实时荧光定量pcr在检测流感病毒中的应用

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1、实时荧光定量PCR在检测流感病毒中的应用龚靖丹义乌国际旅行卫生保健中心322000摘要：目的：探讨荧光定量PCR的检测流感病毒中的应用。方法：采用实时荧光定量PCR法对60份经胶体金快速检测法筛查检测的标木进行检测，进行统计分析，评估不同方法灵敏度和特异性差异。结果：实时荧光定量PCR法和胶体金快速检测法的阳性率分别为78.33%和58.33%,胶体金快速检测法较于实时荧光定量PCR的灵敏度和特异性分别为74.47%和53.85%。结论：实时荧光定量PCR检测技术可作为流感防控的病原快速检测技术。关键词：流感病毒；胶体金快速检测；实时荧光RT-PCR流行性感冒病毒(Influen

2、zavirus)是正黏病毒科的代表种，简称流感病毒，是单负链分节段的RNA病毒，易引起人群的上呼吸道感染。人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒的病原体。病毒的表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)易发生变异，是导致其引起世界大流行的原因。甲型流感病毒可感染多种动物，也是人类感染的主要病原。甲型流感病毒根据其H和N抗原的不同，又可分为多个亚型。其中H抗原有15个亚型，N抗原有8个亚型。人类容易感染和传播的主要有H1N1、H2N2、H3N2这三种亚型。流感病毒的临床症状容易和普通感冒相混淆，传统的实验室确诊方法耗时L<而.k技术要求高，无法及时对暴发疫情做

3、出诊断。实时焚光定量PCR(Real-TimeQuantitativePCR)技术，利用PCR对核酸的高度扩增，探针技术的高特异性的特点，实现了PCR从定性到定量的飞跃，不仅克服了常规PCR检测易污染与假阳性率高的缺点，而且具有特异性强、灵敏度高和自动化操作等优点，利用RT-PCR方法可快速检测流感病毒。1材料与方法1.1标木采集自义乌机场出入境发热旅客60例。1.2设备与试剂荧光定量PCR仪ABI7500,全自动核酸提取仪ABImagMAX,生物安全柜上海力康，高速冷冻离心机为德国SigmaRT-PCR试剂盒购自上海之江生物科技股份有限公司，RNA提取试剂盒为ABI公司生产，流

4、感胶体金快速检测试剂由浙江省出入境检验检疫局提供。1.3病毒RNA的提取按照试剂盒说明书将每个反位按3μICarrierRNA和232μILysis/BindingSolutionConcentrate比例制成混合液，加入到Bead管，再加175μl样本，振荡击打Bead15分钟后，16000×g离心3分钟，将Beads聚集在一起。将前处理过的样本和试剂加入8联管中，A孔加入100%异丙醇65μl磁珠混合液20μl样本裂解物115μl,B孔加入洗液I150μl,C孔加入洗液I150μl，D孔加入洗液II150μl，

5、E孔加入洗液II150μl，F孔加入洗脱液90μl,将反应管放入全自动核酸提取仪中进行核酸提取。1.4试剂的配制取n×8μIIFVA&IFVB核酸荧光PCR混合液，n×lμl内部对照品，与n×lμIR-PCR酶(n为反应管数)，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。取上述混合液20μl置于PCR管中，然后将样品核酸提取液、DEPC-H2O、阳性对照品各5μl分别加入PCR管中，盖好管盖，立即进行PCR扩增。1.5病毒的扩增反应管至于定量荧光PCR仪上，按照试剂盒推荐循环参数设置：45°C&tim

6、es;10min；95°C×15min；再按95°C×15sec→60°C×60sec,循环45次;单点焚光检测在60°C，反应体系为25μl。焚光通道检测选择：选用FAM、HEX(或VIC/」OE)和ROX通道。1.6胶体金快速检测法按照试剂盒说明操作。2结果在60份样品中，实吋荧光PCR法检测出阳性样本47份，其中35份经胶体金快速检测法检测为流感阳性，同吋在13份实吋荧光PCR法检测为阴性样本中检出7份流感阳性样本，两者符合率为70%[(35+7/60)]，胶体金快速检测法检测灵敏度是实吋荧光PCR法的74.47%(35/

7、47),胶体金快速检测法特异性为实吋荧光PCR的53.85%(7/13)。经统计学检验，P<0.005,表明两者差异显著，具有统计学意义。2.1特异性只有当探针与待测模板匹配吋Taq酶才会启动苏5-3′端的外切酶活性，讲探针上的荧光基团切割下来而产生荧光强度的增长，因此荧光定量PCR技术克服了普通PCR由于非特异性扩增而导致的假阳性问题。双重荧光PCR方法对甲型流感的检测只有相对反应的阳性标本出现阳性扩增反应，乙型流感为阴性反应。说明针对流感优化的双重荧光PCR方法具