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1、实时焚光定量PCR检测HPV-DNA在宫颈癌筛查中应用宿志瑞陕丙阳光生物工程股份有限公司邮编：710119【摘要】目的：评价实时荧光定量PCR检测HPV-DNA在宫颈癌筛查中应用价值。方法：2015年1月〜2015年12月，对我中心经病理组织学诊断宫颈疾病女性500例开展实时荧光定量PCR检测HPV-DNA水平。结果：y(Ct)=-3.3236lgx+34.713，R2=0.9986，批内、批间、tl间重复性检测CV均在合格范围内；不同病理类型HR-HPV阳性率差异具有统计学意义(=56.416,P<0.05)；不同类型HR-
2、HPV阳性者拷贝数分布差异无统计学意义(μ=11.495,P=0.063〉0.05)。结论：实时荧光定量PCR检测HPV-DNA可作为宫颈癌筛查方法，筛查早期CIN病变。【关键词】宫颈癌•,HPV-DNA；PCR；实时荧光定量持续高危人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染是宫颈癌关键发病因素，检测HPV感染是宫颈癌筛查必要内容之一，有助于筛查HPV感染与可以逆转的宫颈上皮内瘤病变(CIN)，及早开展干预预防宫颈癌［lhHPV临床检验主要包括细胞学法、斑点印迹法、荧光原位杂交法、多聚合酶链反应(PCR)法，这些方法各有优劣，PC
3、R法特异性强、灵敏度高、操作简单，对原始材料质量要求低，被认为是检测HPV-DNA的最好方法，WHO推荐其作为宫颈癌筛查［2］。实时荧光定量PCR法克实施监测PCR整个反应过程，定量检测范围大，备受卫生机构欢迎。木次研究试评价实时荧光定量PCR检测HPV-DNA在宫颈癌筛查中应用价值。1材料与方法1.1研究对象以2015年1月〜2015年12月，我中心经病理组织学诊断宫颈疾病女性500例作为研究对象，年龄20〜57岁，平均(41±5)岁。均有性生活时，无宫颈瘤治疗史、手术史。1.2仪器与试剂0.9%生理盐水，16
4、、18、31、33、45、52、56、58型HR-HPV核酸定量检测试剂盒，HR-HPV阳性定量参考品，HR-HPV阴性质控品，DNA提取液，HR-HPVPCR反应液等。ABI实吋荧光PCR仪，生物安全柜，高速离心机，恒温器等。1.3方法以棉球沾取无菌生理羊水拭去宫颈外分泌物，以宫颈帅插入宫颈内，5s后旋转采集宫颈分泌物，置入无菌管中，密封送检。取阴性质控品、临界阳性质控品，8000rpm离心5s,吸50μl〜0.5ml入火菌离心管中，加入50μIDNA提取液，100°C(10±l)min,12000
5、rpm离心5min，处理质控品备用。取阳性标准品，8000rpm离心5s，备用。进行PCR扩增，取相应量PCR反皮液与Taq酶,混匀后43μl/管分装至0.2ml离心管，加入处理后样品上清液2μl或阳性定量査考品2μl,8000rpm离心5s,放入PCR仪样品槽。常规方法建立校正曲线，并进行批内重复性、日间重复性精密度检测，确认质控水平，合格后开始检测标本中的HR-HRPDNA水平。以浓度分别为104、105、106、107copies/ml为阳性定量参考品检测限度，进行荧光定量PCR,据构建的校正曲线，通过
6、检测标本Ct值，计算拷W指数。病理检查终诊参照2001年国际癌症协会(NCI)推荐TBS分类标准。1.4统计学处理收集数据建立WPSxls数据表，以SPSS18.0软件进行数学统计，计量资料以均数±标准差(±s)表示，计数资料以数(n)或率(％)表示，比较采用检验，等级资料比较采用秩和检验，以P<0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1组织病理学500名对象，其中慢性宫颈炎214例、CINI级101例、CINII级94例、CINIII级91例。以Ct值为因变量y,起始拷W数为自变量X，校正公式为
7、y(Ct)=-3.3236lgx+34.713,R2=0.9986,呈现高度相关性。批内重复性检测，结果显示低拷贝检测限0.93×104〜1.10×104copies/ml，(1.02±0.058)×104copies/ml,变异系数5.7%,高拷贝检测限0.91×107〜1.06×107copies/ml,(1.01±0.055)×107copies/ml,变异系数(CV)5.5%。CV<10%提示精密度较好。日间重复性检测C
8、V在5.5%〜12.0%之间，精密度较好。2.2HR-HPV感染情况不同病理类型HR-HPV阳性率差异具有统计学意义(=56.416,P<0.05)。不同类型HR-HPV阳性者拷W数分布差异无统计学意义(μ=11.495,P=0.063>0.05)o见表1。3讨论建立的
