荧光定量pcr技术在临床检测中的应用

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1、荧光定量PCR技术在临床检测中的应用中山大学中山医学院生物化学教研室达安基因股份有限公司首席科学家朱振宇医学博士、教授、博士生导师Tel：13922430138，020－37656430九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开1998年荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测PCR发展简史PCR(PolymeraseChainReaction)1983Cetus公司的KaryMullis于12月16日第一次成功实验发明了PCR1985关于PCR的文章首次由KaryMullis及其同事等人在《Science》上发表198912月《Science》杂志将PCR和它所使用的

2、TaqDNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。1993KaryMullis，NobelPrizeinChemistry1995PerkinElmer公司研制出荧光定量PCR技术循环次数DNA的链数121222243238102101024202201,048,576302301,073,741,82410亿PCR循环次数与DNA产量关系PCR循环PCR特点：高效扩增、忠实复制灵敏度高快捷简便对样品纯度要求低可以相对定量PCR反应的特点Ct值的意义Ct值与重复性同一样本在相同条件下同时进行96次扩增FQ-PCRCt值与浓度不同的模板达到荧光域值时的Ct值不同感染性疾病的诊断

3、母婴传播的控制与观察遗传疾病的诊断肿瘤的诊断法医学鉴定荧光定量PCR的临床应用早期诊断病情评估和预后判断抗病毒药物疗效的观察、指导新药验证一感染性疾病1.病原体含量与病情之间的关系2.病原体含量与用药之间的关系3.药物及疗法的研究与开发4.新的病原体分子诊断标准5.新的愈后指标6.传染病发病的监控、预测与预防临床应用临床应用二肿瘤1.肿瘤标志物：癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等2.肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因三遗传病1.等位基因检测2.多基因遗传病的突变检测3.基因表达异常所致遗传病检测荧光定量PCR在病原体检测中

4、的应用一肝炎病毒定量检测二性病病原体检测三结核杆菌及呼吸道病原体检测四优生优育(TORCH)相关项目检测临床应用肝炎病毒定量检测HBVHCV临床应用（一）乙型肝炎病毒结构及特点HBsAg：是HBV感染的主要标志HBsAb：保护性抗体HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，一般不存在于血循环中HBcAb:非保护性抗体，HBcAb-IgM提示HBV处于复制状态HBeAg：HBV复制及强感染性的指标HBeAb：有一定的保护作用，预后良好HBVHBV（二）HBV-DNA与“两对半”1.“两对半”：机体的免疫反应状态；2.“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能反应体内病毒

5、复制水平与感染程度。FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质—DNA，是病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。3.血清学指标(－)不能排除HBV感染。HBV（二）HBV-DNA与“两对半”HBsAg(－)HBV-DNA(＋)HBeAg(－)HBV-DNA(＋)4.也可能出现HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。5.HBsAb(＋)、HBcAb(＋)、HBeAb(＋)三抗体阳性与HBVDNA2.5×103copy/ml结果解释。HBV(三)HBV-DNA定量检测的临床意义3.HBV-DNA定量与预后a.含量高者急性肝炎患者易慢性化b.癌变的几率明显高于含量低者1.HB

6、V-DNA定量与HBV复制水平及传染性2.HBV-DNA定量与乙肝药物疗效a.专家提出<103copy/ml做为阴性或临床治愈标准b.HBV-DNA定量分析与干扰素治疗(前、中、后)c.拉咪呋啶HBV感染与干扰素治疗治疗前：a:治疗前HBV低水平复制者对干扰素的反应性明显优于高水平复制者。b:治疗前HBVDNA含量特别高者大多没有疗效。c:HBsAg转阴的几乎都是那些治疗前血清HBVDNA含量较低者。HBV感染与干扰素治疗治疗中：a:病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。b:相反，治疗期间HBVDNA复制水平下降较慢，或下降幅度较小，或者变化不明显者，大多是干扰素治疗无效。

7、HBV感染与干扰素治疗治疗后：a:治疗结束后，采用PCR定量法检测，HBVDNA<103copy/ml者，可能不再复发。b:终止治疗后HBVDNA仍保持较低水平者，反跳的可能性较大。ALTMonthsafterStartofTherapy0NormalAlt治疗前1234561224HBVDNAHBeAgHBsAgPoorResponsetoIFNTherapyCHRONICHEPATITISB拉咪呋啶：有显著降低高病毒载量作用，近期疗效颇有优势，但是长期使用可导致HBV变异，患者易出现耐受性，而且容易出现停药后反弹。HBV感染与拉咪呋啶