最新实时荧光定量PCR在临床医学中的应用-药学医学精品资料.ppt

《最新实时荧光定量PCR在临床医学中的应用-药学医学精品资料.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、最新实时荧光定量PCR在临床医学中的应用-药学医学精品资料罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案基因诊断病原体测定肿瘤诊断基因差异表达研究主要内容LightCycler®Real-TimePCRPlatform超过十年的实时荧光PCR的技术革新LightCycler®1.0Instrument32320SamplenumberDetectionchannelsSamplevolume[µl]LightCycler®2.0Instrument32620/100LightCycler®1536Instrument153620.5–2µl1998200

2、320092005/2008LightCycler®480Instruments(I,II)96/3845/610-100/5-20BreakthroughtohigherThroughputLightCycler®480广泛的应用绝对定量相对定量基于熔解曲线的基因分型终点法基因分型ATAATT基于HRM的突变扫描罗氏应用科学部在临床诊断的整体解决方案基因诊断病原体测定定性分析绝对定量耐药性研究肿瘤诊断基因差异表达研究主要内容荧光定量PCR技术的临床应用病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因检测性病相关病原体（CT、NG、UU、HPV）的

3、基因检测优生优育项目诊断：人巨细胞病毒（HCMV）、单纯疱疹病毒II型（HSV）、风疹病毒其它病原体检测：结核杆菌、肺炎支原体、EB病毒、伤寒杆菌、幽门螺旋杆菌等10HBVDNA检测缩短“窗口期”PCR检测“窗口期”核酸检测缩短的“窗口期”的天数HBV566-15HCV7041-60HIV2210-15有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断11荧光定量PCR方法检测HBV感染的各期血清标本Copies/mlHBeAg阳性慢性乙型肝炎病人经α干扰素治疗后HBeAg转阴非活动性HBsAg携带者血清原先血中HBVDNA阳性，已痊愈超过12个月的血清12乙

4、肝的治疗治疗慢性乙肝有确切疗效的抗病毒药物主要有两大类：α干扰素：重组人α-1b干扰素、α-2a、α-2b干扰素等核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦。13HBsAg和HBeAg均阳性而HBVDNA阴性？干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结合。病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBVDNA很少或缺乏。14抗病毒治疗中存在的问题——逆转录酶催化中心YMDD变异YMDD：酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸蛋氨酸（M）突变为异亮氨（I）或纈氨酸（V）形成YIDD变异株或YVDD变异

5、株15HBV-YMDD变异检测的临床意义动态检测：服用拉米夫定3个月开始，每月检测1次提前发现：可在耐药临床表现发生前1-4个月检测出突变株及时调整：适时调整用药方案，防止因耐药而导致病情恶化16HRM的应用介绍用12个MIRU–VNTR位点对结核杆菌菌株进行基因分型YuPangetalJournalofMicrobiologicalMethods2011inpress不同MIRU40位点重复标准品的HRM分析结果.R=repeat88个菌株不同MIRU40数量的Tm值的统计流行病学研究小结荧光定量PCR可以对致病微生物核酸含量进行定量检测弥补免疫检测

6、的缺陷（如HCV）缩短诊断的窗口期（如HIV），利于早期诊断对治疗过程进行疗效监测指导用药过程及剂量，以制定合理的疗效方案结合临床表现，并与传统的免疫学、影像学等诊断方法来综合评判，更为科学。18罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案基因诊断病原体测定肿瘤诊断突变检测——个性化用药甲基化基因差异表达主要内容高分辨率熔解曲线定义高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸:它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR仪器与专门的分析算法分辨率高，可以区分一个碱基突变的多组核酸样本，可以区分野生型（纯合子）、突变型（纯合子），杂合子使我们可以不必测

7、序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs,mutations)与其它方法相比，具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低！HRM的应用SNP位点的检测(已知与未知位点)单倍型分析，杂合性丧失的筛查,种群中优势等位基因分析，物种鉴定,DNA遗传作图，潜在易感基因的筛选医学应用：产前诊断，传染病与遗传疾病的监控，药物疗效的观察突变，包括小片段的插入和缺失医学应用：肿瘤的快速诊断,治疗与预后评价甲基化应用医学应用：肿瘤的快速诊断,治疗与预后评价饱和荧光染料创新的饱和荧光染料能够识别单碱基突变,并且不抑制PCR反应不饱和双

8、链DNA荧光染料SYBRGreenI纯合子和杂合子的熔解曲线基本相同饱和双链DNA荧光染料Re