实时荧光定量pcr 在流感病毒核酸检测中的应用

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1、实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用周雪花云南省文山州疾病预防控制中心，云南文山663000[摘要]目的探讨实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用效果。方法选取2009年9月—2013年12月在我州采集的流感样病例咽拭子2489件进行分析，采用实时荧光定量PCR对流感病毒核酸进行检测，观察检测阳性率和阳性样本的类型，以分析流感的流行趋势。结果2009年9月—2013年12月共检出流感病毒核酸阳性676件，检测阳性率为27.16%；其中甲型H1N1病毒472件，占69.82%；季节性甲3亚型病毒126件，占7.54%；季节性甲1型病毒21件，占3.11%；乙型病毒6件，

2、占0.89%；各类型流感病毒发生率之间差异具有统计学意义（P＜0.05）。每年6~9月甲型H1N1病毒流感呈上升趋势，在10~11月达到高峰期；6~9月以季节性甲3亚型病毒为主要流行病株，10~11月甲型H1N1病毒成为主要流行病株。结论实时荧光定量PCR是一种科学有效的检测方法，可对流感病毒核酸进行快速、准确的检测，分析流感病毒的流行规律，有效预防突发公共卫生事件的发生。[.jyqklEppendorf管，加入500ulRLT。②取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）100uL，加入上述Eppendorf管中。③加5uLβ-巯基乙醇，充分混匀。④

3、加600uL70%乙醇，于旋转混合器混匀。⑤从试剂盒中取出带滤膜的离心柱，并标上标本号。⑥将第4步的混合液分两次（每次600uL）吸入于滤柱中，12000rpm离心15s，弃收集管中的离心液。⑦滤柱仍放回收集管上，将第4步的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm离心15s，弃收集管中液体。⑧于滤柱中加入700uLRasterMix12.5uL60℃5min/50℃30min/95℃15min(1个循环)RT-Mix0.25uL95℃15s/55℃30s/(收集荧光)/72℃30sDH2O5.75uL（45个循环）F(5′上游引物使用液)0.5uL72℃5min（1个循环）R(3′下

4、游引物使用液)0.5uLP（寡核苷酸探针使用液）0.5uL③新甲型H1N1(猪甲流-2009)—北京金豪试剂反应体系（按n+2用量配制）及其反应条件。H1N1各反应液2000rpm离心10s50℃30min/95℃3min（1个循环）（FLuA、Sin各反应液分别加逆转录酶0.35uL（5个循环）DNA聚合酶1uL（混匀离心）95℃10s/55℃40s(收集荧光)（45个循环）于提取间，反应体系20uL+模板RNA提取液5uL。进行PCR扩增反应。阳性：Ct值＜35.0，并且呈现S形曲线,阴性：Ct值为0。1.3统计学方法采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验

5、，计量资料采用t检验，用（x±s）表示，P＜0.05说明具有统计学意义。2结果2.1流感病毒核酸检测阳性率2009年9月—2013年12月的2489件流感样病例咽拭子中，共检出流感病毒核酸阳性676件，阳性检出率为27.16%；其中甲型H1N1病毒472件，占69.82%；季节性甲3亚型病毒126件，占7.54%；季节性甲1型病毒21件，占3.11%；乙型病毒6件，占0.89%；各类型流感病毒发生率之间差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果见表1。2.2流感病毒流行特征每年6~9月甲型H1N1病毒流感呈上升趋势，在10月~次年3月达到高峰期；6~9月以季节性甲3亚型病毒为主要流行

6、病株，10月~次年3月甲型H1N1病毒成为主要流行病株。3讨论流感之一种急性呼吸系统疾病，主要由流感病毒引起，临床症状主要表现为高热、酸痛、乏力、呼吸道症状等。流感传染性强、潜伏期短、传播迅速，可分为甲、乙、丙三种类型，其中以甲型流感对人们的威胁最大[3-4]，因而必须加强对流感的检测和防控。流感病毒致病能力较强，而且容易发生变异，而且人们对特异性菌株缺乏必要的免疫力，因而会导致流行暴发。相关研究表明，一场大型流感会导致整个地区的寿命降低[5]，因而必须加强流感的防控，为此我市疾病防控中心采用实时荧光定量PCR对流感病毒核酸进行检测，取得了良好的效果。实时荧光定量PCR检测具有明显

7、的优点，相比于普通的RT-PCR检测来说，其实验周期更短，灵敏度更低，而且不容易造成实验室污染[6]。实时荧光定量PCR检测能够利用PCR对DNA的高效扩增、光谱技术的敏感性和探针技术的特异性，敏感性较高，重复性好，而且更为直观，操作简单，容易操作，采用闭管检测对实验室的污染能够降到最低，因而具有良好的实用性；采用磁珠法进行提取核酸，能够最大限度的结合核酸，而且清洗效率高，能够实现自动化提取，操作方便[7-8]。通过本研究发现，2009年9月—2013年12月共检出流