实时荧光定量PCR在临床医学中的应用.ppt

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1、实时荧光定量PCR在临床医学中的应用罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案基因诊断病原体测定肿瘤诊断基因差异表达研究主要内容PCR与基因诊断技术4基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病做出诊断的方法。Polymerasechainreaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。1998年，荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知

2、基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。荧光染料：SYBRGreenI、EVAGreen，ResoLight荧光探针：TaqMan、HybridizationProbes、MolecularBeacon6罗氏应用科学部整合细胞组学和基因组学的研究流程LightCycler®Real-TimePCRPlatform超过十年的实时荧光PCR的技术革新LightCycler®1.0Instrument32320SamplenumberDetectionchannelsSamplevolume[µl]LightCycler®2.0Instrument32620/100LightCycler®153

3、6Instrument153620.5–2µl1998200320092005/2008LightCycler®480Instruments(I,II)96/3845/610-100/5-20BreakthroughtohigherThroughputLightCycler®480广泛的应用绝对定量相对定量基于熔解曲线的基因分型终点法基因分型ATAATT基于HRM的突变扫描罗氏应用科学部在临床诊断的整体解决方案基因诊断病原体测定定性分析绝对定量耐药性研究肿瘤诊断基因差异表达研究主要内容荧光定量PCR技术的临床应用10病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因检测性病相关病原体

4、（CT、NG、UU、HPV）的基因检测优生优育项目诊断：人巨细胞病毒（HCMV）、单纯疱疹病毒II型（HSV）、风疹病毒其它病原体检测：结核杆菌、肺炎支原体、EB病毒、伤寒杆菌、幽门螺旋杆菌等HBVDNA检测缩短“窗口期”11PCR检测“窗口期”核酸检测缩短的“窗口期”的天数HBV566-15HCV7041-60HIV2210-15有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断荧光定量PCR方法检测HBV感染的各期12血清标本Copies/mlHBeAg阳性慢性乙型肝炎病人经α干扰素治疗后HBeAg转阴非活动性HBsAg携带者血清原先血中HBVDNA阳性，已痊愈超过12个月的血清乙肝的治疗1

5、3治疗慢性乙肝有确切疗效的抗病毒药物主要有两大类：α干扰素：重组人α-1b干扰素、α-2a、α-2b干扰素等核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦。HBsAg和HBeAg均阳性而HBVDNA阴性？14干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结合。病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBVDNA很少或缺乏。抗病毒治疗中存在的问题——逆转录酶催化中心YMDD变异15YMDD：酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸蛋氨酸（M）突变为异亮氨（I）或纈氨酸（V）形成YIDD变异株或YVDD变异株HBV-YMDD变异检测的临床意义16动

6、态检测：服用拉米夫定3个月开始，每月检测1次提前发现：可在耐药临床表现发生前1-4个月检测出突变株及时调整：适时调整用药方案，防止因耐药而导致病情恶化HRM的应用介绍用12个MIRU–VNTR位点对结核杆菌菌株进行基因分型YuPangetalJournalofMicrobiologicalMethods2011inpress不同MIRU40位点重复标准品的HRM分析结果.R=repeat88个菌株不同MIRU40数量的Tm值的统计流行病学研究小结18荧光定量PCR可以对致病微生物核酸含量进行定量检测弥补免疫检测的缺陷（如HCV）缩短诊断的窗口期（如HIV），利于早期诊断对治疗过程进行疗效

7、监测指导用药过程及剂量，以制定合理的疗效方案结合临床表现，并与传统的免疫学、影像学等诊断方法来综合评判，更为科学。罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案基因诊断病原体测定肿瘤诊断突变检测——个性化用药甲基化基因差异表达主要内容高分辨率熔解曲线定义高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸:它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR仪器与专门的分析算法分辨率高，可以区分一个碱基突变的多组核酸样本，可以区分野生型（纯合子）、