乳酸菌对受损肠上皮细胞紧密连接蛋白和生物学功能的调控研究

《乳酸菌对受损肠上皮细胞紧密连接蛋白和生物学功能的调控研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、上海交通大学硕士学位论文乳酸菌对受损肠上皮细胞紧密连接蛋白和生物学功能的调控研究姓名：张中伟申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：秦环龙20070401上海交通大学硕士毕业论文上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不

2、保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日-4-上海交通大学硕士毕业论文乳酸菌对受损肠上皮细胞紧密连接蛋白和生物学功能的调控研究摘要目的和意义：阐明肠上皮细胞模型(Caco-2细胞)在侵袭性大肠杆菌（EIEC）感染后的生物学功能改变，包括单层细胞的完整性和通透性、紧密连接（Tightjunction，TJ）蛋白、F-actin的表达变化及乳酸菌对EIEC感染肠上皮细胞紧密连接蛋白生物学功能的调控机制研究;阐明乳酸菌对EIEC对Caco-2细胞相关基因和蛋白表达的调控。研究方法：

3、1、建立单层Caco-2细胞感染模型；单层上皮细胞极性检测（碱性磷酸酶染色）；采用免疫金标记及电镜观察上皮细胞间紧密连接的位置和超微结构。2、实验分组：正常组、感染组、乳酸菌处理组、庆大霉素处理组。用MilliporeERS电阻仪测定单层细胞跨膜电阻值(TER)的变化；用高效液相色谱法（HPLC）测定甘露醇溶液的透过率间接反映单层细胞的通透性；采用细胞免疫组化、免疫荧光、Westernblot方法观察紧密连接（TJ）相关蛋白Claudin-1蛋白，Occludin蛋白,JAM-1蛋白,ZO-1蛋白的分布和超微结构变化；FIT

4、C-phalloidin染色观察细胞骨架F-actin的表达变化；采用基因芯片分析各实验组间基因表达的差异；采用2D电泳分-6-上海交通大学硕士毕业论文析各实验组间蛋白的差异表达，并进行蛋白质质谱分析。所有数据采用均数±标准差表示，P<0.05认为差异有统计学意义，采用SPSS13.0版统计软件进行统计分析。结果：1、碱性磷酸酶染色后发现，肠道上皮样细胞Caco-2呈单层分布，具有明显的极性。免疫胶体金及电镜观察发现，紧密连接结构位于相邻上皮细胞间的顶端，间隙大小约25～38nm。2、EIEC感染Caco-2细胞后，单层细胞

5、的TER值和甘露醇的透过率随时间延长而升高；而经乳酸菌处理后，TER值升高趋缓且甘露醇的透过率降低，处理组、感染组间与正常组比较，P<0.05。3、EIEC感染后，相邻Caco-2细胞间TJ结构遭到破坏，TJ相关蛋白（Claudin-1蛋白，Occludin蛋白,JAM-1蛋白,ZO-1蛋白）的表达亦减少；而乳酸菌处理后可以减轻EIEC引起的TJ结构受损，相关蛋白表达增多。4．EIEC感染后，细胞骨架F-actin遭到破坏，而乳酸菌处理后F-actin的表达明显增多。5、基因芯片分析各实验组间基因表达后发现：与正常组相比，感

6、染组基因表达有差异的共137组，其中94组下调，43组上调；乳酸菌处理组基因表达有差异的共91组，其中39组下调，52组上调；庆大霉素处理组基因表达有差异的共138组，其中38组下调，100组上调；单纯乳酸-7-上海交通大学硕士毕业论文菌处理后，差异表达的基因有15组，其中9组下调，5组上调；进行差异基因分析。6、经2D电泳分析各实验组间蛋白表达后发现:感染组与正常组相比，差异表达的蛋白有30个，其中11个表达减少，19个表达增多；乳酸菌处理组与正常组相比，差异表达的蛋白有25个，其中11个表达减少，14个表达增多；乳酸菌处

7、理组与感染组相比，差异表达的蛋白有15个，其中5个表达减少，10个表达增多；采用MALDI-TOF进行蛋白鉴定分析。结论：EIEC感染后可引起肠道单层上皮的完整性、细胞间紧密连接结构和细胞内骨架的破坏，而乳酸菌黏附于肠上皮样细胞Caco-2后，可以抑制EIEC引起的单层细胞完整性破坏，改善紧密连接的结构变化和相关蛋白的表达分布。应用基因芯片和蛋白质质谱技术初步筛选了与乳酸菌抑制EIEC感染相关的差异表达基因和蛋白，为阐明其作用途径提供新的线索。关键词：乳酸菌；侵袭性大肠杆菌；紧密连接；Claudin-1；Occludin；J

8、AM－1；ZO－1；基因芯片；蛋白质谱-8-上海交通大学硕士毕业论文EFFECTOFLACTOBACILLUSPLANTARUMREGULATINGINTESTINALEPITHELIALTIGHTJUNCTIONANDBARRIERFUNCTIONRESPONSETOPATHOGENIC