pcr技术及其在hpv检测中的应用

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1、PCR技术应用进展及存在问题卫生部临床检验中心李金明PCR?PCR只是一个简单的不起眼玩艺——凯利·穆利斯（KaryMullis)PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。…它最大的特点就是能不断推出新形式。——摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow]KaryMullis什么是PCR?我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。……它的发明并没有改变基因操作的本质

2、。有了PCR，我们能在更广的范围内更快、更容易地进行基因操作，学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不过是一种新工具。——凯利·穆利斯（KaryMullis)“…真正惊人的是PCR完全不是为解决某一个难题而设计的,该技术成熟之后,它所能解决的难题才开始涌现…”史蒂文·沙夫PCR技术的特点：高特异性引物的特异性。引物延伸时，碱基配对的正确性。TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性。靶基因的特异性与保守性。选择扩增特异性和保守性高的靶基因区域，扩增产物的特异性程度就更高。作为临床测定的PCR方法，还有

3、一个影响特异性的决定性因素是寡核苷酸杂交探针。PCR技术的特点：高灵敏度从理论上，其能在2~3小时内，将1个分子靶DNA，扩增至10亿个分子。而就特定的扩增反应来说，从理论上，只要反应管中有1个分子，就能将其扩增至能检出的水平。如将一些干扰因素考虑在内，一个反应体系中，如有2~3个以上的靶分子，即可成功的通过PCR扩增，将其检测出来。PCR技术的特点：简便快速整个PCR的扩增在一个小小的离心管中完成，过程也只是简单的温度变化，耐高温的TaqDNA聚合酶的应用，避免了DNA聚合酶的反复加入。整个扩增反应可在2～4

4、小时完成。特定的低纯度标本也可使用某些靶基因含量高的标本，如人的组织、细胞、毛发、血液、培养后的细菌和病毒等病原体等，DNA粗制品及总RNA即可作为扩增模板，但在具体的扩增时，可对标本进行适当的稀释，在不影响靶基因模板的扩增浓度下，降低标本中PCR抑制物的浓度，以利于靶基因的扩增。PCR技术的应用病原体核酸的检测：定量（抗病毒药物治疗疗效监测）；定性（耐药突变、基因分型、血液筛查等）。遗传病肿瘤个体鉴定其他（SNP及涉及核酸的科研等）在感染性疾病病原体检测中的应用病毒的检测定量(感染状况判断、抗病毒药物治疗疗效

5、监测）定性(耐药突变、基因分型、血液筛查等）细菌及其它微生物的检测难培养菌耐药基因寄生虫的检测在遗传病及其它基因相关疾病诊断中的应用α地贫β地贫血友病药物性耳聋地中海贫血地中海贫血是一种常染色体遗传性溶血性贫血,是世界上最常见和发生率最高中的一种单基因遗传病。地中海贫血是由于珠蛋白肽链合成障碍所致，出现一种或几种珠蛋白肽链数量不足或完全缺乏，从而造成这种珠蛋白链参与的血红蛋白合成量的减少。各珠蛋白链本身的氨基酸顺序并无异常。其中α珠蛋白链合成受抑者，叫做“α地中海贫血”；β珠蛋白链合成受抑者，叫做“β地中海贫血

6、”。α地中海贫血α地贫的发生是由于α珠蛋白链基因突变的结果，α珠蛋白基因定位于第16染色体短臂，每条染色体上均有两个α珠蛋白基因，该基因总长30Kb，共包含七个连锁的α类基因或假基因。在α-基因的突变中，以缺失型突变最为常见。α-基因的另一突变即为点突变，目前已发现的突变有18种以上，它包括错义突变、无意突变、剪接部位突变及起始信号突变。α地贫的产前诊断目前一般采用PCR-探针杂交或限制性长度多态性（RFLP）方法进行。β地中海贫血β地中海贫血（简称β地贫）:β地贫由β珠蛋白链基因突变所引起，该基因定位于第11

7、染色体短臂，总长度约60Kb，其中有许多胚胎性基因及假基因，而β珠蛋白基因有两个内含子和3个外显子，总长约为1.126Kb.β-基因的突变以点突变为主，亦有碱基的插入和缺失。目前在世界范围内发现的点突变达160余种，其中在中国发现的有21种。β地贫的产前诊断目前一般采用PCR-探针杂交或限制性长度多态性（RFLP）或等位基因特异的PCR方法进行。血友病血友病是一种X连锁隐性遗传病，分为血友病甲和血友病乙，几乎全部发生在男性身上。血友病甲是由于凝血因子Ⅷ的缺乏所致，而血友病乙则是因为缺乏凝血因子Ⅸ。控制产生凝血因

8、子Ⅷ和Ⅸ的基因位于X性染色体上。母亲为血友病基因携带者时致病基因遗传每个儿子患血友病及每个女儿为致病基因携带者的机会均为50%父亲为血友病患者时的致病基因遗传所有儿子都正常，所有女儿都是携带者父亲为血友病患者母亲为携带者时的致病基因遗传每个儿子和女儿患血友病及每个女儿为致病基因携带者的机会均为50%，儿子有一半正常血友病的分子诊断大多数血友病突变的大量变异和近代起源使遗传筛选过程错综复