——TaqDNA聚合酶的催化下完成的反应[2]。PCR技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。通过PCR技术可在数小时内将一分子的DNA成百万倍甚至上亿倍的复制，因而该技术在食品安全检测中具有很大的应用潜力[3,4]。本文将重点介绍PCR技术的基本原理，及PCR技术在食品微生物检测、转基因食品检验等食品安全检测领域的应用情况。1PCR技术的基本原理PCR技术的反应原理与生物细胞内的DNA复制相似，但其反应体系更为简单。PCR是以需要扩增的目的DNA双链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸引物介导，通过DNA聚合酶进行酶促反应

3、，快速扩增特异DNA序列[5]。基本的过程[6]为:以需扩增的DNA分子为模板，先高温变性，将混合物加热到94℃维持l5～30s，使模板DNA双链解旋成单链，然后逐渐降温退火，温度降到55℃，使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合，最后在引物、DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。如此循环20次，原始DNA将扩增约106倍。对于不同的扩增对象，如扩增DNA片断序列全知、半知或未知，相应的PCR参数、退火温度、时间、引物等都有较大的差别。将RFLP、Sequence、反转录PCR等技术与PCR技术相结合，就形成了众多的衍生技术

4、，如：多重PCR、定量PCR、竞争PCR单链构型多态性PCR、巢式PCR等[7]。这些技术的产生使PCR在食品安全检测方面的应用潜力更加广泛。一般PCR技术检测的主要步骤[8]为：①运用化学手段对目标DNA提取；②设计并合成引物；③进行PCR扩增；④克隆并筛选鉴定PCR产物；⑤DNA序列分析。2PCR技术检测食品中微生物的应用2.1利用PCR快速检测奶粉中阪崎肠杆菌阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)是一种可寄生在动物肠道的食源性致病菌，相对于成人，新生儿更容易感染阪崎肠杆菌。该菌能引起新生儿脑膜炎、小肠结肠炎以及菌血症，甚至引起神经功能紊乱，死亡

5、率高，并伴有严重的后-6-遗症，因此在世界范围内受广泛的关注。在对新生儿感染阪崎肠杆菌事件的调查中可以发现婴儿奶粉是主要的感染渠道[9]，所以对婴儿奶粉中阪崎肠杆菌的检测十分重要。但国内外传统的检测方法都存在时间长、检测结果假阳性等突出问题。针对上述问题，陈珊珊[9]利用FTA滤膜与PCR技术相结合的方法建立了一套从婴儿配方奶粉中快速检测阪崎肠杆菌的方法，缩短了检测的时间，并提高了灵敏度，达到了7×101cfu/mL。而且此法可高效从样品中提取阪崎肠杆菌DNA，可有效消除PCR反应的抑制因子。研究中采用FTA滤膜制备模板，利用PCR技术检测配方奶粉中的阪崎肠杆菌，以确

6、定检出限。结果表明：经过4h增菌后婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的检出限为7cfu/100g。可在6h内完成对婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的检测，比传统检测方法缩短了12～22h。叶应旺[10]等人针对时间长、检测结果假阳性的问题建立了阪崎肠杆菌快速检测法。研究根据阪崎肠杆菌中寡-1,6-葡萄糖苷酶基因设计引物建立PCR方法，并进行PCR反应的灵敏度、特异性实验以及模拟实际样品的最低检出限测定。结果为：纯菌检测灵敏度达102cfu/mL，阪崎肠杆菌菌株PCR扩增均为阳性，阴性对照菌株未扩增出特异性条带；单独接种阪崎肠杆菌和混合接种大肠杆菌（Escherichiacoli）或沙门

7、氏菌（Salmonella）的人工模拟污染奶粉样品中分别在增菌26h和28h时，阪崎肠杆菌均可以检出。1.1利用PCR技术检测肉中食源性病原茵食源性疾病是通过摄食而进入人体的有毒有害物质所造成的疾病。近年来，食源性病原菌污染食品引起的食源性疾病逐年呈上升趋势，引起了人们的广泛关注。快速准确灵敏检测肉中食源性病原菌是保障肉类安全，防止食源性疾病爆发的重要手段。1.1.1利用PCR技术检测肉中的大肠杆菌肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhageE.Coli）O157:H7是引发食物中毒的重要病原菌。据证实，编码O157:H7特异性O抗原的rfbE