《GLP-2调控应激的断奶仔猪肠上皮紧密连接屏障功能的分子机理研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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论文独创性声明ｒ本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。＇尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料一。与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研宄生签名：及＞０年ｆ月爷日关于论文使用授权的声明、ｇ本人完全了解四川农业大学有关保留使用学位论文的规定，卩：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被査阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。［＾本论文不保密。□本论文保密，在解密后适用本授权。＿年“”（请在以上□内划Ｖ）＂ｙＯｆ４研究生签名：年月日导师签名：Ｍｌ年／月４曰 四川农业大学博士学位论文摘要ＧＬＰ－２调控应激的断奶仔猪肠上皮紧密连接屏障功能的分子机理研究（动物营养与饲料科学）（四川农业大学动物营养研宄所，四川成都，６１１１３０）摘要仔猪断奶易受到应激（包括断奶本身）引发肠炎的发生，导致肠道功能紊乱，造成仔猪生长阻滞，。究其原因是由肠上皮屏障通透性增加肠腔内抗原物质、细菌／内毒素入侵粘膜下免疫系统发生免疫反应所致ｉｈｉ，，；而紧密连接（ｔｇｔｊｕｎｃｔｏｎＴＪ）作为构成肠上皮结构屏障的基础其关键ｏｓ－蛋白的表达和结构的改变可能是肠通透性改变的根源。肌球蛋白轻链（ｍｉｎｌｉｈｔｃｈａｉｎＭＬＣｙｇ，）Ｆ－的磷酸化引起细胞ａｃｔｉｎ骨架系统收缩，牵拉细胞引发ＴＪ分子结构的重排，连同ＴＪ蛋白表达量ＴＪ结的降低可能导致构开放，增强肠屏障的通透性。在仔猪断奶后发生肠道适应的时期，内源－２（Ｇ－－水平急剧降低的胰高血糖素样肽ｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ２，ＧＬＰ２），是具有特异性肠营养效应－的肽类激素，但ＧＬＰ２对断奶仔猪肠屏障通透性的调节作用及分子机制尚不明确，。因此本研宄一ＬＰ－２对仔猪断奶应激后生产性能的影响拟通过体内试验考察外源注射Ｇ；在此基础上进步考察－肠屏障功能的变化，并通过体内体外试验明确ＧＬＰ２对ＴＪ蛋白表达及分布的作用；在体外试验４中，拟从蛋白磷酸化修饰、、信号的核转位胞内信号转导以及胞外信号转导等个层面由内而外－地考察可能参与ＧＬＰ２调节肠上皮ＴＪ结构稳定的信号途径－，深入而系统地揭示ＧＬＰ２调控断奶仔猪肠上皮屏障功能的分子作用机制。一ＬＰ－２、Ｇ对断奶仔猪肠道发育和生产性能的影响“”一三元杂交阉公仔猪４试验选取２８日龄断奶、体重接近、健康的杜Ｘ长Ｘ大０头，随机４－－：ＰＳ应ＬＰＳ＋ＬＰＬＰ２分为个处理对照组、Ｌ激组、低剂量Ｇ２组、ＬＰＳ＋高剂量Ｇ组，每个处理１１０个重复，每个重复头猪。各处理每天分别按０、０、２、１０ｎｍｏｌ／ｋｇ剂量皮下注射含２ＬＰ－２１４天ｈＧｌｙＧ２Ｍ４的无菌ＰＢＳ溶液，每天次，连续７天。在第，对照组注射无菌生理盐水，［］其余各组按１００［Ｘｇ／ｋｇ剂量腹腔注射含脂多糖（ＥｓｃＡｅｒ／ｃ／２／ａｃｏ／／ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）的生理－盐水。结果发现：高剂量ＧＬＰ２处理显著提高了十二指肠、、空肠、回肠的重量小肠总重和小肠＜０５）－肠重指数（户．０ＧＬＰ２；剂量依赖地提高了各肠段绒毛高度、绒毛高度与隐窝深度的比值＜０－（ｖｉｌｌｕｈｅｉｈｔ／ｃｒｄｈＣＲ０５ｓｇｙｐｔｅｐｔｒａｔｉｏ，Ｖ）（尸．）；组织学分析结果显示ＧＬＰ２处理保护小肠絨Ｉ 四川农业大学博士学位论文摘要毛免受ＬＰＳ引起的损伤，维持了小肠绒毛的完整性；十二指肠和空肠中碱性磷酸酶（ａｌｋａｌｉｎｅ＊ｈｏｓｈａＫＰ－ｍｌ－ＧＴＬＰ－２ｔａｓｅ，Ａ）、ｌｕｔｒａｎｓｅｔｉｄａｓｅ，）和胰脂肪ｐｐ谷氨酰转肽酶（ｙｇｔａｙｐｐｙ酶的活性随Ｇ＜００５－￣￣？）ＬＰ２０７ｄ７１４ｄ０１４ｄ剂量的增加而显著提高．；Ｇ显著提高了断奶仔猪、、的平均＜－＜日增重和增重／耗料比（Ｐ０．０５），并使高剂量ＧＬＰ２组仔猪的末重显著提高（Ｐ０）。．０５结果－：ＬＰ２表明外源注射Ｇ能促进断奶仔猪小肠发育，缓解肠绒毛应激损伤，增强肠道消化吸收酶活，进而改善断奶仔猪的生产性能。二－、ＧＬＰ２对ＬＰＳ应激的断奶仔猪肠粘膜屏障损伤的作用一一在试验的基础上－Ｓ，进步考察ＧＬＰ２处理对仔猪断奶后ＬＰ免疫应激导致的肠粘膜屏障－－－：高剂量ＧＬＰ２Ｊ关键蛋白ｚｏｎａｏｃｃｕｄｅｎ１（Ｚ１）损伤的保护作用及可能机理提高了Ｔｌ０。结果如下＜和ｏｃｃ．Ｔｌｕｄｉｎ基因和蛋白的表达（Ｐ００５），恢复了Ｊ蛋白在肠上皮细胞间的超微结构分布，显＊Ｄ－－＜著降低了血衆ＬＰＳ浓度、（ｌａｃｔａｔｅ和二（ｄｉａｍｉｎｅｏｘｉｄａｓｅ，ＤＡＯ）（／０．０５），）胺氧化酶活性（Ｐ＜０ＬＰＳ丨Ｌ－ｌＩ－以及十二指肠和空肠粘膜的ＤＡＯ酶活．０５），降低了引起的促炎性细胞因子ｐ、Ｌ６、－－＜ｍＲＮＡ的表达量－ＩＬ８和ＴＮＦａ的血清水平（Ｐ０．０５）和小肠各段中（户＜０．０５）；随着ＧＬＰ２剂－二指肠、空肠和回肠ＭＬＣＫ基因和蛋白量的增加，ＧＬＰ２抑制了ＬＰＳ诱导的十的表达以及Ｔｈｄ８／ＳｅＨ９－的过磷酸化。ＧＬＰ２可通过影响ＴＪ蛋白的表达和分布缓解遭受ＬＰＳ应ｐＭＬＣ结果表明：激的断奶仔猪肠屏障功能的损伤以及肠炎的发生。三－２－Ｊ２、ＧＬＰ对应激的ＩＰＥＣ肠上皮细胞间通透性的调控作用及分子机制研宄一３（）研宄模型的建立（个小试验）ＰＥＣ－Ｊ２ＬＰ－２Ｒ（１）Ｉ细胞系Ｇ的鉴定ＬＰ－２ＲＩＰ－ＪＬＰ－试验通过对Ｇ表达的鉴定，确定选用的仔猪ＥＣ２细胞系能否用于Ｇ２的分子机ｗ－制研宄。分别采用实时荧光定量ＰＣＲ法、ｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和免疫荧光染色技术对ＩＰＥＣＪ２细胞的ＧＬＰ－２Ｒ－－表达和细胞定位进行检测，结果显示：ＩＰＥＣｊ２细胞能表达ＧＬＰ２Ｒ，且定位于细胞膜及胞浆中。（２）ＬＰＳ应激模型的建立５－试验共设个处理，分别研究了０５０、１００、１５〇／ＩＰＥＣＪ２、１０、ｎｇｍＬＬＰＳ对仔猪细胞系单层上皮细胞通透性的影响：ＴＥＲ随着ＬＰＳ应激剂量的增加而显著降低（户＜。结果发现细胞单层＜００．０５）２４ｈ．０ｌ／ｍＬ，后ＨＲＰ漏过率随ＬＰＳ剂量的增加而显著增加（户５），到ＯＯｇｇ剂量时达到＜＜显著水平（尸０．０５），细胞活力显著下降（？０．０５，细胞形态，死细胞，但）发生明显变化增多仍保持了完整的细胞单层结构，１５０／ｍＬ，细胞，边，；然而当剂量达到ｇｇ形态完全受损缘线条残破’。－细胞大量死亡以致单层结构受损：ＬＰＳ引起Ｊ２结果表明ＩＰＥＣ细胞间通透性的增加；本试验确ＬＰＳ－定诱导ＩＰＥＣＪ２细胞间通透性改变的最适应激剂量应为１００ｎｇ／ｍＬ。３－ＬＰＩＰＥＣ－（）ＧＬＰ２对Ｓ应激的Ｊ２细胞单层通透性的缓解作用＿—１Ｑ７６ｘ？ｘ－－，通ｌｌｍｏｌ／ＬＧＬＰ２处理Ｊ２ｈ，００试验共设个处理过添加ｌ〇ｌＯ１ＰＥＣ细胞１再用１ｍＬＰ－－－／，２Ｊ２：２ＨｇｌＳ处理２４ｈ考察ＧＬＰ对ＩＰＥＣ细胞单层通透性的缓解作用。结果发现当ＧＬＰＩＩ 四川农业大学博士学位论文摘要＿８７ｘ剂量达到ｌｌ０和ｌｘｕｒｍ〇ｌ／Ｌ，显著抑制了ＬＰＳ引起的ＴＥＲ值的降低以及ＨＲＰ漏过率的增加Ｐ＜ＬＰＳ组ＬＰ－（００５），，，２．维持了正常的细胞形态减少了细胞的死亡；与相比细胞活力随Ｇ９Ｐ＜〇〇５－２ｘ剂量的增加而显著提高（．），当ＧＬＰ剂量为ｌｌ（Ｔｍｏｌ／Ｌ时，与对照组差异不显著。结■－果表明：ＧＬＰ２可以缓解ＬＰＳ应激增强的仔猪肠上皮细胞单层的通透性，其适宜添加剂量应为－８ｘｍｏｌｌ〇／Ｌ。ｌ二－２－２（）ＧＬＰ对ＬＰＳ应激的ＩＰＥＣＪ细胞ＴＪ蛋白表达及重排的影响及ＭＬＣＫ／ＭＬＣ的介导作ｐ用研宄（２个小试验）－－试验（１）共分３个处理，即对照组、ＬＰＳ组和ＧＬＰ２＋ＬＰＳ组，考察ＧＬＰ２是否通过影响细（２）胞ＴＪ蛋白的表达和超微结构的分布实现在应激条件下对细胞单层通透性的调节。试验使用－ＭＬＣＫ抑制剂ＭＬ－９Ｐ２对１ｈ后ＬＰＳ４５ＬＰＳ和ＧＬ细胞预处理，进行攻毒，考察应激ｍｉｎ后应激是否引起ＭＬＣＫ／ＭＬＣ信号的活化以及２４ｈ后ＴＪ蛋白表达量及超微结构分布的改变，并明确ｐＭＬＣＫ／－２的调控ｐＭＬＣ信号是否在应激起始受到ＧＬＰ，进而缓解ＬＰＳ引起的ＴＪ结构的重排。共－－５ＰＳ组Ｐ２＋ＬＰＳ９＋ＬＰＳ－－＋ＬＰＳ组分个处理：对照、Ｌ、ＧＬ组、ＭＬ组、ＭＬ９＋ＧＬＰ２。结果显示：８ｘ－－＜ｌｌＴｍ〇ＬＰＺＯ和（，（ｌ／ＬＧＬＰ２显著抑制了Ｓ导致的１ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白表达量的下调Ｐ０．０５）以Ｔｈｌ８Ｓ９ｆ／ｅｆ１ＭＬＣＰ＜－及ＭＬＣＫ蛋白表达量和的磷酸化水平的上调（０．０５）添加ＭＬ９ＰＳｐ；单独对Ｌ下调的ＺＯ－１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白表达没有显著影响（Ｐ＞０．０５）ＭＬ－９＋ＧＬＰ－２；促进了ＴＪ蛋白的表达Ｔｈｌ８／Ｓｌ９ｒｅｒ＜－ＭＬ－－－ＭＬＣ（Ｐ０．０５）。ＧＬＰ２、９或ＭＬ９＋ＧＬＰ２均显著抑制了ＬＰＳ对的过憐酸化（尸＜ｐ０＜０）－Ｌ－９＋－．０５），抑制了ＬＰＳ提高的细胞单层对ＨＲＰ的漏过率（Ｐ．０５，ＧＬＰ２ＧＬＰ２；但是和Ｍ－＜０两组的ＨＲＰ漏过率均显著低于ＭＬ９组（户．０５）。免疫荧光染色结果显示ＬＰＳ导致ＴＪ蛋白ＺＯ－－１和ｏｃｃｉｃｌｕｄｉｎＬＰ２处理缓解了ｌｕｄｎ蛋白网状结构消失，胞浆中ｏｃ蛋白的颗粒状分布增加；Ｇ“”ＬＰ－Ｓ导致的ＺＯ１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的定位失调，其免疫荧光呈现完整的铁丝网状结构，胞浆ＭＬ－ＺＯ－ｏｃｃ１ｎ内呈颗粒状的ｌｕｄｉｎ蛋白分布减少：９使和ｏｃｃｌｕｄｉ蛋白在细胞膜上局部呈现网状结－９＋－－构分布，但是仍可见细胞边缘染色的线条断裂ＧＬＰ２处理使细胞间ＺＯ、不完整；ＭＬ１和－ｏｃｃ：Ｄ２ｌｕｄｉｎ蛋白的定位和分布恢复正常ＧＬＰ。结果表明缓解应激后肠上皮细胞间通透性的作用机制与紧密连接结构的稳定密切相关－２。ＧＬＰ对紧密连接的调节涉及：①促进细胞膜上紧密连ＬＰＳ应激ＴＪ接蛋白的表达，；０在应激起始取消引起的ＭＬＣ过磷酸化进而防止蛋白结构的重排；２）ＭＬＣＫ介导的ＭＬＣ磷酸化并不参与紧密连接蛋白表达量的调节。ｐ三－２Ｔ（）ＧＬＰ影响Ｊ屏障功能的信号途径研究一通过以下４个小试验进步考察ＧＬＰ－２调节应激状态下ＴＪ蛋白表达及超微结构分布改变的＇可能信号途径及其相互间的关系。－ｋＢＬＰ－２ＭＬＣ过磷酸化中的（１）ＮＦ的核转位在Ｇ调节作用Ｎ－－２－Ｆ１ｈ后２将ｋＢ的抑制剂ＰＤＴＣ联合ＧＬＰ预处理，进行ＬＰＳ应激，考察ＧＬＰ对ＭＬＣＫＦ－ｋＢ／ｐＭＬＣ进行调节的上游途径是否经Ｎ信号所介导。试验共设５个处理：对照、ＬＰＳＴｈ２３ｒ－２＋ＬＰＳ＋ＧＬＰ－组、ＧＬＰ组、ＰＤＴＣ＋ＬＰＳ组、ＰＤＴＣ２＋ＬＰＳ组。结果发现：ＬＰＳ引起了ｌＫＫａ、ｐＩＩＩ 四川农业大学博士学位论文摘要Ｓｅｒｆ２／３６＜０－ｋＢ．０ｐｌＫＢ的快速磷酸化，导致胞浆中ＩｋＢ含量显著降低（Ｐ５），激活Ｐ６５ＮＦ引起核转位，ＴｈＨＳ／Ｓｅｄ９上调ＭＬＣＫ基因的转录水平（尸＜０．０５）和蛋白的表达量，引起了ｐＭＬＣ的过磷酸化；－ＰＤＴＣ＋ＧＬＰ－２ＳＦ－６５ＮＦ－ＧＬＰ２，、ＰＤＴＣ、处理均抑制ＬＰ引起的ＮｋＢ的活化及ＰｋＢ的核转位下７７１＾８％１９－：ｋＢ调ＭＬＣＫ基因和蛋白的表达，缓解了ｐＭＬＣ的过磷酸化。结果表明ＬＰＳ激活的ＮＦ信号途径作为ＭＬＣＫＭＬＣ的上游靶点受到ＧＬＰ－２的／ｐ抑制。ＯＣＫＭＬＣＦ信号途径在ＧＬＰ－２调节ＭＬＣ磷酸化中的作用（２）胞内Ｒ／通过添加肌球蛋白轻链磷酸酶（ｍｏｓｉｎｌｉｈｔｃｈａｉｎｈｏｓｈａｔａｓｅ，ＭＬＣＰ）抑制剂ＣａｌｃｕｌｉｎＡｙｇｐｐｙ２７６３２－和ＲＯＣＫ抑制剂Ｙ（ＭＬＣＰ的激动剂），考察ＧＬＰ２对ＭＬＣ磷酸化水平的调控是否除作－／ＭＬＣＫ用于ＮＦｋＢ外，还经由对ＭＬＣＰ酶活的调节进行补充。试验共设５个处理：对照、ＬＰＳ－＋＋ＧＬＰ－＋ＬＰＳ－ａ组、ＧＬＰ２ＬＰＳ组、ＣｌｙｃｕｌｉｎＡ２＋ＬＰＳ组、Ｙ２７６３２＋ＧＬＰ２组。结果显示：ＬＰＳ应激１１１１６９６＜０－ＭＹＰＴｌ的磷酸化水平，显著降低ＭＬＣＰ酶活（Ｐ．０５）ＧＬＰ２上调了ＭＬＣＰ结合亚基；添加７１＾９６２７６３２十ＧＬＰ－２缓解Ｓ引起的ＭＹＰＴ或Ｙ了ＬＰｌ的磷酸化，显著提高了ＭＬＣＰ的酶活（Ｐ＜０．０５），／Ｓｗ？９？ｓ１９６ＳＭＬＣ的过磷酸化＋Ｇ－取消了ＬＰ引起的ｐ；然而，ＣａｌｙｃｕｌｉｎＡＬＰ２组ＭＹＰＴ１的磷酸－ＣＰ酶活显著低于ＧＬＰ－２＋ＬＰＳ组化水平高于ＧＬＰ２组，ＭＬ（尸＜０．０５）；Ｃａ丨ｙｃｕｌｉｎＡ部分取消了？８／ＳＣＴ１＾６９６ｌ９ＧＬＰ－２磷酸化的作用效果－２Ｓ下调ｐＭＬＣ。结果表明：ＧＬＰ可抑制ＬＰ刺激的ＭＹＰＴｌ的磷酸化，缓解ＭＬＣＰ酶活的降低，以及ＭＬＣ的过磷酸化。ＭＥＫ－（３）胞内／ＥＲＫ１／２信号途径对ＧＬＰ２调节ＴＪ的作用０－通过添加ＭＥＫ特异性抑制剂Ｕ１２６考察ＭＥＫ／ＥＲＫ１／２信号途径是否参与ＧＬＰ２对紧密连－＋＋＋Ｇ－５：Ｓ组２＋ＬＰＳ接的调节。试验共设个处理对照、ＬＰ、ＧＬＰ２ＬＰＳ组、Ｕ０１２６ＬＰＳ组、Ｕ０１２６ＬＰＴｈｒｔ）ＯＴｒＭ（ｙ２（组。结果显示：ＬＰＳ处理提高了ＥＲＫｌ／２的鱗酸化水平，下调ＨＳＰ７０的蛋白表达，降低Ｔｈｒｔ％－ｌｉ，ＹＰＴｌ了ＺＯ１和ｏｃｃｕｄｎ蛋白的表达并通过上调Ｍ的磷酸化显著降低了ＭＬＣＰ的酶活（户Ｔｈｒ２０２／Ｔ＞Ｔ２０４－＋Ｇ－＜０．０５）；Ｕ０１２６、ＧＬＰ２或Ｕ０１２６ＬＰ２处理均抑制ＥＲＫｌ／２的鱗酸化，但Ｕ０１２６处理１＾９６对ＬＰＳ提高的ＭＹＰＴｌ磷酸化以及降低的ＭＬＣＰ酶活、ＨＳＰ７０和ＴＪ蛋白的表达没有影响；ＴｈｒＷ６－Ｕ０－ＧＬＰ２或１２６＋ＧＬＰ２则抑制了ＬＰＳ引起的ＭＹＰＴｌ磷酸化，使ＭＬＣＰ酶活显著高于ＬＰＳ５ＨＳＰ７０ＺＯ－－－组（戶＜ａ〇），上调了、１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的表达，；Ｕ０１２６、ＧＬＰ２或Ｕ０１２６＋ＧＬＰ２ＴｈＨ８／ＳｅＨ９处理均抑制了ＬＰＳ引起的ＮＦ－ｋＢ信号途径的活化ＭＬＣ的过，ＭＬＣＫ蛋白表达的上调和ｐ－磷酸化：ＬＰＳ２１／２；２）。结果表明应激状态下ｄ）ＧＬＰ独立于ＥＲＫ信号途径促进ＴＪ蛋白的表达－－ＭＬＣ信号途径的活化－ＧＬＰ２通过抑制ＥＲＫ１／２信号途径抑制ＮＦＫＢ／ＭＬＣＫ／３）ＧＬＰ２独立于ｐ；４ＧＬＰ－２ＥＲＫ１／２７０Ｉ／２信号途径实现对ＲＯＣＫ／ＭＬＣＰ的调节；）独立于ＥＲＫ信号途径刺激ＨＳＰ蛋白的表达。ＧＡＭＰ－（４）细胞膜上蛋白偶联受体介导的ｃ／ＰＫＡ信号途径对ＧＬＰ２调节ＴＪ的作用ｋｏ－通过添加ｃＡＭＰ／ＰＫＡ的激活剂Ｆｏｒｓｌｉｎ和抑制剂Ｈ８９，考察ＧＬＰ２Ｒ偶联Ｇ蛋白介导的ＭＰ－ｃＡ／ＰＫＡ信号途径是否将信号从胞外传递至胞内介导ＧＬＰ２对紧密连接的调节。试验共设７－－＋ＬＰＳ＋ＬＰＳ＋ＧＬＰ＋ＬＰＳ＋ＬＰＳ个处理：对照、ＬＰＳ组、ＧＬＰ２组、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ组、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ２组、Ｈ８９ＩＶ 四川农业大学博士学位论文摘要组、Ｈ８９＋ＧＬＰ－２＋ＬＰＳ组。结果发现：ＬＰＳ对细胞ｃＡＭＰ的产生及ＰＫＡ活性没有影响（尸＞０．０５），－而ＧＬＰ－２、ＦｏｋｏＦ＋ＧＬＰ２ＬＰＡＭＰ的尸＜ｒｓｌｉｎ或ｏｒｓｋｏｌｉｎ在Ｓ应激条件下能显著提高细胞ｃ水平（＜＜０．０５），提高ＰＫＡ激酶的活性（户０．０５），缓解ＬＰＳ引起的细胞单层对ＨＲＰ漏过率的增加（尸０．０５）。－ｒｓ－２ＬＰＳＴＧＬＰ２ｌｃｌｉｎＦｏｒｋｏｌｉｎ＋ＧＬＰＪ，提ＳＰ７０、Ｆｏｏ或ｓ均缓解了引起的蛋白表达量的下调高了Ｈ２ＩＫＫ／ＮＦ－ｋＢ／ＭＬＣＫ的表达，，并下调了ＥＲＫＩ／／和ＲＯＣＫ／ＭＬＣＰ信号途径关键激酶的磷酸化维持？８／Ｓ１９ｅｆ了ＭＬＣＰ的酶活和ＭＬＣ的正常磷酸化水平８９Ｈ８９＋ＧＬＰ－２处理对ＬＰＳ应激的细胞ｐ；Ｈ、ＨＧＬＰ－２对相关信号激酶的调控作用Ｓ单层通透性的变化没有影响，８９取消了。结果说明：ＬＰ应ＧＬＰ－２ＧｃＡＭＰＰＫＡＨＴＪ激条件下，激活了蛋白偶联受体介导的／信号旁路，促进了ＳＰ７０和蛋Ｘ－ＭＬＣ的过白的表达，通过抑制ＥＲＫ／２／ＩＫ／ＮＦｋＢ／ＭＬＣＫ信号旁路缓解ＬＰＳ引起的磷酸化，并Ｉ７１＊１６９６通过抑制ＲＯＣＫ介导的ＭＹＰＴ磷酸化提高ＭＬＣＰ的酶活，实现对ＭＬＣ去磷酸化过程的调节。＿＿１ｌ？？－ｌＯｎｍ丨ｋｄＧＬＰ２，这与其促进断奶综上所述，外源注射ｏｇ能改善断奶仔猪的生产性能仔猪小肠发育，增强肠道消化吸收相关的酶活，缓解应激对肠屏障功能损伤以及肠炎的发生有关；－２ＴＺＯ－ＧＬＰＪ１和ｏｃｃｎ对肠屏障功能的保护作用机制与其改善蛋白ｌｕｄｉ的表达和分布有关；对于－２－肠上皮细胞（ＩＰＥＣＪ）间通透性的调节，ＧＬＰ２在应激起始抑制ＭＬＣ的过磷酸化防止细胞间Ｔ－Ｊ结构因为Ｆａｃｔｉｎ骨架收缩而发生重排，并可刺激ＴＪ蛋白的表达，维持ＴＪ结构在胞间的正常一－－ｋＢ，Ｉ２ＫＫ分布与稳定；ＧＬＰ２对ＭＬＣ憐酸化水平的调控方面通过抑制ＥＲＸ／／Ｉ／ＮＦ途径下调一７１＾９６ＭＬＣＫ基因转录和蛋白的表达，缓解ＭＬＣ的过磷酸化，另方面通过抑制ＲＯＣＫ／ＭＹＰＴ磷ＭＬＣ的－Ｔ酸化提高ＭＬＣＰ酶活，增强去磷酸化２Ｊ；ＧＬＰ对以上信号途径的调节以及对蛋白表达的促进作用均由ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径所介导。ＬＰ－２通透性关键词：Ｇ；断奶仔猪；炎症；肠粘膜屏障；紧密连接；信号转导途径Ｖ 四川农业大学博士学位论文Ａｂｓｔｒａｃｔ－ｍａｌＥｆｆｅｃｔｓｏｆＧＬＰ２ｏｎｔｈｅＳｌＩｎｔｅｓｔｉｎａｌＴｉｇｈｔＪｕｎｃｔｉｏｎＢａｒｒｉｅｒ－ｉｎＳｔｒｅｓｓｅｄＷｅａｎｅｄＰｉｌｅｔｓａｎｄｔｈｅＭｅｃｈａｎｉｓｍＳｔｕｄｉｅｓｇＭａｏｒ：ＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＦｅｅｄＳｃｉｅｎｃｅｊＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎＳｉｃｈｕａｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅｎｄｕ６１１１３０Ｓｉｃｈｕａｎ（，ｇｙ，Ｃｈｇ，，Ｃｈｉｎａ）ＡＢＳＴＲＡＣＴＡｆｔｅｒｐｉｇｌｅｔｓｗｅａｎｅｄ，ｖａｒｉｏｕｓｓｔｒｅｓｓ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｗｅａｎｉｎｇｉｔｓｅｌｆ）ｍａｙｃａｕｓｅｅｎｔｅｒｉｔｉｓ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎｎｅｓｎａｓｆｕｎｃｎａｎｄｒｒ．Ｔｍａｒｒａｍａｉｔｔｉｌｄｙｔｉｏｆｕｔｈｅｒｂｌｏｃｋａｇｅｏｆｏｗｔｈｈｅｉｎｅａｓｏｎｆｏｔｈｔｂｅｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｇｙｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｗｈｉｃｈｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｎｔｉｅｎｓａｎｄｂａｃｔｅｒｉａ／ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｇｆｒｏｍｇｕｔｉｎｔｏｓｕｂｍｕｃｏｓａ，ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇａｎｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｔｉｈｔｕｎｃｔｉｏｎ（ＴＪ，ｗｈｉｃｈｓｅｒｖｅｓａｓｔｈｅｂａｓｉｓｇｊ）ｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｂａｒｒｉｅｒ，ｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｒｏｔｅｉｎｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｖａｒｉａｔｉｏｎｍａｙｂｅｔｈｅｐｒｃａｕｓｅｆｒｈｅｃｈａｎｅｏｆ－ｏｏｔｏｔｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｒｉｌＴｈｅｒｉｒｉｕｎｃｉｉｓｎｇｐｍｅａｂｉｔｙ．ｃｏｎｔａｃｔｏｎｏｆｅｔｏｎａｌａｃｔｎｏｍｙｏｉｐｊｆｉｎｕｎｈ－ｉｎＬＣｈｏｒｎｌｒｅａｓｅＴｒｉｎｌａｍｅｔｓｃａｓｅｄｂｙｍｙｏｓｉｌｉｔｃｈａ（Ｍ）ｓｐｈｏｙｌａｔｉｏａｓｗｅｌａｓｄｅｃｄＪｓｏｔｅｇｐ，ｐｅｘｒｅｓｓｎｍａｅａｄｉＴＪｓｒｕｃｕｒｅａｎｄｎｃｅｒｍｅａｂｌｉｏｌｔｏｔｈｅｏｅｎｎｏｆｔｈｅｔｔｅｎｈａｅｔｈｅｉｉｔｏｆｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐ，ｙｐｇｐｙｂａｒｒ－－ｉｅｒ．Ｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２ＧＬＰ２ｗｈｏｓｅｅｎｄｏｅｎｏｕｓｌｅｖｅｌｄｅｃｒｅａｓｅｄａｂｒｕｔｌｆｔｅｒｗｅａｎｉｎｉｓｐｐ（），ｇｐｙａｇ，ａｎｓｅｃｉｒ．Ｈｒｅｅｎｃｒｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｔｉｄｅｈｏｒｍｏｎｅｗｉｔｈｐｉｆｃｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｏｐｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｗｅｖｅｉｔｈａｓｎｏｔｂｌｅａｔｈａｔｐ，ｗｈｅｈｅ－ｔｒＧＬＰ２ｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｒｒｉｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｉｎｗｅａｎｅｄｉｇｌｅｔｓａｎｄｉｔｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｍｅＴｒｓｕｄ－ｃｈａｎｉｎＬＰ２ｉｎｖｉｖｏｉｎｖｅｓｉｓｍ．ｈｅｒｅｆｏｅｉｎｔｈｉｓｔｅｃｔｅｄｅｘｏｅｎｏｕｓＧｔｏｔｉａｔｅｉｔｓｅｆｆｅｃｔｓｏｎ，ｙ，ｊｇｇｇｒｏｗｔｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｉｎｗｅａｎｅｄｐｉｇｌｅｔｓａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｒｒｉｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓｔａｔｅｗａｓ－ｃａｒｒｕ．ＴＧＬＰｉｓｒｉＴＪｗｒｈｉｎｉｅｄｏｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆ２ｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｏｎａｎｄｄｉｔｉｂｕｔｏｎｏｆａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｔｈｏｕｇｖｉｖｏａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｅｘｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｉｎｖｉｔｒｏｔｈｅｏｓｓｉｂｌｅｓｉｎａｌｉｎａｔｈｗａｓｆｒｏｍｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐ，ｐｇｇｐｙ，，ｉｈｏｈｏｉｗｈｉｌｌｓｉｎａｌｉｎｎｕｃｌｅａｒｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｔｏｒｏｔｅｎｓｒｌａｏｎｉｃｈｗｅｒｅｏｓｓｂｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｉｎｔｅｓｉｎａＴＪｇｇｔｔ，ｔ，ｐｐｐｙｐｙｔｗＧＬＰ－２ｓａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｔｏｒｅｖｅａｌｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｒｅｕｌａｔｉｏｎｉｎｉｎｅｓｔｉｎａｌｔｈｅｔ，ｇｅｉｓｌｌｉｈｅｌａｌｂａｒｒｉｅｒｉｎｗｅａｎｅｄｉｌｅｔｓｓｔｅｍａｔｉｃａ．ｐｔｐｇｙｙ１Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆ－ｉＧＬＰ２ｏｎｉｎｔｅｓｔｎａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｇｒｏｗｔｈｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｉｎｗｅａｎｅｄｉｌｅｔｓｐｐｇＦｏｒｈｅａｌｈＤＬＹｉｌｅｓｗｅａｎｅｄａｔｈｅａｅｏｆ２８ｄｗｉｈａｎｓｉｍｉｌａｒＢＷｗｅｒｅａｉｏｆｏｕｒｔｙｔｙｐｇｔｔｇｔｓｓｇｎｅｄｔ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｎｏｎ－ｒＬＰｃｈａｅｎＬＰＳ＋ｗＬＰ－２ＬＰ：ｉｃｈａｌｌｅｎｅｄｃｏｎｔｏｌｉｉＳｌｌｅｄｃｏｎｔｒｏｌｉｉｉｌｏＧａｎｄｉｖＳ（；（）；（（））ｇｇ）；ｈ－－＋ｈｉ．ｉｌ．ｉｅｃｅｄｗｉｈＰｌｉｈｈＧｌ００ＧＬＰ２Ｐｅｔｓｗｅｒｅｓ．ｃｎｔｔＢＳｓｕｅｍｅｎｔｅｄｗｔ［２ＧＬＰ２＿ａｄｏｓｅｓｏｆｇｇｊｐｐｙ］ｉ３４ｔ，，２ａｎｄ１０ｎｍｏｌ／ｋｇＢＷｐｅｒｄａｙｆｏｒｓｅｖｅｎｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅｄａｙｓ．Ｐｉｇｌｅｔｓｗｅｒｅｃｈａｌｌｅｎｅｄｗｉｔｈｉ．ｐ．ｇａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅＬＰＳａａｄｏｓｅｏｆ１００ａ／ｋｏｎｄ１４ｏｉｎｄｕｃｅ（）ｔ（ｇｇｔ－ｍｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｄａｍａｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓａｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ＨｉｈＧＬＰ２ｔｒｅａｔｅｎｔｓｉｉｃａｎｔｌｉｎｒｅａｓｈｅｄｕｏｄｅｎａｌｇｉｇｎｆｙｃｅｄｔｇ，ｅｕｎａｌａｎｄｉｌｅａｌｗｅｉｈａｗｅｌｌａｓｔｈｅｒｏｓｓｗｅｉｈｔｏｆｈｅｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｉｎｅＳＩａｎｄｈｅＩｗｉｉｎｄｅｘｊｊｇｔ，ｓｇｇｔｔ（），ｔＳｅｇｈｔＰ＜０．０５）．ＧＬＰ－２ａｌｓｏｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｖｉｌｌｕｓｈｅｉｈｔａｎｄｔｈｅｖｉｌｌｕｓｈｅｉｈｔ／ｃｒｔｄｅｔｈｒａｔｉｏ｛ｇｇｇｙｐｐ（ＶＣＲ）ｏｆｔｈｅｄｕｏｄｅｎｕｍ，ｅｕｎｕｍ，ａｎｄｉｌｅｕｍＰ＜０．０５．Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｉｎｊｊ｛）－－ｒｅａｒｏｅｃｅｅｖｕａｎＬＰ－ｕｃｅｄａｍａｅａｎｄｎｎｅｄｒｎｒ－ＧＬＰ２ｔｔｅｄｔｔｄｔｈ．ＬＰｉｌｌｓａｉｓｔＳｉｎｄｄｇｍａｉｔａｉｔｈｅｉｉｔｅｉｔＧ２ｐｇ，ｇｙＶＩ 四川农业大学博士学位论文Ａｂｓｔｒａｃｔ－－ｓｉｎｌｎｃｒｅａｓｅｄａｃｖｏｆａａｎｅｓｈａａｓｅＡＫＰｕｒａｎｓｅｅｉｆｉｃａｎｔｙｉｔｈｅｔｉｉｔｙｌｋｌｉｈｏｐｔ（）ｌｔａｍｌｔｔｉｄａｓＧＴａｎｄｇｐ，ｙｇｙｐｐ（ｙ），＜－ｔ．．ＧＬＰ２ｌａｎｃｒｅａｉｃｌｉａｓｅｉｎｔｈｅｄｕｏｄｅｎｕｍａｎｄｅｕｎｕｍ（Ｐ００５）ｔｒｅａｔｍｅｎｔａｌｓｏｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｄｐｐｊｊｇｙｌａｎｄＧ：Ｆｏｆｅａ７７１４ｓｗｅａ０ｌ４＜０ｔｈｅａｖｅｒａｅｄａｉｙａｉｎ（ＡＤＧ）ｉｌｔｓｔ０ｔｏｔｏａｌｌｓｔｏｄＰ．０５ｇｇｐｇ，，（），ｒｅｓｕ－＜ｌｔｎｎｉｎｉｎｒｅｓｅｏｆｉｎｌＢＷＧＬＰｓＰ．Ｔｒｅｓｕｕｅｓｅｄｉｇｉｎａｓｉｉｆｃａｔｃａｆａｉｎｈｉｈ２ｐｉｇ（００５）．ｈｅｌｔｓｓｇｇｔｔｈａｔｇｇＧＬＰ－２－ｅｘｏｅｎｏｕｓｉｍｒｏｖｅｄｅｒｉｌｓｄｈｅｍａａｉｎＬＰＳｉｇｔｈｏｗｔｈｏｆｗｅａｎｅｄｅｔａｎｄｒｏｔｅｃｔｅｔｓｔｎｄｕｃｅｄｐｇｐｇｐｇ－ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｄａｍａｅｂｒｏｍｏｔｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｏｆｓｍａｌｌｉｎｅｓｎｅｒｅｌｉｅｖｉｎｔｈｅｔｒｅｓｓｉｎｄａｍａｅｇｙｐｇｔｔｉｓｄｕｃｅｄｐ，ｇｇｏｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｖｉｌｌｉａｎｄｅｎｈａｎｃｉｎｇｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｄｉｇｅｓｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｓ．２ＴｈｅｅｆｆｅｃｏｆＧＬＰ－２ｏｎ－ｔｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａｌｂａｒｒｉｅｒｉｎｕｒｙｉｎｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｊｗｅａｎｅｄｉｌｅｔｓｐｇｔｈｅｂａｓｕｒ－Ｏｎｉｓｏｆｅｘｅｒｉｍｅｎｔｓ１ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｆｒｔｈｅｅｖａｌｕａｔｅｄｔｈｅｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｐ，ｐｔｏｆＧＬＰ２ｏｎ－ｍｍＬＰＳｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｒｒｉｅｒｉｎｕｒａｆｔｅｒｗｅａｎｉｎａｎｄｉｔｓｏｓｓｉｂｌｅｅｃｈａｎｉｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｊｙｇｐＨｉｈｄｏｓｅｏｆＧＬＰ－２ｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｒｅｓｔｏｒｉｎｔｈｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎ（Ｐ＜０．０５ａｎｄｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｇｐｇｐ）－－１ＺＯ１ＬＰＳｔｉｈｔｕｎｃｔｉｏｎｒｏｔｅｉｎｓｚｏｎａｏｃｃｌｕｄｅｎ（）ａｎｄｏｃｃｌｕｄｉｎｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｌｄｅｃｒｅａｔｈｇｊｐ，ｇｙｓｅｄｅｃｏｎｃｅｎｒａｎＤ－－ａｃａｅｍｎｅｘＤＡＯａｃｖｎａｍａＰ＜０５ＤＡＯｖｔｔｉｏｌｔｔａｎｄｄｉａｉｏｉｄａｓｅｔｉｉｔｉｌｓ０．ａｎｄａｃｔｉｉｔ，（）（）ｙｐ（），ｙｎｕｍｎｄＰ＜０－＜．ａｎｄＬＰｕｃｅｄｕｍｖｅＰＲＮＡｉｎｄｕｏｄｅａｅｕｎｕｍ（０５）ｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅＳｉｎｄｓｅｒｌｅｌ０．０５ａｎｄｍ，（）ｊｊ－－－－－ａｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎＩＬｉ１Ｌ６ＩＬ８ａｎｄＴＮＦｉｎｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅｓＰｐ，，（ｐｇｐ＜－－－０．０５）．ＧＬＰ２ｄｏｓｅｄｅｐｅｄｅｎｔｌｙｒｅｖｅｎｔｅｄｔｈｅＬＰＳｉｎｄｕｃｅｄｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｔｈｅｅｎｅａｎｄｒｏｔｅｉｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎｐｇｐｐＴｈ／ｒｌ８Ｓｅｒ１９Ｔｈｒｌ８／Ｓｅｒ１９ｏｆ－ＭＬＣｌｈａｉｎｋｉｎａＭＬＣＫｉｎｒｉｎｒｔｊｖｉＬＣｍｙｏｓｉｎｉｇｈｔｃｓｅ（）ａｎｄｔｈｅｃｅａｓｅｈｏｓｈｏｙｌａｅｄ（）ｐｐｐ－ｌｅｖｅｌｓｅｕｎｕｍａｎｄｌｅｕｍＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＧＬＰ２ｔｒｅａｔｍｅｎａｌｌｅｖｉａｔｅｄｉｎｔｈｅｄｕｏｄｅｎｕｍｉ．ｔ，ｊ，ｊ－ｉｎｔｅｓｔｎａａｒｒｉｅｒｎｕｒａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｉｏｎｎＬＰＳｃｈａｌｌｅｎｅｄｗｅａｎｅｄｉｌｅｓｒｅｕａｔｏｎｏｆｔｈｅｉｌｂｉｙｔｉｇｐｇｔｂｙｇｌｉｊｅｘｒｅｓｓｉｐｉｏｎａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｔｉｇｈｔｕｎｃｔｉｏｎｒｏｔｅｎｓ．ｊｐ３ＴｈｅＬＰ－２ａ－－ｅｆｆｅｃｔｏｆＧｃｔｉｏｎｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅＬＰＳｃｈａｌｌｅｎｇｅｄＩＰＥＣＪ２ａｒａｃｅｌｌｂｉｌｉｐｌｕａｒｐｅｒｍｅａｔｙａｎｄｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｔｕｄｙ３．１Ｔｈｅｂｕｉｌｄｉｎｇｏｆｒｅｓｅａｒｃｈｍｏｄｅｌ１Ｔｈｔ－－ｅｉｆｉｔＰ２ＲｘｒｅｓｉｉｎＩＰＥＣＪ２（）ｉｄｅｎｃａｉｏｎｏｆＧＬｅｐｓｏｎｒｒｗａｎｄｕｃｅｄｖａｗｈ－ＴｈｅｆｌｕａｔｒＩＰＥＪ２ｃｅｎｅｃｏｕｉｓｔｔｉａｌｓｃｏｔｔｏｅｔｅｅｈｅＣｌｌｌｉｌｄｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅＧＬＰ－２ｅＧＬＰ－２Ｒｅｘ－ｍｅｃｈａｎｉｓｍｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｆｆｅｃｔｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｐｒｅｓｓｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ，ｗｅｓｉｒｔｅｃｅｅｘｒｒｔｅｒｎｂｌｏｔａｎｄｍｍｕｎｏｆｌｕｏｅｓｃｅｎｃｅｃｈｎｉｕｅｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｔｔｈｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｕｂｃｅｌｌｕｌａ，ｑｐｏｃａｏｎＬＰ－２Ｒｎｅ－－－ＩＰＥＣＪ２ｃｅｎｅ．Ｔｈｅｒｅｓｕｓｓ２ＲｗａｓｘｒｅｓｓＩＰＥＪ２ｌｔｉｏｆＧｉｔｈｌｌｌｉｌｔｈｏｗｅｄｔｈａｔＧＬＰｅｐｅｄｉｎＣｃｅｌｌａｎｄｌｏｃａｉｌｌｅｌ．ｔｅｄｎｔｈｅｃｅｍｍｂｒａｎｅａｎｄｃｔｏａｓｍ，ｙｐ２Ｓ－－ＬＰｉｎｄｕｃｅｄａｒａｃｅｉｉｉＩＰＥＣＪ２ｌｌｕｌａｒｅｒｍｅａｂｌｔｎ（）ｐｐｙＴｈｅｔｒｉａｌｗａｓｄｅｖｉｄｅｄｉｎｔｏ５ｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｓｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆＬＰＳｅｘｐｏｓｕｒｅ（０，］０，５０，－１００１５０ｊ．／ｍＬｏｆｍｅｄｉｕｍｆｏｒ２４ｈｏｎＩＰＥＣＪ２ａｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅｒｍｅａｂｔｉｎｉｔ．Ｔｈｅｒｅｓｕｓｎｄｃａｔｅｄｉｌｉｖｒｏｌｔｉｉ，｜ｇ）ｐｐｙｔｈａｗｉｔｈｎｃｒｅａｓｉｎｌｅｖｅｌｓｏＬＰＳｅｘｏｓｕｒｅｈｅｔｒａｎｓｅｉｔｈｅｌｉａｌｌｅｃｒｉｃａｌｒｅｓｓｔａｎｃｅＴＥＲｒａｄｕａｌｔｉｇｆｐ，ｔｐｅｔｉ（）ｇｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄａｎｄｔｈｅｅｎｎｅａｂＨＲＰ４ＬＰＳｘｕｒｅｒｎｃｎｎ．Ｗｉｌｉｔｙｔｏ２ｈａｆｔｅｒｅｓａｄｕａｌｌｙｉｒｅａｓｅｄｃｏｓｉｓｔｅｔｌｈｅｎ，ｐｐｏｇｙＬＰＳｌｅｖｅｌｉｎｃｒｅａｓｅｄｕｔｏ１００ｉ／ｍＬＴＥＲａｎｄｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｔｏＨＲＰｗｅｒｅｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｌｈｉｈｅｒＰ＜ｐ｜ｇ，ｐｙｇｙｇ（＜００．０５ｃｅｖａｂｉｓｎｆｃａｎｒＰ．０．Ｍｉｃｒｉｓ）ｌｌｉｉｌｔｉｉｉｔｌｅａｓｅｄ５ｏｓｃｏｅｏｂｓｅｒｖａｓｏｎｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｅｌｌ，ｙｇｙｄｅｃ（）ｐｌｌｏｉｃｃｈａｒａｃｉｉｃｈｅｄｍｏｒｅｂｖｉｏｕｄｅａｄｃｅｌｌｉｎｃｒｅａｂｕｎｒｍｏｒｐｈｏｇｔｅｒｓｔｃｓｈａｄｂｅｅｎａｎｇｏｓｙ，ｓｓｅｄ，ｔｔｈｅｉｔｅｇｉｔｙｏｆＶＩＩ 四川农业大学博士学位论文Ａｂｓｔｒａｃｔｃｅｌｌｍｏｎｏｌａｙｅｒｗａｓｓｕｓｔａｉｎｅｄ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｗｈｅｎＬＰＳｉｎｃｒｅａｓｅｄｕｐｔｏ１５０｜ｊ，ｇ／ｍＬ，ｍｕｃｈｍｏｒｅｄｅａｄｃｅｌｌｓｎｃｒｅａｈｅｌｌｍｌｒｒｃｈｉｅｃｕｒｅａｎｄｔｈｅｍｒｈｏｃｏｏｗａｓｃｏｍｌｅｅｌｉｍａｉｒｅｄｉｓｅｄｔｏｄｅｓｔｒｏｙｔｃｅｏｎｏａｙｅａｔｔｏｔｌｔ，ｐｙｇｙｐｙｐ－ｈｈｅｃｅｌｉ．ｌｈｌｗｉｌｌｂｏｒｄｅｒｎｅｆｒａｃｕｒｅｄＴｈｅｒｅｕｔｕｅｔｔｅｎｈａｎｃｅｄｔｈｅＩＰＥＪ２ｒａｃｅｌｌｒｔｔｔｓｓｓｇｇｓｅｄａｔＬＰＳＣｐａｕａｅｒｍｅａｂ．Ｔｓｅｏｗａｓｅａｂｅｄｏ１００ｉＬＬＰ．ｉｌｉｔｙｈｅｔｒｓｓｄｓｅｓｔｌｉｓｈｔｂｅ／ｍＳｐ（ｇ－－Ｔ－３ｒｅａｔｍｅｎｔｉｈＧＬＰ２ｒｅｄｕｃｅｄＬＰＳｉｌｌｍｏｎｏｌｉ）ｗｔｎｄｕｃｅｄｃｅａｅｒｅｒｍｅａｂｉｌｔｉｎＩＰＥＣＪ２（ｙｙｐＴｈ－ｉｓｔｒｉａｌｗａｓｄｅｖｉｄｅｄｉｎｔｏｓｉｘｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｔｏｉｎｖｅｓｔｉａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｏｆＧＬＰ２ａｔｄｉｆｅｒｅｎｔｄｏｓｅｓｏｎｔ，ｇ＂＇１０７－－ｘｘ－ｗ￣ｔｈｅｒａｃｅｌｕｒｍｅ．ＴＩＰ２ｒｅｕｂａｗｌｌＯｌｌＯｍＬＰ２ｐａｌｌａｒｐｅａｂｉｌｉｔｙｈｅＥＣＪｃｅｌｌｓｅｐｒｅｉｎｃｔｅｄｉｔｈｏｌ／ＧＬ＂８ｆｏｒ１ｈａｎｄｔｈｅｎｅｘｏｓｅｄｔｏ１００．／ｍＬＬＰＳｆｏｒ２４ｈ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ１Ｘｌ〇ｐｐｇ＇７－－ａｎｄ１０ｍｏＬＧＬＰ２ｎｉｃａｎｎｈｅｄｅＬＰＳｎｄｕｃｅｄＴＥｒｅｒｅａｓｅｌ／ｓｉｇｉｆｔｌｙｉｉｂｉｔｔｈｉＲｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｉｎｃｏｆｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｔｏＨＲＰＰ＜０．０５ｍａｉｎｔａｉｎｅｄｔｈｅｍｏｒｈｏｃｔｏｌｏａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｄｅａｄｐ（），ｐｙｇｙ，ｃｅｓｗｗ－．ＣｏｍａｒｅｄＬＰＳｒｖｗａｒｎｃｒｅａｓｅｄｒｅ２ｌｌｐｉｔｈｏｕｔｈｅｃｅｌｌｉａｂｉｌｉｔｓａｄｕａｌｌｙｉｉｔｈｔｈｅｉｎｃａｓｅｏｆＧＬＰｇｐ，ｙｇ＇９－＞＜ｌｅｖｅｌＷｈｅｎＧＬＰ２ｉｎｃｒｅａｓｅｄｏ１１０ｍｏｌ／Ｌｔｈｅｆｅｒｅｎｃｅｃｏｍａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｒｏｌｒｏｕｗａｓ．ｕｐｔｄｉｆｔ，ｐｇｐｎｏｎ＜－ｍｅｎ－ｔｓｉＰｒｅｓｕｕＬＰｒｅａａｎｕａＬＰＳｅｎｈａｎｃｅｄｉｇｉｆｃａｎｔ（０．０５）．ＴｈｅｌｔｓｓｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔＧ２ｔｔｔｔｔｅｔｅｄｔｈｅ－８－ｘｔｔｉｌｌｌｌａｒｒｍｉｌｉｔｔｈｉｔｌｄ２ｗａ１１ｍ／Ｌ．ｉｎｅｓｎａａｒａｃｅｕｅｅａｂｅｓｕａｂｅｏｓｅｏｆＧＬＰｓ０ｏｌｐ，ｐｙ－ＴＪ３．２ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＧＬＰ２ｏｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｉｎＬＰ－－ＳｃｈａｌｌｅｎｅｄＩＰＥＣＪ２ａｎｄｔｈｅｍｅｄｉａｔｅｄｅｆｆｅｃｔｏｆＭＬＣＫ／ＭＬＣｓｉｎａｌｐａｔｈｗａｇｐｇｙ－Ｔｅｓｔ１ｉｄｅｄｉｎｈｌｉｗａｓｄｅｖｔｏｔｒｅｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ：ｃｏｎｔｒｏＬＰＳａｎｄＧＬＰ２＋ＬＰＳｏｎｖｅｓｔｉａｔｅｗｈｅｔｈｅｒ（），，，ｔｇ－ｅｓｔｈｅｃｅＧＬＰ２ｍｏｄｕｌｌｍｏｎｏｌａｅｒｅｒｍｅａｂｉａｆｔｅＳｃｈａｌｌｅｎｂｆｆｔｉｈｅｅｓｓｏｎａｎｄｌａｔｙｐｌｉｔｙｒＬＰｇｅｙａｅｃｎｔｅｘｒｉｇｐ－ｕｌ．Ｔ２Ｉ２ｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｔｉｈｔｕｎｃｔｉｏｎｒｏｔｅｉｎｓｅｓｔＰＥＣＪｌｌｌｒｗｒｅｔｒｅａｔｅｄｇ：ｃｅｍｏｎｏａｙｅａｓｊｐ（）ｐｗＭＬＣＫｎｈｒＭＬ－Ｐ－２ｒ１ｅｘｓｅＬＰｏｆｉｔｈｉｉｂｉｔｏ９）ａｎｄＧＬｆｏｈａｎｄｔｈｅｎｄｔｏＳｆｏｒ２４ｈ．Ｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（，ｐｏＭＬＣＫ／ｐＭＬＣｓｉｇｎａｌｉｎｇａｆｔｅｒＬＰＳｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒ４５ｍｉｎ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＴＪｐｒｏｔｅｉｎｓａｔ２４ｈａｆｔｅｒＬＰＳｅｘｐｏｓｕｒｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｗｈｅｔｈｅｒＭＬＣＫ／ｐＭＬＣｓｉｇｎａｌｉｎｇｗａｓＧＬＰ－２ｍｏｄｕｌａｔｅｄｂｉｎｔｈｅｎｉｔｉａｌｅｒｉｏｄｏｆｓｒｅｓｓｌｅａｄｉｎｔｔｈｅＴＪｕｌｔｒａｓｕｃｔｕｒｅｒｅｄｉｔｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅｙｉｔｏｔｒｓｒｂｕｐ，ｇｅｓｖｖｅＬＰＳ－ＬＰＳＭＬ－９＋ＬＰＳＭＬ－－ＬＰｔｔｗａｓｄｅ．Ｔｉｄｅｄｉｎｔｏｆｉｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ：ｃｏｎｔｒｏｌＧＬＰ２＋９＋ＧＬＰ２＋Ｓｈｅ，，，，－８－－－ｒｅｓｕｎｄａｔｅｄｈａｔ１ｘＩＯｍｏＬＬＰ２ｎｃａｎｎｈｔＬＰＳｕｃｒｅＺＯ１ｌｔｓｉｉｃｔｌ／Ｇｓｉｇｉｆｉｔｌｙｉｉｂｉｅｄｔｈｅｉｎｄｅｄｄｅｃａｓｅｏｆａｎｄｏｃｃｌｕｄｉｎｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｐ＜０．０５），ｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆＭＬＣＫｅｎｅａｎｄｒｏｔｅｉｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｔｈｅｐｇｐｐＴｈｒｌ８／Ｓｒ１９ｅ＜－ｈｏｓｒｌａｉｌｅｖｅｌＭＬＣＰ０．０５ＭＬ９ｒｅｈａｄｎｆｅｔｎｐｐｈｏｙｔｏｎｏｆｐ（）．ｔａｔｍｅｎｔｏｅｆｃｏＬＰＳ－ｒｅｕ－－－ｄｏｗｎｇｌａｔｅｄＺＯ１ａｎｄｏｃｃｌｕｄｉｎｒｏｔｅｉｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎ．ＭＬ９＋ＧＬＰ２ｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｌｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｔｈｅＴＪｐｐｇｙ＜－－－－ｐｒｏｔｅｉｎｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｐ０．０５）．ＧＬＰ２ＭＬ９ａｎｄＭＬ９＋ＧＬＰ２ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｌｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅ，，ｇｙＴｈｒｌ８Ｓｅｒｉ９ＬＰＳ－ＭＬＣ＜ｉｎｄｕｃｅｄｈｅｒｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｏｆＰ０．０５ａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｍｏｎｏｒｅｒｍｅａｂｉｌｉｙｐｐｐｙｌａｔｔｏｐ（）ｙｅｐｙ＜０－－－ＨＲＰＰｌｉＭＬｗ．０５ｈｏｗｅｖｅｒｔｈｅｅｒｍｅａｂｉｔｔｏＨＲＰｏｆＧＬＰ２９＋ＧＬＰ２ｔｒｅａｔｍｅｎｕ（）；，ｐｙ，ｔｇｒｏｐｓｅｒｅｎ－ｍｓｉｏｗｅｒａｎＭＬｒｅａｎ．Ｉｍｍｕｎｒｅｓｃｅｎｎｅｉｉｆｃａｎｔｌｙｌｔｈ９ｔｔｅｔｏｆｌｕｏｃｅｓｔａｉｎｉｎｓｈｏｗｅｄｈａＬＰｄｉｍｉｉｓｈｅｄｔｈｇｇｔｔＳ“”ｈｏｎｅ－－ｃｏｍｂｌｉｋｅｓＯｄｏｃｌｉｄｈｅｌｆｉｉｉｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＺ１ａｎｃｕｄｎｉｎｃｒｅａｓｅｔｒａｎｕａｒｏｒｍｏｆｏｃｃｌｕｄｉｎｓｔａｎｎｎｙ，ｇｇ－２ｎＺＯ－１ｍａｃｔｏｌａｓｍＧＬＰａｔｔｅｎｕａｔｅｄｔｈｅｄｓｌｏｃａｔｉｏｏｆａｎｄｏｃｃｌｕｄｉｎｉｎｄｕｃｅｄｂＬＰＳｂｉｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｙｐ；ｙｙ，ｙ”“－ｍｂｌｌｉｎｔａｃｔｈｏｎｅｃｏｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｒｅａｓｉｎｔｈｅｃｙｔｏａｓｍｉｃｏｃｃｌｕｄｉｎｓａｉｎｉｎＡｔｈｈｔｈｅｙａｎｄｄｅｃｇｐｔｇ．ｏｕｇ”“－ｈｏｎｅｙｃｏｍｂｓｒｕｃｕｒｅｎｍｅｍｂａｎｅｗａｒｅｓｏｒｅｄｎＭＬ－ｓａｎｎｌｉｋｅｔｔｏｌｏｃａｌｃｅｌｌｒｓｔｉ９ｔｒｅａｔｍｅｎｔｒｏｕｔｈｅｔｉｉｇｐ，ｇ－－ｍｌｉｎｅａｔｔｈｅｃｅｌｌｂｏｒｄｅｒｗａｓｆｒａｃｔｕｒｅｄａｎｄｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ．ＭＬ９＋ＧＬＰ２ｔｒｅａｔｅｎｔｒｅｓｔｏｒｅｄｔｈｅｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ－ｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＺＯ１ａｎｄｏｃｃｌｕｄｉｎｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｄｅｍｏｎｓｒａｅｈａ：１．ｔｔｔｔ）ＶＩＩＩ 四川农业大学博士学位论文ＡｂｓｔｒａｃｔｍｏＬＰ－２ａｍｅｔｈｅｍｅｃｈａｎｌｒａｎｏｆｎｓａｎｅｔｅｒｍｅａｂｌｌｗｉｉｓｆＧｉｏｔｉｏｉｔｅｔｉｌｐｉｈｅｌｉａｌｐｉｌｉｔｙｉｓｃｏｓｅｙｒｅｌａｔｅｄｔｈｔｈｅＴＪｒｃｒＧＬＰ－２ｍｏｄｕｎｆｓＪｉ：①ｕｎＴＪｒｏｔｅｎｘｒｅｓｓｎｔａｂｉｌｉｔｙｏｆａｈｉｔｅｃｔｕｅ．ｌａｔｉｏｏＴｎｖｏｌｖｅｓｓｔｉｍｌａｔｉｏｏｆｐｉｓｅｐｉｏ；？ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｔｈｅＴＪｐｒｏｔｅｉｎｓｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＭＬＣｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｔｔｈｅｉｎｉｔｉａｌＭＬＣＫ＇ｓｔａｅｏｆＬＰＳｓｔｒｅｓｓ．２ｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｄｏｅｓｎｔｃｏｎｔｒｕＴＪｒｇ）ＭＬＣｐｐｙｉｂｔｅｔｏｐｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈ－３ｉｎｉａｌｉＬＰ２ｒｅｕｌａｉｆＴＪｓ．３ｅｓｇｐａｔｈｗａｙｓｍｅｄａｔｅｓＧｔｏｎｏｇｗｈ－ＴｈｅｏｓｓｉｂｌｅｓｉｎａｌｉｎａｈｗａｉｃｈｍｅｄｉａｄｈｅＬＰ２ａｃｉＴｘｐｇｇｐｔｙｓ，ｔｅｔＧｔｏｎｏｆＪｅｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｈｕｌｔｒａｓｔｕｒｃｔｕｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｓｂｅｔｗｅｅｎｅａｃｏｔｈｅｒｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｉａｅｄｂｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｔｔｔ，ｐｇｙｇ４ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．－ｋＢ－（１）ＲｏｌｅｏｆＮＦｓｉｇｎａｌｉｎｇａｔｈｗａｉｎＧＬＰ２ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆＭＬＣｈｅｒｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｐｙｙｐｐｐｙＴＮ－ｎａｈｅｅｘｅｒｌｉｍｅｎｔｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｗｈｅｔｈｅｒＦｋＢｓｉｇｉｎｇａｃｔｅｄａｓｕｓｔｒｅａｍｔｏｍｅｄｉａｔｅｐｐｈｅＧ－－－ｌｉＭＬＣＫ／ＭＬＣａｈｗａ．ＩＰＥＣＪ２ｃｅｌｌｍｌｒｗｋＢｔＬＰ２ｍｏｄｕａｔｏｎｏｆｐｐｔｙｏｎｏａｙｅａｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＮＦ－ｉｎｈｒＰＤＴＣａｎｄＧＬＰ２１ｈｔｔＬＰＳｆｒ２４ｈＴｈｅｔｅｓｔｗａｖｄｉｎｔｏｆｉｖｉｂｉｔｏ）ｆｏｒａｎｄｈｅｎｅｘｏｓｅｄｏｏ．ｓｄｅｉｄｅｅ（，ｐｔｅａｔｍｅｎｔｓ－－ｒ：ｃｏｎｔｒｏｌＬＰＳＧＬＰ２＋ＬＰＳＰＤＴＣ＋ＬＰＳａｎｄＰＤＴＣ＋ＧＬＰ２＋ＬＰＳ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ，，，，Ｔｈ２３３２３６ｒＳｅｒ／ＬＰＳｃａｕｓｅｄｐＩＫＫａａｎｄｐｌＫＢｒａｐｉｄｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ，ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ－ＩｋＢｌｅｖｅｌａｃｔｉｖａｔｅｄｔｈｅ６５ＮＦＫＢｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅＭＬＣＫｔｒａｎｓｃｒｉｔｏｎｌｅｖｅｌｉ，ｐ，ｐ－－－ｍｅｎ－ａｎｄｒｏｔｅｉｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎ．ＧＬＰ２ＰＤＴＣＰＤＴＣＨ３ＬＰ２ｔｒｅａｔｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅＮＦｋＢａｃｔｉｖａｉｏｎａｎｐｐ，，ｔｔｄ６５ＮＦ－－ｐＫＢｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｄｏｗｍｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｈｅＭＬＣＫｎｅａｎｄｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄ，ｇｅｐ，７＾１８＾１９ａｂｏｈｅｄＬＣｈｅｒｈｏｈｏｒ－－ｋＢｌｉｏｎ．ＴｈｒｅｓｕｌｉｎｄｉＮＦｌｉｓｐＭｙｐｐｓｐｙａｔｅｔｓｃａｔｅｓｔｈａｔＬＰＳａｃｔｉｖａｔｅｄｍＭＬＣ－ｓｉｇｎａｌｉｎｇｔｈｗａｉｓａｓｔｈｅｕｓｔｒｅａｏｆＭＬＣＫ／ｔｏｂｅｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂＧＬＰ２．ｐａｙｐｐｙ２ＲＭＬＣＰ－ｏｌｅｏｆＲＯＣＫｉｎａｌｉｎａｔｈｗａｉｎＬＰ２ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｆＬＣｈｏｈｏｒｌｉｏｎ（）／ｓｇｇＧｏＭｓｐｙａｔｐｙｐＴｈ－ＭＬＣｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗａｓｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｗｈｅｔｈｅｒＧＬＰ２ｍｏｄｕｌａｔｅｄｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｂｙＲＯＣＫＭＬＣＰ－ＭＬＣＫ－ｒｅｕｌａｔｉｎ／ｄｅｅｎｄｅｎｔＭＬＣｄｅｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｂｅｓｉｄｅｓｉｎｈｉｂｉｔａｔｉｏｎｏｆｄｅｔｇｇｐｐｐｙ，ｐｅｎｄｅｎＭＬＣｎ－ｍｏｎｏｗｈｏｓｈｏ．ＩＰＥ２ｃｅａｒｗｒｅａｅｄＭＬＣＰＣＡＲＯＣＫｉｌａｔｉｏＣＪｌｌｌｅａｓｔｔｉｔｈｉｎｈｉｂｉｔｏｒａｌｕｌｉｎ，ｐｐｙｙ（ｙｃ）ｔｒＹ２７ＭＬＣＰａ－ｒ１ｓｅｒ２４Ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｏ６３２ｏｎｉｓｔａｎｄＧＬＰ２ｆｏｈａｎｄｔｈｅｎｅｘｐｏｄｔｏＬＰＳｆｏｈ．ｔｅｓｔｗａｓ（，ｇ），－－ｄｅｖｉｖｒｒＬＰＳＰ＋ＬＰＳａｃｕｎＡ＋２＋ＬＰＳｉｄｅｄｉｎｔｏｆｅｔｅａｔｍｅｎｔｓ：ｃｏｎｔｏｌＧＬ２ＣｌｌｉＧＬＰａｎｄ，，，ｙ，Ｙ２＋ＧＬＰ－２＋ＬＰＳ７６３２．ＴｈｅｒｅｓｕｗＬＰｉｒｅｏｒｖｅｌＰｌｔｓｓｈｏｅｄｔｈａｔＳｎａｓｅｄｔｈｅｐｈｓｐｈｏｙｌａｔｉｏｎｌｅｏｆＭＬＣＴｈｒ６９６ＭＹＰＴ＜０－ｒｅｕｌｓｎｃａｎｒｅｄｕｃｅＰ．．２ｌａｔｏｒｓｕｂｕｎｉｔｉｉｆｉｔｌｄｔｈｅＭＬＣＰａｃｔｉｖｉｔ０５ＧＬＰｒｇｙｐ，ｇｙｙ（）ｏＴｈｒ６９６－－ＭＹＰＴＹ２７６３２＋ＧＬＰ２ｎｈＬＰＳｕｌｒａｎｎｉｒｉｉｂｉｔｅｄｔｈｅｉｎｄｃｅｄｈｏｓｈｏｌｔｉｏｓｉｉｆｃａｎｔｌｙｉｎｃｅａｓｅｄｔｈｅｐ，ｐｐｙｇＴｈｌ８／Ｓ，９ｒｅｒＭＬＣＰａｃｔｉｖｉｔ（Ｐ＜０．０５，ａｎｄｂｌｏｃｋｉｎｔｈｅｓｕｂｓｅｕｅｎｔＭＬＣｈｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｙ）ｇｑｐｙｐＸｈｒ６９６－ＭＹＰＴＣａＡ＋ＧＬＰ２ｒｒｌｒｎｖｅｌｃｕｌｉｎｏｕｈａｄｈｉｈｅｈｏｓｈｏｌａｔｉｏｌｅｌａｎｄｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｌｌｏｗｒｙｇｐｇｐｐｐｙ，ｇｙｅ－－ＭＬＣＰ２ＣＡ－ａｃｔｉｖｉｔｙｔｈａｎＧＬＰｔｒｅａｔｍｅｎｔｒｏｕ．ａｌｃｕｌｉｎａｒｔｉａｌｌａｂｏｌｉｓｈｅｄｔｈｅｄｏｗｎｒｅｕｌａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｇｐｙｐｙｇＴｈｒｌ８／ＳｅｒＩ９－－－ｆＰ２ＭＬＣ．Ｔ２ｏＧＬｏｎｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔＧＬＰｃａｎｉｎｈｉｂｉＬＰＳｉｎｄｕｐｐｐｙｔｃｅｄＴｈｒ６９６ＭＬＣｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｖｉａｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｐＭＹＰＴｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｎｄｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｍａｉｎｔａｉｎａｎｃｅｏｆＭＬＣＰａｃｔｉｖｉｔｙ．ＭＥＫＲＫ１ｔｈｗＬＰ－２ｄｕＴｈｅｔ／Ｅ／２ａａｏｎＧｍｏｌａｔｉｏｎｏｆＴＪ（３ｅｆｆｅｃｏｆ）ｐｙｘｒｍｅｄ－ＴｈｅｅｅｉｍｅｎｔｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｔｏｉｎｖｅｓｔｉａｔｅｗｈｅｔｈｅｒＭＥＫ／ＥＲＫ１／２ｓｉｎａａｅｄｔｈｅＬＰ２ｐｇｇｌｉｎｇｉｔＧａｃｔｉｏｎｏｆＴＪｂｕｓｉｎＭＥＫｓｅｃｉｆｉｃｉｎｈｉｂｉｔｏｒＵ０１２６．Ｔｈｅｔｅｓｔｗａｓｄｅｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｉｖｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｔｙｇｐ：ｃｏｎｒｏｌ，ＩＸ 四川农业大学博士学位论文Ａｂｓｔｒａｃｔ－＋－ＬＰＳＧＬＰ２＋ＬＰＳＵ０１ｉｉ１２６ＬＰＳａｎｄＵ０２６＋ＧＬＰ２十ＬＰＳ．ＲｅｓｕｌｔｓｎｄｃａｔｅｄｔｈａｔＬＰＳｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅ，，，Ｔｈｒ２０２ｔ＞ｔ２０４Ｔｈｒ６９６ｈｏ－ｈｏｓｒｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＥＲＫｌ／２ａｎｄＭＹＰＴｌｄｏｗｎｌｔｈｅｒｉｉｆｐｐｙ，ｒｅｇｕａｅｄｔｏｔｅｎｅｘｒｅｓｓｏｎｏｐｐ－ａｗｅ－－ＨＳＰ７０ＺＯ１ａｎｄｏｃｃ．１ｒ１＋ＧＬＰｅａｌｕｄｉｎａｎｄＭＬＣＰａｃｔｉｖｉｔｓｌｌＵ０２６ＧＬＰ２ｏＵ０２６２ｔｒｔｍｅｎｔ，，，ｙ，，Ｔｌ２０２Ｔ２０４ｖｙｒｌ．ＨｏｗｅｖｅｒｔｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅＥＲＫ／２ｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｃｏｍａｒｅｄｏＬＰＳｔｒｅａｔｍｅｎｔＵ０Ｉ２６ｐｐｙ，ｐ，Ｔｈｒ６％ｔｄｎｏｆｆｔ－ｔＭＹｔｒｅａｔｍｅｎｈａｅｅｃｏｎＨＳＰ７０ＺＯｏｃｃｌｕｄｉｉｉｌ１ａｎｄｎｒｏｅｎｅｘｒｅｓｓｏｎＰＴ，，ｐｐ，ｈｏｓｈｏ－＋ＧＬＰ－－ｐｐｒｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌａｎｄＭＬＣＰａｃｔｉｖｉｔ（Ｐ＞０，０５；ＧＬＰ２ｏｒＵ０１２６２ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｕｒｅｕｌａｔｅｄ，ｙ）ｐｇＴｈｒ６９６－ｌｕｉｉｉｉｎｈｉｂｄｉｔｈｅＨＳＰ７０ＺＯ１ａｎｄｏｃｃｄｎｒｏｔｅｎｅｘｒｅｓｓｏｎｉｔｅｔｈｅｎｃｒｅａｓｅｉｎＭＹＰＴｌ，，ｐｐ，－ｈｏｓｈｏｒｉｔｌｖ．ｌａｔｉｏｎａｎｄｓｉｎｆｉｃａｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅＭＬＣＰａｃｔｉｉｔＰ＜０．０５Ｕ０１２６ＧＬＲ２ｏｒｐｐｙ，ｇｙｙ（），＋Ｇ－２－ｋ－Ｕ０ｉｉｂｉｔｈｅｉｉＮＦＢｉｌｉｈｌｔｉｆｈｅＣＫ１２６ＬＰｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｎｈｅｄｔａｃｔｖａｔｏｎｏｆｓｎａｎｔｅｕｒｅｕａｏｎｏｔＭＬｇｇ，ｐｇＴｈｒｌ８／Ｓｅｒ１９ｒｏｉＭＬＣｈｏｌｉｌｐｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｏｎａｎｄｔｈｅｈｏｓｒａｔｏｎ．Ｔｈｅｒｅｓｕｔｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｔｈａｔ：ｕｎｄｅｒＬＰＳｐｐｐｙ－ｔ－ｓｒｅｓｓ１ＧＬＰ２ｒｏｍｏｔｅｓｔｈｅＴＪｒｏｔｅｉｎｓＺＯ１ａｎｄｏｃｃｌｕｄｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｅｅｎｄｅｎｔｌｂＥＲＫ１／２，）ｐｐｐｙｙ２ＧＬＰ－２－ａｔｈｗａｉｎｈｉｂｉｔｓｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮＦｋＢ／ＭＬＣＫｓｉｎａｌｉｎｂｒｅｒｅｓｓｉｎｔｈｅＥＲＫ１／２ｐｙ；）ｇｇｙｐｇ－ａｔｈｗａ３ＧＬＰ２ｉｓｉｎｄｅｅｎｄｅｎｔｏｆＥＲＫｄｕｎａｉ１／２ａｔｈｗａｔｏｍｏｌａｔｅｔｈｅＲＯＣＫ／ＭＬＣＰｓｉｌｎ４ｐｙ；）ｐｐｙｇｇ；）－ＧＬＰ２ｓｔｔ．ｉｍｕｌａｅｓｔｈｅＨＳＰ７０ｒｏｔｅｉｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｅｅｎｄｅｎｔｌｂＥＲＫ１／２ｓｉｎａｌｉｎｐｐｐｙｙｇｇ－４Ｔｈｅｔ－ｔｔｔＡＭＰ（ｅｆｆｅｃｏｆＧｒｏｅｉｎｃｏｕｌｅｄｒｅｃｅｏｒｍｅｄｉａｅｄｃ／ＰＫＡｓｉｎａｌｉｎｏｎＧＬＰ２ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）ｐｐｐｇｇｏｆＴＪＴｈｅｅｘｅｒ－－ｉｍｅｎｔｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｔｏｉｎｖｅｓｔｉａｔｅｗｈｅｔｈｅｒＧＬＰ２ＲｃｏｕｌｅｄＧｒｏｅｉｎｍｅｄｉａｔｅｄｐｇｐｐｔＭＥＫ／ＥＲＫ－１／２ｓｉｇｎａｌｉｎｇｍｅｄｉａｔｅｄｃＡＭＰ／ＰＫＡｓｉｇｎａｌｉｎｇｏｎＧＬＰ２ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆＴＪｂｙｕｓｉｎｇＰＫＡａｏｎ．ｉｉｓｔＦｏｒｓｋｏｌｉｎａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒＨ８９Ｔｈｅｔｅｓｔｗａｓｄｅｖｉｄｅｄｎｔｏｓｅｖｅｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ：ｃｏｎｔｒｏｌＬＰＳｇ（）（），，－＋＋＋ＧＬＰ－＋ＬＰＳ＋Ｇ＋Ｈ８－ＧＬＰ２ＬＰＳＦｏｒｓｋｏｌｉｎＬＰＳＦｏｒｓｋｏｉｉｎ２Ｈ８９＋ＬＰＳａｎｄ９ＬＰ２ＬＰＳ．Ｒｅｓｕｌｔｓ，，，，ｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＬＰＳｈａｄｎｏｓｉｎｉｆｔｆｔｏｉｔｒｃｅｌｌｌａｃＡＭＰｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＰＫｉｉＰ＞ｇｉｃａｎｅｅｃｎｎａｕｒｐｒｏＡａｃｔｖｔｙ（０－－ｃＡＭＰ．０５ＧＬＰ２ＦｏｒｓｋｏｌｉｎｏｒＦｏｒｓｋｏＩｉｎ＋ＧＬＰ２ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｌｅｌｅｖａｔｅｄｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａ，ｒ）；ｇｙｒｏｄｕｃｔ．．ｉｉｏｎＰ＜００５ａｎｄＰＫＡａｃｔｉｖｉｔＰ＜００５ａｎｄｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｍｏｎｏｌａｅｒｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｐ（，）ｙ（）ｙｐｙ－＋－ｔｏＨＲＰＰ＜０．ｌｉｌｉｌｌｉ．０５ＧＬＰ２ＦｏｒｓｋｏｎｏｒＦｏｒｓｋｏｎＧＬＰ２ｔｒｅａｔｍｅｎｔａｅｖａｔｅｄｔｈｅｄｅｃｒｅａｓｅｉｎＴＪ（），－ｒｏｔｅｉｎｓＺＯ１ａｎｄｏｃｃｌｕｄｉｎｒｏｔｅｉｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎｒｏｍｏｔｅｄｔｈｅＨＳＰ７０ｒｏｔｅｉｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎｐｐｐ，ｐｐｐ，ｄｏｗｎ－ｅ－ｒｇｕｌａｔｅｄｔｈｅｋｅｋｉｎａｓｅｓｐｈｏｓｐｈｏｒｌａｔｉｏｎｏｆＥＲＫ１／２／ＩＫＫ／ＮＦｋＢ／ＭＬＣＫａｎｄＲＯＣＫ／ＭＬＣＰｙｙＴｈｒＩ８／Ｓｅｒ１９ｍａｅｄｅｖｃｅｄｅｓｉｇｎａｌｉｎｇａｔｈｗａｉｎｔａｉｎｔｈＭＬＣＰａｃｔｉｉｔａｎｄｂｌｏｋｔｈＭＬＣｈｅｒｈｏｓｈｏｒｉａｔｉｏｎ．ｐｙ，ｙｐｙｐｐｐｙ－Ｈ８９ｏｒＨ８９＋ＧＬＰ２ｔｒｅａｔｍｅｎｔｈａｄｎｏｓｉｎｆｆｇｉｆｉｃａｎｔｅｅｃｔｏｎｔｈｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅｎｎｅａｂｉｌｉｔｙｔｏＨＲＰ．Ｈ８９ｐ－－－ａｂｏｉｉｖｉ．ｈｌｉｎｄｉｃａｈａｌｉｓｈｅｄｔｈｅＧＬＰ２ａｃｔｏｎｏｆｒｅｌａｔｅｋｎａｓｅｓＴｅｒｅｓｕｔｓｔｅｔｔＧＬＰ２ｃａｎａｃｔｉｖａｔｅＧｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｌｅｄｒｅｃｅｄｉａｄｃ／ｉｌｉＨＳＰｉｉｉｉｂｉｔｏｒｍｅｔｅＡＭＰＰＫＡｓｎａｎｒｏｍｏｔｅ７０ａｎｄＴＪｒｏｔｅｎｅｘｒｅｓｓｏｎｎｈｔｅｐｐｇｇ，ｐｐｐ，ＥＲＫ１／２／ＩＫＫ／ＮＦ－／ＭＬＣＫｓｋＢｉｎａｌｉｎａｔｈｗａｔｏａｌｌｅｖａｔｅｔｈｅＭＬＣｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｒｏｃｅｓｓｉｎｄｕｃｅｄｇｇｐｙｐｐｙｐ１１＾６９６ｂＬＰＳａｎｄｂｌｏｃｋｔｈｅＲＯＣＫｍｅｄｉａｔｅｄＭＹＰＴｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｔｏｍｏｄｕｌａｔｅｔｈｅＬＣｙ？ｐｐｙｐＭｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．＇＇１１＊Ｓｕｍｍａｒ－ｉｌｅｘｏｅｎｏｕｓｉｎｅｃｔｉｏｎｏｆ１０ｎｍｏｌｋｄＧＬＰ２ｃａｎｉｍｒｏｖｅｔｈｅｒｏｗｔｈｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｙ，ｇｊｇｐｇｐｉｎｗｅａｎｅｄｉｌｅｔｓｂｉｍｒｏｖｉｎｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔａｎｄｔｈｅｅｎｚｍａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｆｏｒｄｉｅｓｔｉｏｎａｎｄｐｇｙｐｇｐｙｙｇｒｔｉｌｌｅｔｉｎｔｈｅｉｔｔｉｌｂｒｒｉｅｒｉｎｒｔｈｒｅｉｔｅｔｉｎｌｉｆｌｉｏｎＴｈｅａｂｓｏｏｎａｎｄａｖａｎｅｓｎａａｕａｎｄｅｏｃｃｕｒｎｃｅｏｆｎｓａｎａｍｍａｔ．ｐ，ｇｊｙｒｏ－ｐｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆＧＬＰ２ｏｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｒｒｉｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｒｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ－ａｎｄｄｌｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＴＪｒｏｔｅｉｎｓＺＯ１ａｎｄｏｃｃｕｄｉｎＡｓｔｏｔｈｅｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｉｔｈｅｌｉａｌａｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐ；ｐｐｘ 四川农业大学博士学位论文ＡｂｓｔｒａｃｔｅＧＬＰ－ｒｍｅａｂｉｌｉｔｏｎｔｈｅｏｎｅｈａｎｄ２ｒｅｒｅｓｓｅｄｔｈｅＭＬＣｈｅｒｈｏｓｈｏｉｙｌａｔｉｏｎａｔｔｈｅｅａｒｌｓｔａｅｏｆｐｙ，，ｐｙｐｐｐｙｇＬＰＳｓｔｒｅｓｓ，ａｎｄｐｒｅｖｅｎｔｅｄｔｈｅｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｐｅｒｉｐｈｅｒａｌａｃｔｉｎｒｉｎｇｌｅａｄｉｎｇｔｏｔｈｅｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒｈｅｈｅｈａｎｄ－ｓＴＪｓｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．ＯｎｔｏｔｒＧＬＰ２ｔｉｍｕｌａｔｅｄｔｈｅＴＪｒｏｔｅｉｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎｔｏｓｔａｂｌｉｚｅｔｈｅＴＪｓ，ｐｐｄ－－ｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｔｔｈｅｃｅｌｌｃｅｌｌｃｏｎｔａｃｔｓ．ＧＬＰ２ｍｏｄｕｌａｔｅｄｔｈｅＭＬＣｐｈｏｓｐｈｏｉｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ－ｍｅｄＥＲＫ１／２／ＩＫＫ／ＮＦｋＢｉａｔｅｄＭＬＣＫｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｒｏｔｅｉｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎｔｏａｌｌｅｖａｔｅｔｈｅＭＬＣｐｐ１１９６ＲＯＣＫ１１６ｈｏｓｈｏｒｉｐｐｙｌａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓａｎｄｒｅｖｅｎｔｉｎｍｅｄａｔｅｄＭＹＰＴｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｔｏｅｎｈａｎｃｅｔｏｐｇｐｐｙＬＣＬＰ－２ｏｎｅｕｎｄｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆＭ．ＴｈｅａｃｔｉｏｎｏｆＧｔｈｐｐｅｒｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓａＴＪｐｒｏｔｅｉｎｅｘｒｅｓｓ－ｒＰＫＡｐｉｏｎｉｓｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎｔｈｅＧｐｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｍｅｄｉａｔｅｄｃＡＭ／Ｐｓｉｇｎａｌｉｎｇ．－２ＷＩＩｗｏｒｄｓｉｌＫｅ：ＧＬＰｅａｎｅｄｉｌｅｔｓｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｎｔｅｓｔｎａｍｕｃｏｓａｌｂａｒｒｉｅｒｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ；ｐｇ；；ｐｙ；Ｔｉｇｈｔｕｎｃｔｉｏｎ；ＳｉｎａｌｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎａｔｈｗａｙｊｇｇｐＸＩ 四川农业大学博士学位论文本文缩略语表本文缩略语表Ｌｉｓｔｏｆａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｔｅｓｔ英文缩写英文全称中文名称－ｏｎ－ｅ－ＧＬＰ２Ｇｌｕｃａｇｌｉｋｅｔｉｄｅ２胰高血糖素样肽－２ｐｐＬＰＳＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ大肠杆菌内毒素ＡＤＦＩＡｖｅｒａｇｅｄａｉｌｙｆｅｅｄｉｎｔａｋｅ日釆食量ＡＤＧＡｖｅｒａｇｅｄａｉｌｙｇａｉｎ日增重Ｇ：ＦＧａｉｎ：ｆｅｅｄｒａｔｉｏ增重／耗料比ＶＣＲＶｉｌｌｕｓｈｅｉｇｈｔ／ｃｒｙｐｔｄｅｐｔｈｒａｔｉｏ续毛高度／隐窝深度比－－２ＲＧＬＰ２ｒｅｃｅ－ＧＬＰｐｔｏｒＧＬＰ２受体ＡＫＰＡｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ碱性憐酸酶－－ＧＴｔａｍｔｒａｎｓｅｔａｓｅ－ｙｙｇｌｕｙｌｐｐｉｄｙ谷氨酰转肽酶ＤＡＯＤｉａｍｉｎｅｏｘｉｄａｓｅ二胺氧化酶ＴＪＴｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎ紧密连接ＭＬＣＭｏｓ－ｙｉｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ肌球蛋白轻链ＭＬＣＫＭｏｓｔ－ｙｉｎｌｉｇｈｃｈａｉｎｋｉｎａｓｅ肌球蛋白轻链激酶ＭＬＣＰＭｙｏｓｉｎｌｉｈｔｃｈａｉｎｈｏｓｈａｔａｓｅｇｐｐ肌球蛋白轻链憐酸酶ＴＥＲＴｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ跨膜电阻ＨＲＰＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｅｒｏｘｉｄａｓｅｐ辣根过氧化物酶ＴＲＡＦ６Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ肿瘤坏死因子受体相关－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆａｃｔｏｒ６因子６ＭＹＰＴｍｙｏｓｉｎｈｏｓｐｈａｔａｓｅｔａｒｇｅｔｓｕｂｕｎｉｔ肌球蛋白憐酸酶结合亚基ｐＲｈ－ａｓｒ〇ＣＫｏｓｏｃｉａｔｅｄｋｉｎａｓｅＲｈｏ相关激酶ＸＩＩ 四川农业大学博士学位论文目录目录￥ＳＩＡＢＳＴＲＡＣＴＶＩ本文缩略语表ＸＩＩ一胃＿■５５１前２文献综述６２．１肠炎与肠道通透性的关系６２－．２ＧＬＰ２认识的６－．２３参与ＧＬＰ２肠营养作用的信号途径８２．４肠粘膜屏障的通透性与ＴＪ１０２ＬＰ－２１．５Ｇ对ＴＪ调节的研宂现状８１９３存在的问题第二章本研宄的目的、意义、内容和技术路线２１Ｉ．研宄目的２１２？研究意义２１３．研究内容２１４？２２技术路线第三章试验研宄２３一试验－２：ＧＬＰ对断奶仔猪肠道发育及生产性能的影响２３１．前２３２．材料与方法２３２１２３．试验动物及试验设计２．２４饲养管理２２．３试验仪器和试剂２４２．４样品采集２５ｉ 四川农业大学博士学位论文目录２．５测定指标及方法２５２．６数据处理与统计分析２７３．親２７．１生产性能２７３：－．ＬＰ２９３２血浆Ｇ的浓度２３．３肠重和形态学３０３．４消化吸收相关的酶活３３４．脱３４４－．１ＬＰ２３４断奶后血浆Ｇ浓度的变化规律４－．２ＬＰ２３４Ｇ对肠重和形态学发育的影响４－．３ＧＬＰ２３５对小肠酶活的作用４－．４ＧＬＰ２对生产性能的影响３６５３６．４＾－试验二ＧＬＰ２对ＬＰＳ应激的断奶仔猪肠粘膜屏障损伤的作用３７１７．ｍｍ３２？材料与方法３８２．１试验动物和饲验设计３８２．２试养管理３８２３３８．试验仪器和试剂２．４样品采集３９２＿５测定指标４０２．６统计分析４６３．關４６－３ＬＰ－－ＤＡＯＤＡＯ．１Ｇ２对血浆ＬＰＳ、Ｄｌａｃｔａｔｅ和酶活以及肠粘膜酶活的影响４６（）－３．２．ＧＬＰ２对促炎性细胞因子的影响４６３－．３．ＧＬＰ２预处理对ＬＰＳ应激的断奶仔猪肠道ＴＪ屏障的作用效果４９３－ＭＬＣ旁路的影响．４．ＧＬＰ２对ＬＰＳ应激的断奶仔猪ＭＬＣＫ／５０ｐ４４．ｉｔｉｆｅ５－４２５４．１．ＧＬＰ对受损肠粘膜屏障通透性的影响－４．２ＧＬＰ２对ＬＰＳ应激导致的断奶仔猪肠炎的影响５５４－．ＬＰＴ５６３Ｇ２对Ｊ蛋白表达量的影响４－ＬＣＫＭＬＣ５６．４ＧＬＰ２对Ｍ／影响ｐ旁路的５．＾５７ 四川农业大学博士学位论文目录－２－Ｊ２肠上皮细胞间通透性的调控作用及分子机制研宄８试验三ＧＬＰ对应激的ＩＰＥＣ５一（）研究模型的建立５８１８ＩｔＴｓ５Ｉ２材料与方法５８２－．１ＧＬＰ２Ｒ的鉴定５８．１２２ＬＰＳ应激模型的建立６２－２４．３ＧＬＰ最适剂量的确定６２．４试验数据处理６５３＾６５３－５．１ＧＬＰ２Ｒ的鉴定结果６３ＬＰＳ应５．２激模型的建立６３－ＬＰ１ＰＥ－２．３ＧＬＰ２缓解Ｓ应激的ＣＪ细胞单层通透性的作用６９４．Ｗｉｔ７２４－－．ＩＰＥＪ２２Ｒ１Ｃ细胞系ＧＬＰ的鉴定结果７２４．２ＬＰＳ应激模型的建立７２４－．３ＧＬＰ２处理ＰＳ应７３对Ｌ激的肠上皮通透性的缓解作用５轉７３－－ＭＬＣ的介导作用（二）ＧＬＰ２对ＬＰＳ应激的ＩＰＥＣＪ２细胞ＴＪ蛋白表达及重排的影响及ＭＬＣＫ／ｐ７４研宄４１ｍ７Ｔａ２材料与方法７４Ｐ－２ＬＰＳ－２ＩＰＥＪ２ＴＪ７４．１ＧＬ对应激的Ｃ细胞的影响２．２ＭＬＣＫ对细胞单层通透性的影响７６２处理７８．３试验数据３關７８－－．１１ＰＥ２细胞ＴＪ的影响７８３ＧＬＰ２对ＬＰＳ应激的ＣＪ３ＭＬＣＫ８２．２对细胞单层通透性的影响４職８５４ＬＰ－２ＬＰＳ－ＩＰＥＪ２ＴＪ５１ＧＣ８．对应激的细胞系蛋白的影响４ＭＬＣＫＬＰ－２．２／ｐＭＬＣ信号在Ｇ缓解应激的细胞单层通透性作用中的地位８８５吉８９－９０（三）ＧＬＰ２影响ＴＪ屏障功能的信号途径研究ｉｉｉ 四川农业大学博士学位论文目录１．ｍｍ９０２材料与方法９０２－－２．１ＮＦｋＢ信号途径在ＧＬＰ调控ＴＪ中的作用９０２２Ｒ／ＭＬＣ信号途径在ＧＬＰ－２９３．ＯＣＫ／ＭＬＣＰｐ调节ＭＬＣ磷酸化中的作用２－．３ＭＥＫ／ＥＲＫ１／２ＬＰ２调节ＴＪ结构的作用４信号途径对Ｇ９ｃ／ＫＡＴＪ的影响９４２．４ＡＭＰＰ信号旁路对细胞２．５试验数据处理９６３關９６－ＭＬＣ３．１ＮＦＫＢ／ＭＬＣＫ／信号途径ｐ９６３．２ＲＯＣＫ／ＭＬＣＰ／ｐＭＬＣ信号途径９９３．３ＥＲＫ１／２信号途径１０１３４ｃＡＭＰ／ＰＫＡ号途径１０５．信４雖１１０－４．１ＧＬＰ２调节ＴＪ结构分布的信号途径１１０－４２ＬＰ－２１１１．Ｇ调节ＺＯ和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白表达的信号途径５１５．＾１６一第四章全文总结与结论、创新点及有待进步研宄的问题１１７１．全文总结与结论１１７２？本研宄的创新点１１８一３１１８．有待进步研究的问题参考文献１２０ｍ＃１３７攻读博士学位期间发表和录用的主要学术论文１３８ｉｖ 四川农业大学博士学位论文第一章绪论第一章绪论＇１前言畜禽在生长中常因遭遇各种应激而导致肠道炎症的发生。应激导致肠上皮通透性增加，，细菌／内毒素等入侵粘膜下组织触发Ｔ细胞激活炎性细胞因子发生免疫反应，这与肠炎的发生紧密相关。肠上皮间通透性的改变的根本原因在于肠上皮细胞间紧密连接（Ｔｉｇｈｔｕｎｃｔｉｏｎ，ＴＪ）相关蛋白表达的改变及分子结构的解聚和重排，ＴＪ的选择ｊｍ性屏障功能和栅栏功能发生改变。那么，若缓解应激状态下肠道通透性的改变，是否能减轻畜禽肠炎的发生发展呢？－－－２（Ｇｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２２）胰高血糖素样肽ｇｐｐ，ＧＬＰ调节肠道发育与适应的营一养生理效应已逐渐成为肠道健康和动物抗病营养的重要前沿课题之。肠道Ｌ细胞分－２泌的ＧＬＰ能通过刺激肠上皮细胞的增殖，抑制其凋亡增加肠绒毛高度、黏膜厚度等，并可能影响肠上皮细胞间的紧密连接，调节肠道适应（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｄａｐｔａｔｉｏｎ）的进２［］－程。研宄表明ＧＬＰ２对畜禽肠炎的发生及预后具有预防、保护和治疗作用，其根本３＿６［］原因可能在于通过对肠道通透性的调控，减弱了炎性因子对肠道的损伤。由此推ＬＰ－测，其作用机理与ＴＪ结构的稳定有着根本的联系２。那么，Ｇ是如何将信号传递７］［到ＴＪ蛋白上影响其表达和分布的呢？在ＴＪ的构成蛋白上，蒋义等（２０１２）研宄表ＬＰ－２ｚｏｎａｏｃｃｕｄｅｎ－－－１（Ｚ１）、ｏｃｃｕｄｎ、Ｃａｕｄｎ１明，Ｇ能够促进空肠ＴＪ蛋白ｌＯｌｉｌｉ的基－Ｊ的结构方面，ＧＬＰ２是否参与调节ＴＪ的结构重排因和蛋白表达，其分子机；但在Ｔ理如何尚不得而知。一ＧＬＰ－２研究并阐明对肠道通透性的影响及其作用机制，不但有助于我们进步－认识应激导致肠道通透性改变和肠炎发生的机理，更为重要的是，可将我们对ＧＬＰ２一的认识从促进肠道发育、改进肠道吸收等肠营养效应进步拓展到维护肠粘膜屏障、降低肠道损伤、保障肠道健康等方面；同时为我们通过营养、基因调控的手段调节ＧＬＰ－２信号转导途径关键蛋白的表达或磷酸化水平，从而维持肠道结构功能的完整，■实现对畜禽肠道健康的维护提供理论依据，极大地促进了肠粘膜营养理论的发展。实践上－２在，掌握了ＧＬＰ细胞水平、机体水平上的营养生理效应及规律，可以为ＬＰ－２我们开发Ｇ为肠道损伤，、修复或肠道保护的功能性营养制剂提供依据为使用－２缓解应激状态下动物肠炎的发生ＧＬＰ、发展乃至生产性能的下降提供试验支持，或一ＧＬＰ－２信号转导途径上的关键蛋白为新的调控靶点提供新的思路为将来进步开发。５ 四川农业大学博士学位论文第一章绪论２文献综述２．１肠炎与肠道通透性的关系在生产中，畜禽常因遭遇各种应激导致肠道炎症的发生。以仔猪为例，仔猪断奶后常发生的肠道形态结构的改变、腹泻、肠道炎症反应以及对日粮新抗原的免疫应答８９［］［］是引起断奶厌食症的直接原因。ＰＭ等（２００４）研究发现，断奶应激显著增加仔猪／Ｉ－／？、７７ＶＦ－ｃ肠粘膜的促炎性细胞因子和ｔ的基因表达；促炎性细胞因子基因的／一增量调节，，进步加重肠炎的发生，肠道功能紊乱最终导致仔猪腹泻。，宄其根源是由肠道上皮细胞间隙的通透性增加引起促炎性细胞因子的产生，肠。道内抗原物质、细菌／内毒素入侵粘膜下免疫系统发生免疫反应所致早期断奶前，仔猪消化系统和免疫器官发育还不完善，消化道中酶和胃酸的分泌量不足、正常的肠，道微生态系统尚未建立；而在此时断奶各种应激（如断奶后心理和环境变化等）和一）会使肠道粘膜屏障受损，多种应激均导致肠道通不利因素（植物大豆抗原。方面透性的增加。不同的动物研究模型证实心理和机体的应激涉及乙酰胆碱的释放，诱导肠上皮功能失调，导致对肠腔中潜在有害物质（如植物蛋白抗原、毒素、促炎分子）１（）一［］的摄取加强。另方面，饲粮抗原物质进入粘膜下层，Ｔ淋巴细胞被致敏并大量増，Ｔ细胞迅速分化增殖，从而触发或加重炎症的发殖当再次与同种抗原接触时，致敏１１［］，，。生发展导致腺窝加深，绒毛变短肠道对养分消化吸收的能力降低刘海萍等（２００８）１２［］对早期断奶仔猪的肠道通透性进行研宄，发现早期断奶引起仔猪的肠道通透性增强，，这可能归因于肠上皮细胞ＴＪ蛋白肠屏障功能遭到破坏，到３５日龄尚未恢复ｍＲＮＡ表达的下降。据此可知，肠道通透性的变化可能参与畜禽在应激状态下肠道炎症的发生发展过程，而在肠道结构屏障中发挥关键作用的调控肠道通透性的ＴＪ蛋白的表达和结构的改变可能是造成这一切发生及发展的根源；由此我们推测外源添加能改善肠道通透性的物质可能有利于肠道结构的完整，增强肠粘膜屏障的抗损伤能力，可加快肠道适应过程的完成。２－．２ＧＬＰ２的认识－血糖素原基因时发现的ＧＬＰ２是美国Ｌｉｌｌｙ实验室在克隆胰高，它是脑下垂体腺一３３苷酸环化酶激活肽／胰高血糖素超家族成员之，是由个ＡＡ构成的单链多肽，分３９００道尔顿，位于Ｎ末端的第二位是丙氨酸残基子量约为，使得它易被肽末端降解６ 四川农业大学博士学位论文第一章绪论二－ＩＶ７ｍＬＰ－２酶肽基肽酶降解，其半衰期为ｉｎ。在哺乳动物上Ｇ的氨基酸序列具有高－２主ＬＰ－ＬＰ－度的同源性和保守性。ＧＬＰ要在胃肠道中表达和分泌，通过与Ｇ２受体（Ｇ２ｒｅｃｅ－ｔｏｒＧＬＰ２Ｒ。ｐ，）特异性结合激活下游信号转导途径发挥生物学功能２－．２．１ＧＬＰ２的肠道营养效应１３一［］般来说－主要包括调节肠上皮细胞生长，ＧＬＰ２的肠营养效应，减小肠道通透１４１５１６１７［，］］［］系膜血流［性，，：，增加肠促进养分的吸收具体表现为增加肠道组织的重８１］［量和肠粘膜的厚度；增加绒毛的高度和隐窝的深度，调节绒毛高度／隐窝深度的比１９２（）＇值刺激肠细胞的增殖［］、存活，抑制细胞凋亡调节肠道刷状缘酶活性如麦芽糖；；２１２２２３，［］ＲＮＡ的表达［］，酶；刺激、蔗糖酶、乳糖酶肠道吸收转运蛋白ｍ增强肠上皮细胞基底侧对葡萄糖的转运，为肠上皮细胞提供较为充分的代谢底物；通过影响肠道１４２４２５，］［［］ＴＪ结构的通透性，发挥对受损肠粘膜屏障的修复作用，维持肠道结构功能的完整性，有利于肠道适应过程的快速完成。ＧＬＰ－２对肠道通透性的作用在近年来越来越成为学者们关注的热点。２－．２．２ＧＬＰ２对试验动物肠道通透性变化的影响Ｂｏｕｓｈｅ＾ＬＰ－２ｙ等（１９９９）在非甾体抗炎药物诱导的小鼠肠炎模型上，发现Ｇ能显著提高小鼠的存活率，降低肠道通透性和细菌易位率，加速肠黏膜损伤的愈合。２７［］Ａ－ｌａｖｉ等（２０００）研究发现ＧＬＰ２能降低大鼠过敏性肠炎模型中促炎性细胞因子２５［］－ａ－ＴＮＦ、ＩＦＮｙ的循环水平，减轻肠道炎症反应及损伤。Ｂｅｎｊａｍｉｎ等（２０００）在大＋鼠上连续－ａ１０天进行皮下注射５Ｍｇ／ｄＧＬＰ２，降低了通过旁细胞途径转运的Ｎ和Ｃｒ－ＥＤＴＡ以及通过跨细胞途径转运的辣根过氧化物酶ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｃｈｅｒｏｘｉｄａｓｅ，）ｐ２４［］Ｋｏｕ－的通导量ｒｉｓ２００１）Ｄ２。等（采用雄性Ｓ大鼠研宄ＧＬＰ能否降低肠道通透性并－－因此防止急性胰腺炎引起的细菌易位。结果显示ＧＬＰ２类似物ＡＬＸ０６００（０．１ｍｇ／ｋｇ）处理显著提高了肠上皮的跨膜电阻值，减少了肠系膜淋巴结的细菌易位，并使胰腺、０ＧＬＰ－２显著降低了急性胰腺炎腹膜的细菌数降至，表明发生时的肠道通透性。．２８Ｃａｍｅ［］－ｒｏｎ和Ｐｅｒｄｕｅ（２００５）研究发现ＧＬＰ２预处理可改善小鼠由缺水应激导致的肠屏障功能损害，降低上皮通透性及细菌粘附率，增强肠屏障功能。Ｓｉｇａｌｅｔ等（２００７）２９［］－２研究发现每天注射两次ＧＬＰ，减弱了ＴＯＢＳ结肠炎引发的肠道通透性的增加及３［］－－－促炎性细胞因子（ＩＮＦｙ、ＴＮＦａ和ＩＬｌｐ）的表达。Ｈａｄｉｙａｎｎｉ等（２００９）研宄发ｊ７ 四川农业大学博士学位论文第一章绪论ＧＬＰ－２现在ＮＯＤ非肥胖症糖尿病小鼠上，增加了小肠长度和重量，并显著降低了空３Ｇ［］。Ｃａｎｉ（２００９）肠上皮的电阻，改善了肠道的通透性，增强了粘膜屏障的功能等发现益生元处理的小鼠血浆ＬＰＳ和细胞因子水平显著降低，并且肝脏炎症和氧化应激的指示物表达量也显著降低，这种炎症反应的降低伴随着肠道通透性的降低和ＴＪ结果完整性的改善－２的。益生元增加了内源性具有肠道营养作用的ＧＬＰ增加，并且－添加ＧＬＰ－２抑制剂取消了大部分益生元的作用效果。药理学剂量的ＧＬＰ２处理降低“”相似了肠道通透性、全身和肝脏的炎症，得到了和添加益生元处理改变肠道菌群的结果ＪＧＬＰ－２。由此表明，益生元影响肠道菌群并实现对肠道Ｔ的调节作用与内源性５［］的产生增加和炎性细胞因子的产生降低有关。Ｍｏｏｒｅ等（２０１０）研究在术前１或３ｈ－２减２４添加ＧＬＰ少了术后、４８ｈ的淋巴浸润，抑制了参与粘膜炎症和屏障功能的基－－因表达，包括／Ｋ、苁印、ＣＰｉ、和ＣＯＸ２，显示了分子炎性反应的钝化，４［］－ｓｓｏｗ表明ＧＬＰ２可以减轻术后炎症从而加快肠道的恢复。Ｋｉ等（２０１２）研宄表明ＧＬＰ－２可ＰＯ的产生鼠由于放化疗引起的肠黏膜炎的以降低髓过氧化物酶Ｍ，预防大６［］－发生ａｎＧＬＰ－２ｃｏ２ＴＥＲ；Ｍｏｒ等（２０１２）发现增加了体外Ｃａ细胞单层的跨膜电阻－－ｏｃｃｔ。ｌｕｄｉｎ和ＺＯ１蛋白的表达ｃ以及，缓解了ＴＮＦ诱导的ＴＥＲ及ＴＪ蛋白表达的降低ＬＰ－２以上研究结果表明Ｇ在不同动物模型上不仅可以改善肠道通透性，还有明－显的抑制促炎症因子产生的作用。因此，我们将ＧＬＰ２能否应用于生产预防或缓解畜禽肠炎发生的这一思路作为本试验开展的指导思想。２－．３参与ＧＬＰ２肠营养作用的信号途径－２发挥肠营养效应的机制已有大量研究对于ＧＬＰ，但主要集中于对细胞增殖、－凋亡和分化等方面的调节。ＧＬＰ２通过增进肠道细胞增殖、抑制细胞凋亡而调节肠道主要涉及三个方面－－－：ＧＬＰ２Ｒ、ＧＬＰ２与ＧＬＰ２Ｒ结合后的发育的机理，目前的研宄１４［］信号转导途径以及信号途径间的整合。－２．３．１ＧＬＰ２Ｒ／ＣＡＭＰ／ＰＫＡＧＬＰ－２Ｒ是由５５０个氨基酸组成的Ｇ蛋白偶联受体）（ＧＰＣＲ超家族（胰高血糖一－－－素胰泌素家族，或者说Ｇ蛋白家族Ｂ）成员之。ＧＬＰ２需要与ＧＬＰ２Ｒ结合发挥ＧＬＰ－２ＲＧＬＰ－２浓度的影响其促肠上皮生长及修复的作用，但是，受到存在受体脱敏３１３２［］［］它主要表达于胃肠道和大脑ＧＬＰ－２ＲＧＬＰ－２的现象，；分布的特异性决定了肠道３３，３４［］－－营养的特异性。许多研究都表明ＧＬＰ２能够直接作用于能表达ＧＬＰ２Ｒ的肠上８ 四川农业大学博士学位论文第一章绪论皮细胞或间接地作用于能表达ＧＬＰ－２Ｒ的上皮下成肌纤维细胞或神经元细胞，通过它们释放其他生长因子或神经递质发挥对肠细胞效应的调节作用。３５［１－－Ｍｕｎｒｏｅ等（１９９９）１ｎｍｏｌ／ＬＧＬＰ２理转染了ＧＬＰ２ＲＣＯＳ，用处的细胞使＇陶ｃＡＭＰ的水平增加了４倍－。Ｗａｌｓｈ等（２００３）也发现除ＧＬＰ２外其它胰高血糖素超－－家族成员不能引起表达ＧＬＰ２Ｒ的大鼠肠粘膜细胞ｃＡＭＰ水平的变化，ＧＬＰ２诱导ＰＨＴ１１ｃＡＭ的产生在剂量为ｍｏｌ／Ｌ时达到最高，之后随剂量增加ｃＡＭＰ的积累减少；９＇６－－２Ｒ存在脱敏现象ｃＡｍｏ２的响应减弱０－ＧＬＰ，ＭＰ对ｌ（Ｔｌ／ＬＧＬＰ，而用１ｍｏｌ／ＬＧＬＰ２３１１１预处理，则完全废除ｃＡＭＰ的产生。Ｅｓｔａｌｌ等（２００４）研究也证实细胞膜表面的ＧＬＰ－２Ｒ存在脱敏和复敏现象ＧＬＰ－２浓度的影响。，该现象受到３７［］Ｙｕｓ－－ｔａ等（１９９９）发现ＧＬＰ２能显著刺激ＰＫＡ和ＡＰ１依赖的报告基因表达，相对高浓度的ＧＬＰ－２能诱导ＬＰ－２－即早基因表达，促进细胞增殖，且Ｇ影响ＡＰ１的表３６］［ＡＭＰＰＫＡＷ－－达主要由ｃ／信号介导ａｌｓｈ（２００３）２ＲＬＰ２。等发现ＧＬＰ的激活使Ｇ＾ｃＡＭＰ理学剂量的ＧＬＰ－２（ｌＯｍｏ剂量依赖地激活ｌ／Ｌ）以ＰＫＡ依赖的方式刺激，生３ｃＡ－ＭＰ的产生和Ｈ脱氧胸腺嘧啶苷的整合，从而刺激肠粘膜细胞增殖Ｍａｒｔｉｎ等（２００６）；３８［］指出经典的Ｇ蛋白偶联Ｇａｓ激活ＡＣ增加ｃＡＥ－ＭＰ和ＰＫＡ积累ｌｋ１、，最终激活ｃ－ｆｏｓ－、ｅｊｕｎ基因，刺激细胞增殖。另夕卜，许多研宄表明ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号还参与了３２［］－ＧＬＰ２抑制细胞凋亡的作用，其作用机制是通过ＰＫＡ依赖式旁路磷酸化促凋亡分２１９Ｂ－－－子ａｄ，并使糖原合成酶激酶３ａ（ＧＳＫ３ａ）亚基的Ｓｅｒ和ＧＳＫ３Ｐ亚基的Ｓｅｒ发生３９４Ｇ［］［］－３Ｋｏ磷酸化抑制ＧＳＫ的活性实现的。与此相似地，ｅｈｌｅｒ等（２００５）在细胞凋亡－，ＧＬＰ２ａｓ／ｃＡＭＰ激活ＰＫＡ信号途径，研究中发现通过Ｇ，抑制ＰＡＲＰ的分解促进１９一１１ＧＳＫ－３３的步地２００７）－磷酸化。进，Ｂｕｒｒｉｎ等（在体内也证实ＧＬＰ２能快速上调｜ＰＫＡ／ＰＫＢ－－－２／ＧＳＫ３磷酸化作用于ｃａｓｐａｓｅ３的上游目标基因如Ｂｃｌ和ＩＰＡｓ抑制ｃａｓａｓｅ－３的，实现对细胞抗凋亡的调节ｐ活性。以上研宄表明Ｇ蛋白受体偶联的ｅＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路在ＧＬＰ－２调节细胞代谢和生命活动中起着举足轻重的作用。２．３．２ＥＲＫ１／２信号途径３７ｓ［］－－Ｙｕｔａ等（１９９９）研宄中，ＧＬＰ２影响ＡＰ１的表达主要由ｃＡＭＰ／ＰＫＡ介导，ＡＰ－Ｒ（ＡＢ但１的活性并不会被ＰＫＡ的抑制剂Ｈ８９和负抑制子Ｍｔ）完全抑制，表明－－ＧＬＰ－－２Ｒ在ＢＨＫ２Ｒ细胞中ＧＬＰ不止激活ＰＫＡ和ＡＰ１旁路，还存在不依赖ＰＫＡ的一－２条或多条未确认的旁路与ＧＬＰ诱导的促有丝分裂的激活有关然而，２０ｎｍｏ／Ｌｌ；９ 四川农业大学博士学位论文第一章绪论的ＧＬＰ－２不仅没有增加ＥＲＫ／１２的磷酸化，反而降低了ＥＲＫ的基础磷酸化；当抑制一ＰＫＡ时ＥＲＫ－１的下游Ｅｌｋ１Ｊａｓｌｅｅｎ（２０００），信号的表达升高。也有不致的报道，等４ｉｌ］１０－－报道ｍｍｏｌ／ＬＧＬＰ２刺激人肠上皮细胞株Ｃａｃｏ２约５ｍｉｎ，细胞内ＥＲＫ１／２活化形式明显增加，肠上皮细胞的增殖反应增加了１０倍。ＭＥＫ抑制剂ＰＤ９８０５９以剂量依赖的方式阻断ＧＬＰ－２的促细胞增生作用－，证实ＧＬＰ２通过激活ＭＡＰＫ信号传导通４２［］路ｃｏ－２的研究表ＧＬＰ－２，诱导肠上皮细胞増生。Ｊａｓｌｅｅｎ等（２００２）在人Ｃａ明促进细胞增殖的同时伴随着ＥＲＫ磷酸化的瞬间升高，这种反应会被ＭＡＰＫＫ抑制剂ＰＤ９８０５９所阻断，这说明ＭＡＰＫｓ的４４／ｐ４２信号途径可能是ＰＫＡ信号途径的补充。ｐ４Ｑ［］Ｋｏｅｈ－ｌｅｒ等（２００５）研究发现在Ｈｅｌａ细胞中ＧＬＰ２通过偶联Ｇ蛋白激活一Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫ旁路，其激活至少部分由Ｇ蛋白的３亚基催化，进而调（丫控细胞增１９［］在新生仔猪上也证实了用ＧＬＰ－２处理可以刺激ＥＲＫ殖的。Ｂｕｒｒｉｎ等（２００７）１／２的快速激活及下游目标基因Ｐ９０ＲＳＫ丰度的增加，促进隐窝细胞的增殖。２．３．３其它途径４３［］－Ｈａｒｅ等７）研究发现ＧＬＰ－２能够抵消表皮生长因子ＥＧＦ（２００酷氨酸激酶抑制ＧＬＰ－２剂引起的肠道发育迟缓和绒毛萎缩；添加不能使肠粘膜的发育完全恢复，提－－－２的作用可能部分经ＥＧＦ酪氨酸激酶途径介导示ＧＬＰ，ＧＬＰ２与ＥＧＦ有协同效应。对于不表达ＧＬＰ－２Ｒ的隐窝细胞的促增殖作用则主要通过旁分泌作用于能表达－ＧＬＰ－２Ｒ－ＩＧＦ１ＧＦ的成肌纤维细胞或神经细胞，通过释放作用于隐窝细胞的Ｉ１Ｒ，３９［］ｔ－ｃａｔｅｎ调节Ｗｎ／３ｉｎ信号途径间接促进隐窝细胞增殖；另外，Ｙｕｓｔａ等（２００２）研宂（Ｐ－－－当抑制Ｉ３Ｋ活性时，ＧＬＰ２通过ＧＬＰ２Ｒ促进细胞存活的作用主要是通过ＰＫＡ途ＧＳＫ－３和Ｂａｄ蛋白的表达来调节的ｃＡＭＰ／ＰＫＡ－３Ｋ／Ａｋ径激活，说明和ＰＩｔ信号途径４４［］－是可以相互补充的－／。ＧＬＰ２不仅通过ＰＩ３ＫＡｋｔ依赖式旁路促进上皮细胞增殖，还４５［］－能介导ｍＴＯＲ信号促进蛋白质合成。因此，ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号也作为补充信号途径参ＧＬＰ－２与了的生物学作用。２．４肠粘膜屏障的通透性与ＴＪ肠粘膜机械屏障的结构基础是完整的肠上皮细胞和相邻肠上皮细胞之间的连接，两者共同构成肠道的选择性屏障，调控着水和溶质的跨上皮细胞转运。细胞间的连接有ＴＪ、黏附连接和缝隙连接等，而ＴＪ则是肠上皮细胞间主要的连接方式，调节着肠一旦改变，道的通透性变化。肠道上皮细胞间ＴＪ结构，就会引起肠道通透性的变化１０ 四川农业大学博士学位论文第一章绪论肠粘膜机械屏障功能受损，，使得肠内细菌、毒素等可以通过旁细胞通路进入体循环伴随着肠道消化吸收功能的下降。随着分子生物学和显微技术的不断发展，ＴＪ的分。子结构及其在肠粘膜屏障功能中的作用逐渐受到重视，已成为众多学者关注的热点２．４．１肠细胞ＴＪ的分子结构Ｔ一Ｊ为狭窄的带状结构，上皮细胞，位于上皮细胞膜外侧的顶部相邻细胞互相一包裹，形成融合点或吻合点，将这些吻合点连接起来，就形成个连续的渔网状结构（见图１）。ＴＪ由咬合蛋白ｏｃｃｌｕｄｉｎ、闭合蛋白ｃｌａｕｄｉｎｓ和连接粘附分子（ｊｕｎｃｔｉｏｎ－ａｄｈｅｓ，ＡＭｓ）ｚｏｎｕａｏｃｃｅｎｓ（Ｚｌ，ｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅＪ３种完整的跨膜蛋白和闭合小环蛋白ｌｌｕｄＯＺ０－－）－２和Ｚ０３等外周胞浆蛋白组成。其中，起主要作用的是ｏｃｃ１ｌｕｄｉｎ蛋白和ＺＯ－蛋白，１，相邻上皮细胞通过这些蛋白质进行连接封闭细胞间隙。Ｚ０是与ＴＪ和细胞一“”，如同Ｎ端的保守序列内骨架系统有密切关系的胞膜下蛋白个转接器，其蛋白ｏｃｃｄｉｎ蛋白的Ｃ末端连接－，１能够与细胞质内的其他蛋白如ｌｕ而Ｚ０的Ｃ端则可结合４６一Ｔ［］ａｃｔｉｎ，从而将ｏｃｃｌｕｄｉｎ等蛋白和肌动蛋白骨架系统连接在起，形成Ｊ的基本结构。－－ａｃｔＦｉｎ主要环绕于细胞周边细胞细胞间连接附近形成周边肌动球蛋白环（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌａｃｔｉｎｍｏｓｉｎｒｉｎｇ，ＰＡＭＲ），在细胞与细胞接触部位呈束状相互连接ｍｏｓｉｎ由ｙ。ｙ两条约２００ｋＤ的重链和４条分别２０ｋＤ的轻链组成（分别为２条必需轻链ＭＬＣ１和２条一２－调节轻链ＭＬＣ）。重链形成了个带有螺旋螺旋结构域的平行双链尾巴结构，并带一ａｃ有对大球状ＮＨ２末端头部，该头部可与ＡＴＰ和ｔｉｎ相互作用生成动力。ＴＪ的蛋１白结构组成见图。Ｔｎｌｕｌｉｎｔｕｎｔｉｏｎｓｃｅ（ａｊｃＯｃｃｌｕｄｉｎｂｅｅｎｒｅｔｗｅｔｈｅ，——ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓ）Ｆ－ａｃｍｔ（１ＪＪＡＭｆｍｉｌ〇ａｙ§ｒｏｎｐｔｅｉｓ？售ＩＰｒｌｉｌｒａａｃｅｕａ｜ａＳｓｐｃｅＯ－图。１ＴＪ跨膜蛋白的结构密封了相邻上皮细胞间隙Ｏｃｃｌｕｄｉｎ和ｃｌａｕｄｉｎ是四次跨膜蛋白，ＪＡＭ为单次跨膜蛋白，斑块蛋白质（Ｐｌａｕｅｒｏｔｅｉｎｓ）如ＺＯ家族蛋白为转接器连接跨膜蛋白到周边肌动球蛋白环（ｅｒｉｕｎｃｔｉｏｎａｌｑ，作ｊｐｐ４７ＡＭＲ［］ａｃｔｏｍｏｓｉｎｒｉｎ，Ｐ）。资料来自Ｕｌｌｕｖｖｉｓｈｅｗａ（２０１１）ｙｇ等１１ 四川农业大学博士学位论文第一章绪论Ｆ１．ｉｃａｕｄｎｅａｓａｎａｎｄＪＡＭｓｌｉｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＴＪＴｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｏｔｅｉｎｓｓｕｃｈａｓｏｃｃｌｕｄｎａｎｄｌｉｔｔｒｉｎｅｓａｎｓｅａｌｇｐ（ｐ）（ｇｐ）ｔｈｅａｒａｃｅｌｌｕｒｔｅｔｈｅｌａｃｅ．Ｐｔｔｌａｓａｃｅｂｅｔｗｅｅｎａｄｊａｃｅｎｐｉｉｌｌｌｓｌａｕｅｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｕｃｈａｓｔｈｅＺＯｆａｍｉｌｙｒｏｔｅｉｎｓ，ａｃａｓａｄａｏｒｓｐｐｐｑｐｐｈａｃｏｎｎｅｃｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｏｔｅ．ｉｎｓｔｏｔｈｅｅｒｉｕｎｃｔｉｏｎａｌａｃｔｏｍｏｓｉｎｒｉｎｔｔｔｔｐｐｊｙｇ２．４．２ＴＪ参与肠屏障通透性调控的作用机理上皮细胞间ＴＪ在肠道中的的生物学功能主要是维持细胞间隙对大分子物质的通透性屏障作用，它的改变与多种肠道疾病，如炎性肠病、肠道肿瘤和感染性腹泻的发生、发展有关。研宄发现多种因素（应激、细菌毒素、促炎性细胞因子）会影响肠上皮细胞间的ＴＪ，其作用的机制多见于：１）ＴＪ蛋白去磷酸化发生内移或表达降低，ＴＪ“”“”结构维持不变但蛋白组成改变，ＴＪ蛋白使紧密的屏障特性被渗漏的特点取Ｔ－（ｍｏｓｉｎｌｉｈｔｃｈａｉｎＭＬＣ）憐酸化引起Ｆａｃｔｉｎ代，Ｊ结构变疏松２）肌球蛋白轻链，；ｙｇ骨架系统收缩牵拉细胞收缩，ＴＪ结构发生重排这两种ＴＪ的结构变化都会造成上皮；。细胞间通透性的增加，示意图见图２１．２．ＣｌａｕｄｉｎｓＴｉｈｔＴｍｔｍｇＪ＾ｃｏｍｐｏｏｅａｔｓｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ．：．．、Ｖ〇丨ＭＬＣＬｅａｋｙＴＪｃｏｍｐｃ＾ｅｍｓ／Ｎ．＼ＭＬＣＫＲＯＣＫ／ＲｈｏＡ？ＮＦ－ｋＢｙｙＶｖＩ｜＊ａ－ＣＩｙｔｏｋｉｎｅｓＴＮＦＦＮｙ图２细胞因子对细胞旁路通透性调控的机理．（１）ＴＪ响应细胞因子活化，结构维持不变但蛋白组成改变（２）ＴＪ结４８ｔ］）构的内在化是由于肌动肌球蛋白收缩。图片来自Ｃａｐａｌｄｏ等（２００９Ｆｉｕｒｅ２ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＴＪｒｅｍｏｄｅｌｉｎｂｃｔｏｋｉｎｅｓ．ＴｈｅｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆＴＪｒｏｅｒｔｉｅｓｂｃｔｏｋｉｎｅｓａｅａｒｓｔｏｒｏｃｅｅｄｇｇｐｐｙｙｐｐｙｙｐｈｒｏｕｈｉｒｓｒｅｔｖｅｒｅＪｔｔｔｗｏｄｓｔｉｎｃｔｏｃｅｓｅｓ，ｔｈｅｍｏｄｅｌｉｎｏｆＴＪｓｂｙｓｅｌｅｃｉｌｍｏｖｉｎｏｒｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎＴｃｏｍｐｏｎｅｎｓｏｒｈｅｔｇｐｇｙｇｇｗｈｏｌｅｓａｌｅｒｅｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇｏｆＴＪａｎｄａｃｔｉｎｎｅｔｗｏｒｋ．作为ＴＪ结构的重要参与分子，ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白分为非磷酸化和磷酸化两种形式。非隣酸化的ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白位于基底外侧膜和细胞质囊泡上，而憐酸化的ｏｃｃｌｕｄｉｎ仅限４９［１－于１７上，因此其憐酸化状态会影响ＴＪ结构的装配。在ＭａｄｉｎＤａｒｂｙｃａｎｉｎｅｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）细胞的研究中发现ｏｃｄｕｄｉｎ的磷酸化位点主要发生于丝氨酸、苏氨酸和酪４９［］ｉｌｉ氨酸残基上，ｏｃｃｌｕｄｎ蛋白的快速磷酸化使得ｏｃｃｕｄｎ蛋白朝着细胞间隙移位，促５０［］ＴＪ形成通透性。ｏｃｃｌｕｄＴＪ，ｉｎ过表达或突变严进，降低细胞间的以丝的状态构成重影响跨膜电阻（ＴＥＲ）。在哺乳动物体外和体内试验，当ＥＰＥＣ５１，５２［］￡ｓｃ／？ｍＷａｃｏ／／）感染触发ＴＪ解体时，ｏｃｃｌｕｄｉｎ的磷酸化状态降低。另外，在暴ＬＬＣ－ＰＫ１细胞上诱导产生了ＴＪ的断裂ｏｃｃｌｕｄｉｎＴｈｒ磷酸化露于巴豆油酯的，伴随着５３］［的快速减少，以上研究表明ｏｃｃｌｕｄｉｎ的磷酸化状态参与了ＴＪ装配与解体的调节过１２ 四川农业大学博士学位论文第一章绪论程，ｏｃｃｌｕｄｉｎ的磷酸化水平影响ＴＪ结构的通透性。在病理条件下，，通透性的增加使肠道中的抗原物质直接渗透到粘膜固有层中触Ｔ一，发该处细胞激活炎性细胞因子从而进步增加肠道的通透性，加重肠道的炎症（见图３）。炎性细胞因子是如何影响肠道的通透性呢？Ｂａｃｔｅｎａｌａｎ＾ｇｅｎｓｔＴｉｎａｃｔＪｂ３ｒｒｅｒＴＪｒ＾ｂａｒｉｅｒｊ＾？？ＴＪｄｉｓｒｕｐｔｋＷ鬌ＴＮＦ－ａｍｌ＼修Ａｃｔｉａｔ＼ｖｅｄ＼＇＼１ｃｅ＂ｒ－ｖ＾ＩＦＮＦＮ－ＩｒＡｃｔｖｉａｔｅｄｍａｃｒｏｈａｅｐｇ“”图３不完全肠上皮ＴＪ在肠道炎症中的作用。泄露的肠ＴＪ屏障允许入侵下层肠组织的抗原增加，外来的抗原４５［】被抗原呈递细胞处理后－。Ａ－，辅助Ｔ淋巴细胞和炎症反应被激活资料来源：ｌＳａｄｉ等（２００９）Ｆｏｅｎｅｉｕｒｅ３Ｐｒｏｏｓｅｄｒｏｌｅｆｄｅｆｅｃｔｉｖｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｉｔｈｅｌｉａｌｔｉｈｔｕｎｃｔｉｏｎｂａｒｒｉｅｒｉｎｔｈｅａｔｈｏｓｉｓｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｇｐｐｇｊｐｇ，％ｋｌｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｌｅａｋｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｉｈｔｕｎｃｉｏｎｂａｉｅｒａｌｌｏｗｓｉｎｃｒｅａｓｅｄａｉｅｎｉｃｅｎｅｔａｔｉｏｎｉｎｎｄｅｌｉｎｙｇｔｒｒｎｔｒｔｏｔｈｅｕｒｊｇｐｙｇ－．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｉｓｓｕｅＴｈｅｆｏｒｅｉｎａｎｔｉｅｎｓａｒｅｔｈｅｎｒｏｃｅｓｓｅｄｂｙｔｈｅａｎｔｉｅｎｒｅｓｅｎｔｉｎｃｅｌｌｓａｎｄｈｅｌｅｒＴｌｍｈｏｃｔｅｓａｎｄａｎｇｇｐｇｐｇｐｙｐｙｖａｉｎｆｌａｍｍａｏｒｒｅｓｏｎｓｅｉｓａｃｉｔｅｔｙｐｔｄ从目前研究来看，肠道受损情况下促炎性细胞因子对ＴＪ结构的影响，其作用机一制主要通过两条途径：是选择性移除或添加ＴＪ组成成分；二是重组ＴＪ和肌动蛋白４８５５［］［］（。Ｏｚａｋｉ等（－ｃｃｕｄｎ基网状结构见图２）１９９９）研究发现ＴＮＦａ降低了ｏｌｉ因的５６［Ｈａｎ２００３Ｆ－ＴＮＦ－－－表达。等（）＿ＩＮｙ、ａ及ＩＬｉｐ组成的复合因子与Ｃａｃｏ２共同培－－／ｍ－养后，发现肠屏障功能降低，ＺＯＲＮＡ表达减少，同时ＺＯ１、ＺＯ３和ｏｃｃｌｕｄｉｎ－－，还引起ＺＯ、１蛋白的表达也降低；此外１ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白以及Ｃｌａｕｄｉｎ蛋白在亚细胞－－水平的错误定位。培养液中添加ＩＬ１３，增加了体外培养的Ｃａｃｏ２细胞间隙对离子和Ｊ５７５８，１［ｃｃｕｄｎ基因和蛋白表达量的降低－大分子的通透性，伴随ｏｌｉ。通过ＩＬ６基因敲除Ｌ－６－的小鼠模型和体外培养添加Ｉ，研宄结果均发现上皮细胞间通透性的增加与ＺＯ１５９６Ｇ，［］的错误定位、肌动蛋白结构重装和肌动蛋白收缩增强有关。以上结果表明，促炎Ｊｏｃｃ－１性细胞因子可能通过对Ｔ关键分子ｌｕｄｉｎ和ＺＯ的表达、磷酸化及细胞骨架收缩参与动物肠道通透性増加的发生发展过程。，细胞收缩是导致ＴＪ结构重排引起屏障通透性增加的重要原因综上所述，主要受肌动蛋白（ａｃｔｉｎ）和肌球蛋白（ｍｙｏｓｉｎ）的影响，并依赖于肌球蛋白轻链ＭＬＣ的１３ 四川农业大学博士学位论文第一章绪论磷酸化。肠道这些关键蛋白的表达或磷酸化水平的改变可引起ＴＪ结构的解聚和重排，使肠粘膜的栅栏功能和选择性屏障功能发生改变，细菌／内毒素移位，从而影响肠道健康及动物的抗病能力。２．４．３参与调节ＴＪ的信号途径参与Ｔ一Ｊ装配和肠道通透性调节的是个复杂的的信号途径网络。胞外信号或激Ｔ一ＭＬＣ素对Ｊ进行调节，通常认为其调控机理集中在两个方面，第是对磷酸化的调节二是对参与ＴＪ结构构成的ＴＪ关键蛋白转录和表达水。那么，其调；第平的调节？目前对其结构调节所涉及的信号调节通路主要包括：ＰＫＡ信号途径控机理如何呢，－ｋＢ信号途径等Ｒｈｏ信号途径ＮＦ。，２．４．３．１ＭＬＣ磷酸化引起的细胞收缩６１［］ＭＬＣ磷酸化水平升高被认为是肠上皮屏障通透性增加的重要分子基础。故其作用原理为：当ＭＬＣ的第１８位苏氨酸和第１９位丝氨酸残基发生磷酸化后，活化肌球蛋白头部的ＡＴＰ酶，产生的能量使肌动蛋白微丝（ａｃｔｉｎｆｉｌａｍｅｎｔ）滑动，周边肌动球蛋白环ＰＡＭＲ收缩引起细胞发生向心性收缩而致屏障通透性增加。一方面－，ＭＬＣ的磷酸化主要受ＭＬＣＫ活性的调控，采用ＭＬＣＫ抑制剂ＭＬ７改善了肠梗阻引发的上皮ＭＬＣ的磷酸化、粘膜的损伤和大分子的通量，说明细胞旁６Ｑ路抗原通量的增加是由上皮ＭＬＣＫ活化所介导［］且ＭＬＣＫ介导Ｔ，并Ｊ通透性的改变主要是通过磷酸化ＭＬＣ实现对ＴＪ结构的调节，是胞外刺激因子（如细胞因子和一细菌）调节ＴＪ屏障的多种途径中至关重要的中心环节。另方面，肌球蛋白轻链磷酸酶（ｍｙｏｓｉｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＭＬＣＰ）在ＭＬＣ憐酸化的调控中也具有重要作用。ＭＬＣＰ催化磷酸化型ＭＬＣ向非磷酸化型转变，参与调节ＭＬＣ的磷酸化水平；Ｒｈ－其自身活性又受ｏ相关激酶（Ｒｈｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄｋｉｎａｓｅ，ＲＯＣＫ）的负性调控ＲＯＣＫ。一是种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是ＧＴＰ结合蛋白的Ｒｈｏ家族中ＲｈｏＡ的下游效应分Ｐ的ｍｏｓｎ结合亚Ｔｈ子。活化的ＲＯＣＫ对ＭＬＣｙｉ基第６９６位ｒ残基进行磷酸化修饰，＾使ＭＬＣＰ失活而不能将ｐＭＬＣ去磷酸化，导致胞质内ｐＭＬＣ的磷酸化水平增加。，影响ＭＬＣ磷酸化的信号途径均可能参与调节ＴＪ的通透性变化因此。－（１）ＮＦＫＢ／ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ信号途径一－ＮＦ－ｋＢ是种重要的核转录因子ｋＢ，其通常在胞浆中与抑制单位Ｉ形成无活性１４／ 四川农业大学博士学位论文第一章绪论ＴＮＦ－ａ－ｋＢ－ｋＢＩＦ的复合体。是肠粘膜损伤的重要启动因子，能通过磷酸化引起Ｎ的６２［］，激活与细胞应激相关的急性期蛋白活化和核转位，诱导多种细胞因子转录合成，一形成级联放大效应，进步破坏肠粘膜屏障各种促炎性细胞因子的产生亦对ＴＪ；而？６３［］－－蛋白结构进行破坏。Ｙｅ和Ｍａ证实ＴＮＦａ引起ＮＦｋＢ５０／ｐ６５二聚体与启动子下［ｐＫ转录启动ＭＬＣＫ一游ｋＢ结合区域结合，激活ＭＬＣ子，活化后进步引起肌球蛋白－ＭＬＣ，Ｚ０１蛋白移位以及ＴＪ（见图４）轻链磷酸化细胞骨架收缩导致蛋白结构开放；－ａ还－ａｕｄｎ－１另外，ＴＮＦ引起Ｚ０１表达和Ｃｌｉ磷酸化水平降低，使其从ＴＪ上解聚，进６４一［］－－步促使ＴＪ断裂。ＩＬ１Ｐ在肠炎放大级联反应中起中心作用。ＡｌＳａｄｉ等（２０１０）－－－在体外Ｃａｃｏ２肠上皮模型系统发现，ＩＬｌｐ诱导ＴＪ通透性的增加也是由ＮＦｋＢ旁路ＬＣＫＦ－基因转录的增加所介导的，，ＮｋＢ依赖的Ｍ。由此可见肠道炎症发生发展过程中的活化及入核所介导的ＭＬＣＫ转录的増加及活化对肠上皮细胞通透性的增加起到了关键的作用。－ｋＢ可能缓解由ＭＬＣ过度隣酸化对ＴＪ结构重排的影响由此，抑制ＮＦ。ＬＰＳ存６Ｔｕｍｏ－（ｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｔｏｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆａｃｔｏｒ６在时，，肿瘤坏死因子受体相关因子ｐＴＲＡＦ６－）自身发生泛素化，激活下游的ＩＫＫ及ＮＦｋＢ，启动基因的转录。研宄发现，－ｋＢＨＳＰ７０通过与ＴＲＡＦ６结合抑制ＬＰＳ刺激引起的ＴＲＡＦ６泛素化激活，从而抑制ＮＦ６５，６６１［信号通路。／ＷＷＷＷＷＮ＊、？ＴｃｏｍｐｌｅｘＪ＾５５三ＴＨＦＲ１ｏｅｎｉ▲ｐｎｇ▲▲ｆＵ人＿ｊ工？ｊ—ａｄｉｖ＊ｔ（ｏｎＭｌＣＫｍ？ＮＡ／／ＶＭｔｅＩＣＫｒｏｍｏ／ｐ－－４ＦｋＢｉｂｉｉｉ图活化的Ｎ转位到核内，与ＭＬＣＫ启动子区域的ｃｓＫＢｎｄｎｇｓｔｅ结合，活化ＭＬＣＫ基因转录和蛋白合成过程。ＭＬＣＫ蛋白水平的增加或活化引起ＭＬＣＫ触发的ＴＪ屏障的开放。资料来源：［５４］Ａ－（ｌＳａｄｉ等２００９）－－Ｆｉｕｒｅ４ＴｈｅａｃｔｉｖａｔｅｄＮＦｋＢｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓｔｏｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓｂｉｎｄｓｔｏｔｈｅｃｉｓＫＢｂｉｎｄｉｎｓｉｔｅｏｎＭＬＣＫｇ，ｇｒｏｍｏｔｅｒｒｅｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖａｔｅｓｔｈｅＭＬＣＫｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎａｎｄｒｏｔｅｉｎｓｎｔｈｅｓｉｓｒｏｃｅｓｓｐｇ，ｇｐｐｙｐ１５ 四川农业大学博士学位论文第一章绪论（２）ＲＯＣＫ／ＭＬＣＰ／ｐＭＬＣ一ＲｈｏＡ是一ａ种胞间连接完整性的关键调节子，属于ＧＴＰｓｅ的Ｒｈｏ家族成员之。６７［］ＲＲｈｏＡ的活化诱导ＴＪ拆解和内皮细胞单层通透性过高，抑制ｈｏＡ则显著抑制ＬＰＳ６８［］引起的ＴＪ的解体。ＲｈｏＡ的下游包括名为ｐｌ６０ＲＯＣＫ／ＲＯＫｂ／ＲＯＣＫＩ和ＲｈｏｋｈｏＲｈｏ－ＲＯＣＫｉｎａｓｅ／ＲＯＫａ／ＲＯＣＫＩＩ的Ｓｅｒ／Ｔｈｒ激酶家族。Ｒ相关激酶（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｋｉｎａｓｅ，）能直接隣酸化ＭＬＣ或ｍｙｏｓｉｎ憐酸酶结合亚基（ｍｙｏｓｉｎｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｔａｒｇｅｔｓｕｂｕｎｉｔ，，ＰＡＭＲ收缩。ＭＹＰＴ）抑制ＭＬＣＰ和ＭＬＣ２的过度磷酸化诱导，使胞间通透性增加低分子量的Ｒｈｏ超家族Ｇ蛋白是ａｃｔｉｎ细胞骨架形成的调节因子。相对于异源三一聚体的Ｇ蛋白，小ＧＴＰａｓｅ没有直接通过配体结合Ｇ蛋白偶联受体ＧＰＣＲ。然而，系列ＧＰＣＲ包括溶血磷脂酸和凝血酶的受体通过Ｒｈｏ依赖的旁路诱导应力纤维、黏着斑和细胞变圆ＲｈｏＲｈｏ－。Ｇｌ２／１３能引起依赖的响应。Ｇ２／１３能结合和活化特异性鸟１６９［］，激活Ｒｈｏ及其下游信号响应嘌呤交换因子通过这个机制ＧＰＣＲｓ偶联到Ｇ，１２／１３如图５所示。．＝Ｒｈｏ＋＊Ｃａ２ＣａＭ—人１ＲＯＣＫＭＬＣＫＭＬＣＭＬＣ－麟落（］｛ｊ＂＂＂＂＂＂＂ＯｒｏｅｉｎｓｔｈｅｒｐｔＶ？乂ＥＲＭ，ＣＰｈ７（）〇％＾＾Ｐｈｏｓｈａｔａｓｅｐ备ＬＫ一一ｆｔ一、Ａｃｔｏｍｙｏｓｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、＂＂、、、▲Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｒｖｉｖａｌ＾－〇＾５尺０（：匕￡＾哪１图１＜：对细胞功能的调节。刺激０蛋白偶联受体（０＃（１１）（，０？０１引起胞内叩）２＋ＣａＭＬＣＫ的活化－／ＣａＭＭＬＣＫ磷酸化ＭＬＣ，引起肌动蛋白介导的。肌球蛋白相互作用及细胞收缩、迁移、增殖和存活。ＧＰＣＲ的刺激也经由Ｒｈｏ鸟嘌呤交换因子（ｇｕａｎｉｎｅｅｘｃｈａｎｇｅｆａｃｔｏｒ，ＧＥＦ）引起ＲＯＣＫ活化。活化的ＲＯＣＫ憐酸化下游ＭＬＣＰ的肌球蛋白结合亚基ｍｏｓ－（ｉｎｂｉｎｄｉｎｓｕｂｕｎｉｔＭＢＳｙｇ，）。ＭＢＳ的磷酸化抑制ＭＬＣＰ活性引起ＭＬＣ磷酸化和肌动球蛋白活化。资料来自Ｌｉａｏ等（２００７）－－Ｆｉｕｒｅ５ＲｅｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎｂＲＯＣＫ．ＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆＧｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｔｏｒｓＧＰＣＲｌｅａｄｓｇｇｙｐｐ（）－ｔｏａｎｉｉｉ／ｌｉｉｉｉｉｎｃｒｅａｓｅｎｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｕｍｃａｌｍｏｄｕｎＣａＭｍｅｄａｔｅｄａｃｔｖａｔｏｎｏｆＭＬＣＫ．ＭＬＣＫ（）－ｍｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓＭＬＣｌｅａｄｉｎｔｏａｃｔｉｎｍｏｓｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎｉｒａｔｉｏｎｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｇｙ，ｇ，ｐ，ａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌ．ＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆＧＰＣＲａｌｓｏｌｅａｄｓｔｏＲＯＣＫａｃｔｉｖａｔｉｏｎｖｉａＲｈｏｕａｎｉｎｅｅｘｃｈａｎｅｆａｃｔｏｒＧＥＦ．ｇｇ（）－ｉａｈａａｉｏｄｏｅａｅｓｈａｉｉｉＡｃｔｉｖａｔｅｄＲＯＣＫｍｅｄｔｅｄｔｒｏｕｈｈｏｓｈｏｒｌｔｅｓｖｒｕｓｗｎｓｔｒｍｔａｒｇｔｓｕｃｓｔｈｅｍｏｓｎｂｎｄｎｇｇ，，，ｐｐｙｙｓｕｂｕｎｉｔＭＢＳｏｆＭＬＣｈｏｓｈａｔａｓｅ．ＰｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｏｆＭＢＳｉｎｈｉｂｉｔｓＭＬＣｈｏｓｈａｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｌｅａｄｉｎｔｏ（）ｐｐｐｙｐｐｙｇｉｎｃｒｅａｓｅＭＬＣｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎａｎｄａｃｏｍｏｓｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．ｔｐｐｙｙ１６ 四川农业大学博士学位论文第一章绪论一ＲｈｏＲＯＣＫ是种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是ＧＴＰ结合蛋白的家族中ＲｈｏＡ的－－Ｉ下游效应分子。ＦＮｙ激活肠上皮细胞ＲｈｏＧＴＰ酶，诱导ＲＯＣＫ表达上调，经ＲｈｆｏＡ／ＲＯＣＫ信号途径引起ＴＪ蛋白被内吞，发生重分布＾ＭＬＣＰ催化磷酸化型ＭＬＣ向非磷酸化型转变，从而调节ＭＬＣ的磷酸化状态，在ＭＬＣ磷酸化的调控中也具有重要作用，而ＭＬＣＰ活性又受ＲＯＣＫ的负性调控。活化的ＲＯＣＫ对ＭＬＣＰ上肌球蛋白结合亚基ＭＢＳ（即ＭＹＰＴ１）的第６９６位Ｔｈｒ残基进行磷酸化修饰，使ＭＬＣＰ失活而不能将ｐＭＬＣ去磷酸化，导致胞质内ＭＬＣ磷酸化水平增加。－ｋＢ－以上研宄表明，ＭＬＣ的磷酸化受到ＮＦ、ＲＯＣＫ等信号分子的调节，抑制ＮＦｋＢ及ＲＯＣＫ的活化可以缓解由ＭＬＣ过度磷酸化造成的ＴＪ结构的重排。那么，是否存？？在其它信号途径参与ＴＪ屏障功能的调节呢它们之间是否存在上下游的关系呢－ｋＢ信号分子的调节，对于ＮＦ研究发现ＬＰＳ存在时，ＴＲＡＦ６自身泛素化，激活６５［］－ｋＢ，２００６）ＨＳＰ７０下游的ＩＫＫ及ＮＦ，启动基因的转录；然而陈华群（研宄指出通过与ＴＲＡＦ６结合抑制ＬＰＳ引起的ＴＲＡＦ６自身泛素化的激活，从而抑制ＩＫＫ及ＮＦ－示ＨＳＰ７０可能是调控ＮＦ－ｋＢ活化水平的上游靶点ｋＢ信号通路的活化。；提２Ａ３．２ＴＪ蛋白表达的调节途径（１）Ｇ蛋白偶联受体（ＧＰＣＲ）介导的ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径２＋１ＧＰＣＲ可以通过Ｃａ／ＣａＭ，如．３．１中所述，调节ＭＬＣ的磷酸化，但是研宄发现ＧＰＣＲ介导的ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径也可通过改变ＴＪ的结构减少细胞旁路对离子的通７２一［］ＰＫＡ信号透性。长久以来，直被认为可以调节上皮和内皮细胞旁路的开放。增７３［一］加细胞ｃＡＭＰ水平，星形胶质细胞单层ＴＥＲ值增大。ｃＡＭＰ以种快速而可逆的３７４［７’］ｔｔ）方式稳定ＴＪ，ｃｉｏｎａｌｓｒａｎｄｓ。，降低通透性增加缝隙连接线（ｊｕｎ的复杂性在ｒｏｃｔｅｓＴ－ＰＫＡ上皮细胞系如ｔｈｙｙ、肝细胞和结肠上皮细胞系８４上，的活化促进了由２＋［７５７６２＋］［］ＣＴＣａ开关触发的ＴＪ屏障的重建，并逆转由氧化应激、胞外ａ去除产生的Ｊ７７［］断裂。分析其原因，可能与ＰＫＡ调节ＲｈｏＧＴＰａｓｅ活力，引起ＲｈｏＡ活性抑制和７８１］ａｃｔｉｎ细胞骨架的稳定，从而增强内皮屏障的功能有关。ＲｈｏＡ的活性被乙二腈以一７９ＡＭＰＡ［］ｃ／ＰＫ依赖的方式所抑制也支持了这猜测。８Ｇ［］－与此相反的ａｗｅｄｉａ等（２００８）试验采用唾液腺上皮细胞ＳＭＧＣ６为研究模，Ｋ２＋型，结果显示Ｈｇ通过激活ＰＫＡ信号途径降低了ＴＪ的物理屏障功能；但是ＰＫＡ抑２＋制剂只部分缓解了该作用，说明还有别的激酶依赖的或非激酶的途径在Ｈｇ对ＴＪ通１７ 四川农业大学博士学位论文第一章绪论，ＰＫＡ导致了ｌｕｄＴ透性的调控中起作用。在分子水平上ｏｃｃｉｎ的ｙｒ残基憐酸化，使其２＋脱离于ＴＪ从而增加细胞旁路的通透性。Ｈｇ激活的信号转导旁路涉及ＰＫＡ，但独立－于ＭＬＣＫ、ＰＫＣ和酪氨酸交联机制。Ｔｒｉｔｏｎ１００不溶（细胞膜）部分的ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白’表达量在２＋Ｈｇ处理后降低，添加ＰＫＡ抑制剂可以部分阻止其降低，通过考察细胞总２＋ｃｃ蛋白中ｏｌｕｄｉｎ的含量发现ｏｃｃｌｕｄｉｎ的表达量不变，提示ｏｃｃｌｕｄｉｎ在Ｈ处理下并不ｇ一引起降解，ｃｃｌｕｄｉｎ，而是在细胞上的分布发生了改变而这改变是ＰＫＡ依赖性的。ｏ的磷酸化调节了ｏｃｃｌｕｄｉｎ从胞浆到ＴＪ的募集，以及ＴＪ到胞浆的穿梭过程。从以上研宄可知，ＰＫＡ在不同细胞中活化后可增强ＴＪ屏障功能，也可能会有相反的作用效果，但是可以确定的是ＧＰＣＲ偶联的ＰＫＡ信号途径参与对ＴＪ通透性的调节。（２）ＥＲＫ１／２信号通路肝细胞生长因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＨＧＦ）刺激ＭＤＣＫＩＩ，能激活ＥＲＫ１／２，－ＴＪ蛋白Ｃ－导致ｌａｕｄｉｎ２的表达量下降ＥＲＫ１／２的激活，Ｃｌａｕｄｉｎ２的表达量显著；阻断８１］［氧化应激激活ＥＲＫ升高；１／２信号途径，导致ＴＪ相关蛋白表达的降低，并使ＴＪ的８２［］上结果表明机体组织细胞可能接收外部信号刺激激活ＥＲＫ屏障功能下降；以１／２，改变ＴＪ关键蛋白的表达，实现对组织屏障功能的调节。Ｈ２０２引起ＥＲＫ１／２发生磷酸Ｔ－化，Ｊ蛋白ｏｃｃｌｕｄｉｎ的Ｓｅｒ残基发生过憐酸化，导致ｏｃｃｌｕｄｉｎ在内皮细胞细胞连接－处发生重排，表现为ｏｃｃｌｕｄｉｎ在细胞表面重分布的改变以及与Ｚ０１蛋白的解离；以上Ｈ２０２的作用被ＭＥＫ抑制剂ＰＤ９８０５９所取消，表明Ｈ２０２通过ＥＲＫ１／２信号途径影８３［］－响ＴＪ蛋白的定位和分布进而引起内皮通透性的增强。ＴＮＦａ激活ＥＲＫ１／２信号旁－－路，激活转录因子Ｅｌｋ１ｌｋＫ启，Ｅ１的核转位发生后与ＭＬＣ动子结合基序结合，激８４ＬＣＫ启［］ＥＲＫ活Ｍ动子的活性及基因转录。研宄表明，１／２信号能够通过降低ＴＪ关键蛋白的表达或者改变ＴＪ复合物的组成和分布实现对ＴＪ选择性屏障功能的调节，ＥＲＫ１／２信号途径具体的作用机理受到不同细胞、不同刺激的影响而可能有所不同。ＡＥＲＫ－综上所述，ＰＫ信号途径参与了ＴＪ表达和结构的调节ｋＢ、ＲＯＣＫ和；ＮＦ？信号通路的活化通过磷酸化ＭＬＣ增强ＴＪ屏障的通透性。２－．５ＧＬＰ２对ＴＪ调节的研究现状６［１Ｍｏ－－－ｒａｎ等（２０１２）发现ＧＬＰ２增加ＴＮＦａ作用的Ｃａｃｏ２细胞的跨膜电阻以及ｍ－－ｏｃｃｌｕｄｉｎ和ＺＯ１蛋白表达２０１２）；蒋义等（发现ＧＬＰ２可以促进离体培养的断奶１８ 四川农业大学博士学位论文第一章绪论ｃｃ－仔猪空肠紧密连接ｏｌｕｄｉｎ、ＺＯ１和ｃｌａｕｄｉｎ的表达，ＭＥＫ／ＥＲＫ１／２介导的ｐ９０ＲＳＫ一的磷酸化可能是ＧＬＰ－２调控肠道ＴＪＧｏｏｄｍａｎ等蛋白表达的重要信号通路之；（２００９）８５［］ＰＨＳＰ研宄发现激活ＥＲＫ级联信号，可增加ＨＳ７０的蛋白水平。因此，结合７０对６５１］ＮＦ－ｋＢ的抑制作用ＭＥＫ／ＥＲＫ１／２信号途径可以促进ＴＪ蛋白的表达，我们推测胞内，－ｋＢ。还能通过ＨＳＰ７０抑制ＮＦ，参与调节ＴＪ的结构重排－ＬＰ－总之，首先，ＧＬＰ２需要与Ｇ２Ｒ特异性结合才能发挥其促肠上皮生长及修复的作用，其对细胞活动的调节主要经Ｇ蛋白偶联的ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径介导，而－－－ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、ＩＧＦ１参与的Ｗｎｔ／ｐｃａｔｅｎｉｎ信号途径和酪氨酸蛋白激酶介导的细胞外信＠］。号调节激酶ＥＲＫ１／２等信号通路对其进行补充其次，从目前关于调节ＴＪ涉及的８（）８７［］［］－信号途径的研宄成果来看，主要涉及了ＰＫＡ途径、ＭＡＰＫ信号途径和Ｈ３Ｋ／Ａｋｔ一信号途径＠］些信号转导途径与己知ＧＬＰ－，这２的信号转导途径高度致。再次，ＭＬＣ８９ｔ］ＭＬＣ磷酸化水平升高也被认为是肠上皮屏障通透性增加的重要分子基础。磷酸化ＮＦ－ｋＢ主要受ＭＬＣＫ活性的调控。在肠炎发生时，／ＭＬＣＫ信号途径介导的ＭＬＣ的５７６３’１［磷酸化对ＴＪ的调节可能起到了关键的介导作用。另外，ＭＬＣ的磷酸化还受到＿ＲＯＣＫ负向调控的ＭＬＣＰ的调节。３存在的问题－？？）２１ＧＬＰ对断奶仔猪生产性能的改善是否有效其生理效应体现在哪些方面－２）ＧＬＰ２能否维持应激状态下ＴＪ结构的稳定以缓解断奶仔猪肠粘膜屏障由于ＬＰＳ应激造成的损伤及炎症的发生？）－３如果假设２成立，ＧＬＰ２的信号转导途径如何？相互之间是否存在上下游的关系呢？－识－基于对ＧＬＰ２及ＴＪ信号途径相关认，我们提出以下可能参与ＧＬＰ２对ＴＪ信（ＬＰ－号传递的途径假说见下图６）：１．胞外信号的传递：Ｇ２Ｒ／ＣＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径２Ｐ－．胞内信号的传递：ＭＥＫ／ＥＲＫ１／２、ＨＳ７０信号途径３．核内的转录调节：ＮＦｋＢ／ＭＬＣＫ信号途径４．蛋白磷酸化水平的调节：ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ、ＲＯＣＫ／ＭＬＣＰ／ｐＭＬＣ信号途径。这些途径是如何影响调控肠道通透性的改变尚待研宄阐明。１９ 四川农业大学博士学位论文第一章绪论－ＩＧＬＰ２１？｛ｍｍｎ＼ＧＬＰ－２Ｒ°°＊°麵内ｒ＾，？－—ＴｃＡＭＰＫＡ／ＰＩ，｜，ＩＩＩｉ，￣￣—＊ｉｒ！ＨＳＰＭ７０ＩＥＫ／ＥＲＫ１｜ｊ■－轉１￣＋！ｉｉＮＦ－ｋ１Ｂ＝ｊＮＦ－ｋＢ／ＭＬＣＫＲＯＣＫ／ＭＬＣＰＶ｜）｜｜｜ＭＬＣｌ＊Ｒｉｔ｜ＭＬＣ的￥酸化ｌ［ｊｊ｜｜＇ｌ＿＿＿Ｌ￣４ＩＴＪ结构松ｇ１ｉＩＩ达＇＾［ｉＩＴＪａａｆｔｉｉ，７图６ＧＬＰ－２对ＴＪ信号传递的途径假说Ｆ－ｉｕｒｅ６ＰｒｏｏｓｅｄａｔｈｗａｓｂｗｈｉｃｈＧＬＰ２ｍｅｄｉａｔｅｄｔｈｅｔｉｈｔｕｎｃｉｏｎｓｉｎａｌｉｎｇｐｐｙｙｇｔｇｇｊ２０ 四川农业大学博士学位论文第二章研究目的、意义、内容和技术路线第二章本研究的目的、、意义内容和技术路线１．研究目的ＬＰ－２－２１．１阐明Ｇ对应激造成肠道损伤后的微观结构的影响，以及ＧＬＰ与肠道炎－症之间的关系，探讨ＧＬＰ２影响肠道健康的营养生理效应。－Ｔ１．２提出ＧＬＰ２调控肠道Ｊ表达及结构重排的分子机理，深化肠道粘膜营养调控理论。２．研究意义一２－．１研宄并阐明ＧＬＰ２对肠道通透性的影响及其作用机制不但有助于我们进步认识应激导致肠道通透性改变和肠炎发生的机理，更为重要的是，可将我们对一ＧＬＰ－２的认识从促进肠道发育、改进肠道吸收等肠营养效应进步拓展到维护肠粘膜屏障、降低肠道损伤、保障肠道健康等方面；同时为我们通过营养、基因调控的手段调节ＧＬＰ－２信号转导途径关键蛋白的表达，维持肠道结构功能的完整，实现对畜禽，极大促进了肠粘膜营养调控理论的发展肠道健康的维护提供理论依据。２２实践上ＬＰ－２在细胞水平．，掌握了Ｇ、机体水平上的营养生理效应及规律，可－、以为我们开发ＧＬＰ２作为肠道损伤修复或肠道保护的功能性营养制剂提供依据，－为使用ＧＬＰ２缓解应激状态下动物肠炎的发生、发展乃至生产性能的下降提供试验一－２支持，或为将来进步开发ＧＬＰ信号转导途径上的关键蛋白为新的调控靶点提供新的思路。３．研究内容－３１２，．动物试验主要探索ＧＬＰ处理对断奶仔猪应激状态肠道的保护作用重点探讨ＧＬＰ－２与肠道ＴＪ蛋白以及肠道炎症发生之间的关系＿３－．２细胞培养试验探讨ＧＬＰ２调节肠上皮细胞间ＴＪ表达和结构重排以及细胞间通透性变化的分子机制－２（研宄ＧＬＰ信号从胞外到胞内、胞内到细胞核的关键调控靶点）。２１ 四川农业大学博士学位论文第二章研宄目的、意义、内容和技术路线４．技术路线本研究采用动物营养学传统的断奶仔猪词养试验和分子生物学研宄的细胞培养－试验的方式进行，其中动物词养和屠宰试验主要探索ＧＬＰ２与断奶仔猪肠道适应的－，ＬＰ２与肠道ＴＪ蛋白以及肠道炎症之间的关系基本规律的关系重点探讨Ｇ，而细胞ＬＰ－２调节断奶仔猪肠道ＴＪ及通透性变化的分子机制培养试验则主要探讨Ｇ。拟开展一－以下试验：试验、外源ＧＬＰ２对断奶仔猪肠道发育及生产性能的影响试验二、；－２对ＬＰＳ应激的断奶仔猪肠粘膜屏障损伤的作用ＬＰ－２外源ＧＬＰ；试验三、Ｇ对应激一－Ｊ２肠上皮细胞间通透性的调控作用及分子机制研宄：（）研宄模型的建立的ＩＰＥＣ；（二）－ＬＰ－－ＧＬＰ２对Ｓ应激下ＩＰＥＣＪ２细胞单层通透性的分子机理研究，明确ＧＬＰ２对ＴＪ蛋白表达及超微结构分布的调节作用，并确定ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ在细胞单层通透性调节的地位ＬＰ－２Ｔ－（三）ＧＪ：ｋＢ信号途径；影响屏障功能的分子信号途径包括ＮＦ－ＬＣ磷酸化水平的作用ＲＯＣＫ／ＭＬＣＰ－在ＧＬＰ２调控Ｍ；／ｐＭＬＣ信号途径在ＧＬＰ２调节ＭＬＣ去磷酸化过程的作用ＥＫ／ＥＲＫ１／２信－２ＴＪｐ；Ｍ号途径对ＧＬＰ调节的作用；以及Ｇ蛋白偶联的ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径对ＧＬＰ－２调节ＴＪ的作用。技术路线见下图７。．ｗ．、２８日龄断奶仔猪ｍｕ是ｆ．．系－１ＰＥＣ２Ｊ…．．ｃ丨扣ｒ以－了ＧＬＰ２Ｒ检測｜丨断奶仔猪生产性能一＾Ｉ｜―ｒ？②「ｊ．．■ｉ＇＂症及屏障通透性的学指标＇肠道消ｉｆｗ．．．；变化化吸收相关蜂活；ｈＨ■■■ＶＶｊ＂ｉＩ单，，「ＳＳＳＴＰｋａ活性］ｆｓｌ１＾？＾此！—Ｊｐ核＃位进性变化，：：１ｓ关键］蛋白超关键Ｔ蛋白表］ｉｔｉｕ微结＾变化达童的变化ＭＫＫ／ＥＲＫ１／２．ＭＬＣＫＩｆ［｜①織Ｌ－１１亡￣￣￣１＾ＭＨＫ５１＾。肠粘膜ＭＪ＾ＫＭＬＣ２ＣＫ／／ｐｆ？＾ＳＶ丨Ｉｉ丨｜＇Ｉ緊密连接－ｊ￡７！％．＊？Ｓ§ＺＯ－？白１和§Ｈ吾；含§§＾－ＭＬＣ磷酸ＺＯ－１．ＧＬＰ２对１和ｏｃｄｕｄｉｎ蛋白新奶仔猪的营养白的表达＞ｐ＇生理故应１＜卜丨平丨表达与结构分布＿一—＿＾＿＿１’ｊ化》—１一￣－２．ＬＰ：２能考察Ｇ否缓解肠道Ｉ炎症的发生－＋，且其作用机制ＧＬＰ２对１白表达］景？是否与Ｔ信号有关的调ＧＬＰ－２对Ｔ结构重排的调节途径Ｊ＜备径］一＇’？一一＾——＾一—一一一二＾＊仁二二二二ＺＺＺＺＩＩＩＩＩＺＺ二■通过动物和细胞培养试验Ｐ－２调控断奶仔猪肠道细胞紧密连接及肠道，探讨并提出ＧＬ适应的分子机制图７技术路线图Ｆｉｕｒｅ７Ｔｅｃｈｎｏｌｏｒｏａｄｍａｏｆｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｇｇｙｐ２２ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄试验一第三章试验研究一－试验：ＧＬＰ２对断奶仔猪肠道发育及生产性能的影响１．前言仔猪断奶肠道综合征表现为肠道酶活降低、形态学不正常，给生产带来严重经济损失５，导致。消化酶包括胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活力在断奶后第天降至最低９１［］肠道消化不良。防止肠绒毛萎缩可增强养分的消化吸收从而改善断奶仔猪的生产性９２一［］－能。ＧＬＰ２是种３３个氨基酸组成的胰高血糖素衍生肽，由肠道Ｌ内分泌细胞合成分泌的特异性肠道营养激素ＬＰ－２能改善胎猪和新生仔猪的肠道发育。研宄表明，Ｇ２（）９３３（）［，］［］。在断奶仔猪上，血，并在肥胖小鼠的肠道适应性变化过程中发挥调节作用９４［］－显著降低显著增高浆ＧＬＰ２浓度伴随断奶相关的厌食而，，并随着采食量的恢复而－表明断奶后ＧＬＰ２的水平可能受到肠内营养的调控从而影响动物肠道的发育。考虑９５［］－２能促进肠上皮细胞的增殖和分化－到ＧＬＰ，我们假设外源ＧＬＰ２能通过促进肠道，发育，保护肠粘膜免受断奶后的应激损伤改善断奶仔猪的生长发育。基于目前关于一ＧＬＰ－２对断奶仔猪促生长作用的相关报道相当有限，且存在不致的研究结果，本试％＇ｔ］（？．ＰＳ）验将采用Ｌｉｕ等（２００８）方法使用大肠杆菌内毒素ｆｏｃ／ｚｍｃ／ｚ／ａｃｏ／／ＬＰＳｊｃｏ／／ＬＰ－２，对断奶仔猪生产性能建立肠道损伤模型研究外源ＧＬ，以及ＬＰＳ应激后肠道形态学和酶活力变化的作用。２．材料与方法２．１试验动物及试验设计６±ｘ长ｘ试验选取初始体重为．８０．４ｋｇ的２８±２日龄断奶杜大三元杂交阉公仔猪４０＇ＬＰＳ处理组、ＬＰＳ＋ＧＬＰ－２＋头，：组和ＬＰＳ，随机分到４个处理组中分别为对照组、低－２组高ＧＬＰ，每个处理１０个重复，每个重复１头猪。仔猪采取单笼词养的方式。试验期从断奶当天幵始，为期１５ｄ。仔猪断奶后每组分别根据初始体重按不同注射剂量－＇１Ｌ－（０、０、２和ｌＯｎｍｏｌｋｇｄ）连续７ｄ通过颈部皮下注射含ｈＧｌｙ２ＧＬＰ２Ｋ３４的无菌［］ＰＢＳ溶液，每日２次，分别于８：００和２０：００进行注射，单次注射体积为ｌｍＬ。不同２３ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄试验一－２浓度的ＧＬＰ溶液根据仔猪的初始体重、注射体积和单次注射剂量进行配制。ｈＧＧＬＰＧＬＰ－２２Ｖａｌｌ二肽Ａ＾是的类似物，因为第位的被取代为Ｇ，可以抵抗ｔＷｊｙ１８［］－－基肽酶的酶解作用，延长ＧＬＰ２的半衰期。停止注射ＧＬＰ２溶液后再继续词养７—１．天，ｋ，对照组仔猪进行腹腔内注射无菌生理盐水其余三组按１００Ｋｇｇ体重腹腔内注射含Ｅｃｏ＾ＬＰＳ的无菌生理盐水造成免疫应激和肠道损伤。２．２饲养管理试验在四川农业大学动物营养研宄所教学科研基地进行。试验期间控制室温在°一２６Ｃ在６０％？７０％。每日清扫猪圈，２００，相对湿度次每隔４ｄ用１：的百毒杀对猪舍一次进行喷雾消毒。动物日粮使用商品仔猪颗粒料。本试验中仔猪从２１日龄开始自由接触所饲商品仔猪料。每天７：００、１１：００、１５：００和１９：００左右词喂，每次喂料量以９７［］？１０１５）。Ｚｈｕ２０１３料槽中有少量余料（约ｇ为宜，自由饮水根据等（）的研宄，ＬＰＳ？在注射后（断奶后１４ｄ１５ｄ），为了避免ＬＰＳ导致的采食量降低对肠道特征造２０／ｋ成的可能影响，四个处理组均按重进行饲喂。ｇｇ体２．３试验仪器和试剂２．３．１试验仪器－－２００８（上海、２８ｉｃ、ｙ计数器ＦＪ精密仪器仪表有限公司）石蜡切片机（ＲＭ１２，Ｌｅａ）－Ｎｉｋｏｎ５０ｉＢＦ荧光生物显微镜（ＮｉｋｏｎＣｏ．，Ｊａｐａｎ）、冷冻离心机（Ｌｅｇｅｎｄｍｉｃｒｏ１７Ｒ，ＴｈｅｒｍｏＵＳＡ－）、超纯（ＭｉｌｌＢｏＣｅｌｌＳＡ）、７２２、，水系统ｉｐｏｒｅｉ，Ｕ型智能分光光度计水浴锅等。２．３．２主要的试剂（纯５％－度＞９（ＨＰＬＣ））、ＧＬＰ２放射免疫检测试剂盒，均购自美国ＰｈｏｅｎｉｘＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ公司；Ｅｓｃ／ｚｅｈｃＷａｃｏ／／ＬＰＳ，购自美国Ｓｉｇｍａ公司；考马斯蛋白检测试剂盒ｌｋａｌｉｎｅｈｏｓｈａｔａｓｅ，ＡＫＰ）活、碱性憐酸酶（ａｐｐ性测定试剂盒、＋＋Ｎａ－Ｋ－ＡＴＰ■－－ａｓｅ活性测定试剂盒、ｙ谷氨酰转肽酶（Ｙｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ｙＧＴ）活性测定试剂盒、脂肪酶活测定试剂盒、淀粉酶活测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研宄所。多聚甲醛、酒精。、氯化钠等均为国产分析纯试剂２４ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄试验一２．４样品米集２．４．１血液采集？处理和样品采集流程图见图８。分别于断奶后第０、７、１４天早上使用医用无菌ＧＬＰ－２的基础水平２注射器通过前腔静脉空腹采血用于测定血浆。采血管中提前按／ｍＬ血ＴＡ抗凝齐ＩＪ４００ＫＩＵ／ｍＬ血ａｒｏｔｉｎｉｎｍｇ液加入ＥＤ，并按液加入ｐ蛋白酶抑制剂。将采集的血液注入预冷的采血管中轻轻摇动数次以抑制蛋白酶的活性。静置３０ｍｉｎ°ｘ５ｍ－后５０〇离心１ｉｎ，收集血衆于２０Ｃ保存待测。１ｇＳＧＬＰ－２ｔｏｐｐｅｄａｄｍｉｎｉｔａｔｉＬＰＳｓｒｏｎｊ＾７ａｅｒｗａｎｎａｅｗｃａｏｄｆｔｅｉｇ１４ｄｆｔｒｎｉｇＴｈ—ｅｉａｙ＞ｄｗｅａｎｎｇｓａｃｒｉＧｃｅｄＯｄ７ｄ１４ｄ１５ｄｊ－－ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓａｍｐｌｅＢｏｄｙｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｆａｓｔｉｎｇｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｉｎｇｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ图８处理及样品采集流程图Ｆｉｆｌｆｔｅｎｔａｎｄｓａｍｌｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏ．ｉｇｕｒｅ８Ｔｈｅｔｍｅｏｗｃｈａｒｔｏｒｒｅａｔｍｐｎ２．４．２组织样品采集注射ＬＰＳ溶液２４ｈ后，即于第１５ｄ通过皮下注射戊巴比妥钠（５０ｍｇ／ｋｇＢＷ）麻醉仔猪并处以安乐死，打开腹腔迅速取出小肠置于预冷的生理盐水中，剥离肠系膜并分别于十二指肠与空肠结合部、回肠与盲肠结合部结扎进行肠道分段。从十二指肠°入－８０Ｃ保存待测和空肠中段取出约２ｇ食糜装入１．５ｍＬＥＰ管，于液氮中速冻后转。用无菌生理盐水清洗十二指肠、空肠和回肠段，用滤纸蘸千多余水分后分别进行称重并记录；分别在十二指肠中段、空肠中段和回肠中段采集约４ｃｍ样品，用ｐＨ７．２，ｘ０．１ｍｏｌ／Ｌ的ｌＰＢＳ磷酸盐缓冲液溶液轻轻漂洗后置于装有４％多聚甲醛的玻瓶中保存，用于组织形态学分析；然后用玻片分别于十二指肠中段和空肠中段刮取肠粘膜，°－Ｃ分装后液氮速冻，之后于８０保存待测。２．５测定指标及方法２．５．１生产性能指标分别于断奶第０、７和１４天早上７：００进行空腹称重，每日记录采食量，用于计算各组仔猪每周和试验全期的平均日增重（ａｖｅｒａｇｅｄａｉｌｙｇａｉｎ，ＡＤＧ）、平均日采食量（ａｖｅｒａｅｄａｉｌｆｅｅｄｉｎｔａｋｅＡＤＦＩａｉｎ：ｆｅｅｄｒａｔｉｏ，Ｇ：Ｆ）ｇｙ，）和增重／耗料比（ｇ２５ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究试验一２．２．５消化吸收相关的酶活参照Ｍｏｆａ等（１９７０）的试验方法制备肠粘膜酶提取液。具体操作为：取出ＥＰ管中的肠粘膜样品，，于分析天秤上称重记录后转移至玻璃匀浆器中进行手动研磨将研磨好的样品按１０倍体积（ｗｔ／ｖｏｌ）加入预冷的Ｏ．ｌｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，然后使用超°声波细胞破碎法制备肠粘膜匀浆。分别将制备的肠粘膜匀浆和采集的食糜于４Ｃ条件下，２０００〇ｘｇ离心３０ｍｉｎ，收集上清用于测定蛋白含量和酶活。样品的酶活力使用该／样品相应的蛋白浓度进行校正，表示为Ｕｇ或Ｕ／ｍｇ蛋白。肠粘膜和肠道食糜的蛋白浓度采用考马斯亮蓝蛋白测定法进行检测，以牛血清白蛋白作为标准蛋白，制作标准曲线。酶活的定义如。酶活的检测则按试剂盒说明书的试验步骤采用比色法进行测定下：°ＡＫＰ：１个酶活力单位为每克肠粘膜蛋白于３７Ｃ条件下在１５ｍｉｎ内分解１ｍｇ苯酚所需的酶量；＋＋°Ｎａ－Ｋ－ＡＴＰａｓｅ：１个酶活力单位为３７Ｃ条件下，每毫克肠粘膜蛋白在１ｈ内分解ＡＴＰ产生１ｐｍｏｌ无机磷所需的酶量；°－Ｃ条件下ＹＧＴ：在３７，每毫克肠粘膜蛋白在ｌＯｍｉｎ内分解１ｐｍｏｌ对硝基苯胺所需的酶量为１个酶活力单位；°淀粉酶：在３７Ｃ条件下，每毫克肠食糜蛋白３０ｍｉｎ内分解１０ｍｇ淀粉所需的酶量为１个酶活力单位；°脂肪酶：在３７Ｃ条件下，每毫克肠食糜蛋白ｌｍｉｎ内分解ｌｐｍｏｌ甘油三酯所需的酶量为１个酶活力单位。２．５．３形态学分析将４％多聚甲醛固定的十二指肠、空肠、回肠中段样品经脱水、浸蜡、包埋、切－－片（４ｍ）等处理后，进行苏木精伊红染色，使用尼康５０ｉＢＦ荧光生物显微镜观察ｐａｅ－Ｐｏｌｓ小肠粘膜结构，绒毛高度和隐窝深度采用ＩｍｇｒＰｕ图像分析软件进行分析测定。’在１０〇ｘ放大倍数下，每张切片选取１０根走向平直的绒毛对其绒毛高度和隐窝深度进行测定。绒毛高度是从绒毛隐窝的结合处到绒毛顶端的垂直距离，而隐窝深度则是从９９［］，隐窝的开口到隐窝基部的垂直距离。结果用１０根绒毛的均值表示计算绒毛高度与隐窝深度的比值（ｖｉｌｌｕｓｈｅｉｇｈｔ／ｃｒｙｐｔｄｅｐｔｈｒａｔｉｏ，ＶＣＲ）。２６ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究试验一２－．５．４血浆ＧＬＰ２浓度检测－２放射免疫试剂盒对血浆中ＧＬＰ－２使用ＧＬＰ的浓度进行测定，按试剂盒说明书的试验方法进行操作ＧＬＰ－２。该试剂盒能识别包括人和猪类似物的形式。２．６数据处理与统计分析±Ｐ〇〇ＥＭＬＰ－２试验数据均以平均值ｌｅｄＳ表示。以Ｇ注射剂量作为主效应，采用－ＳＰＳＳ１７．０软件进行ＯｎｅｗａｙＡＮＯＶＡ单因素方差分析，不同试验组间平均值采用ＬＳＤ＜法进行差异显著性检验，以Ｐ０．０５表示差异有显著性意义。３．结果３．１生产性能不同处理（ＬＰＳ应激前）对仔猪体重ＢＷ、ＡＤＦＩ、ＡＤＧ和Ｇ：Ｆ的影响结果见表－－＝１。由表可知，与ｐｒｅＬＰＳ组相比，低剂量ＧＬＰ２处理有增加仔猪末重的趋势（Ｐ０．０６１），＝－２显著增加了仔猪末重而高剂量ＧＬＰ（户０．０２２）。ＡＤＦＩ在各组间差异不显著，低－＝＝￣￣Ｐ２处理均显著提高了０７ｄ（尸０．）７１剂量和高剂量的ＧＬ．０１３＆００１９、４ｄ（尸＝－？ＤＧ０１４００１８＆００３）。ＬＰＳ．０５２＆０．００４）以及０ｄ（尸．０．的Ａ与ｐｒｅ组相比，低剂ＬＰ－２０？７ｄＦ显％和２０１８１％尸＜尸＜量和高剂量Ｇ分别使的Ｇ：著提高了８．７８．（０．００１和一－０．００１），低剂量和高剂量ＧＬＰ２组：；继续饲养周后仔猪的ＧＦ分别提高了１６．５４％＞－＝＜丨－和２６．４７％（尸０），１．００５和尸０．００１；就全期而言低齐」量００２组和高齐！］量０＾２＝＜组仔猪的Ｇ：Ｆ分别提高了１７（尸）。．４３％和２３．６７％０．００１和尸０．００１２７ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄试验一－表１１１丨２０１＾２．４对ＬＰＳ应激前断奶仔猪生产性能的影响｜＾＞］１；１＊ｏｗｔｈｏｅｆｏｅＴａｂｌｅ１ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｈＧｌ２ＧＬＰ２＿ｏｎｔｈｅｒｆｗｅａｎｅｄｉｌｅｔｓｂｒｅＬＰＳｃｈａｌｌｅｎＩ３４ｇ［ｙ］ｐｇｇ项２３目丨ｔｅｍ处理Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ比较Ｃｏｎｔｒａｓｔ—Ｐｏｏ麵ｌｅｄＬＰＳ＋ＬＬＰＳ＋ＨＰｐ－ＬＰＳＳＥＭ１２３ｒｅＣＧ－－ｏｎｌＬＰ２ＧＬＰ２ｔｒｏ￣福涵６？７８６＾８２６＾２６ＪＳ〇０７０８２４０：９８００．８４４ＩｎｉｔｉａｌＢＷｋ，ｇ９．．．．末重．６１９．４１９９８１０１１０１１０４９９０．０６１０．０２２ＦｉｎａｌＢＷｋ，ｇ－０７ｄ曰采食量３２０３２．．．１３２０３１２７０９６６０９４３０６９１ＡＤＦＩ，／ｄｇ日增重１８３１７４２０５２０３５０．４６５０．０１３０．０１９ＡＤＧ，ｇ／ｄ增重／耗料比０．５７０．５４０．６５０．６６０．０，．．１０２３７＜０００１＜０００１Ｇ：Ｆ７？１４ｄ日采食量３７９３５５３８０３９４９０．３６００３４００．１４８ＡＤＦＬｇ／ｄ２２．．．日增重１１９５２４５２７２１００３０６００５２０００４ＡＤＧ／ｄ，ｇ〇－５８０．５４０，６３０．６９０．０１０．１９８０．００５＜０．００１增重／耗料比Ｇ：Ｆ０－１４ｄ日釆食量３５０３３８３５０３５３７０，５５８０．５５２０．４６８ＡＤＦＩ，／ｄｇ日增重２０２１８４２２５２３？７０．２９７０．０１８０．００３ＡＤＧ，／ｄｇ０．．增重．５８０．５５０．６４０．６７０．０１０１９６０００１＜０．００１／耗料比Ｇ：Ｆ１＝＝－Ｌ－－Ｇ－ＧＬＰ２低剂量ＧＬＰ２；ＨＬＰ２高剂量ＧＬＰ２－－－Ｌ－－－ＧＬＰ２ｌｏｗＧＬＰ２ＨＧＬＰ２ｈｉｈＧＬＰ２．；ｇ２对照和ｒｅ－ＬＰＳ－：断奶后连续７天均按Ｏｎｍｏｌ／ｋ体重注射含的无菌ＰＢＳ溶液ＬＰＳ十ＬＧＬＰ２ｐｇ；ＰＳ－和Ｌ＋ＨＧＬＰ２：断奶后连续７天按２、１０ｍｎｏｌ／ｋ体重注射含ｈＧＷＧＬＰＪ的无菌ＰＢＳ溶液ｇｔｌｗＣｏｎｔｒｏ－－ｌａｎｄＬＰＳ：ｉｓｉｎｅｃｔｅｄｗｉｔｈｓｔｅｒｉｌｅＰＢＳｓｏｌｕｔｉｏｎｃｏｎｔａｉｎｉｎ０ｎｍｏｌ／ｋＢＷｈＧｌ２ＧＬＰ２．ＬＰＳ＋ＬＧＬＰ２ｐｇｊｇｇ［ｙ］ｉ３４；ａｎｄＬＰＳ十ＨＧＬＰ－２：ｐｉｇｌｅｔｓｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈＰＢＳｓｏｌｕｔｉｏｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｈＧｉ２ＧＬＰ－２ａｔｃｌｏｓｅｓｏｆ２ａｎｄ１０ｎｍｏｌ／ｋＢＷ［ｙ］卜ｇｅｒｄａｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔ７ｄａｆｔｅｒｗｅａｎｉｎ．ｐｙｇ３比较－＋－＝（１ｖｓＬＰＳ（２ＬＰＳｖｓ．ＬＰＳ＋ＬＧＬＰ２３ＬＰＳｖｓＬＰＳＨＧＬＰ２ｎ１０：）对照；）；（），；重复数Ｃｏｎ－－ｔｒａｓｔ：（３ｃｏｎｔｒｏｌｖｓ．ＬＰＳ；（２）ＬＰＳｖｓ．ＬＰＳ＋ＬＧＬＰ２；（３）ＬＰＳｖｓ．ＬＰＳ＋ＨＧＬＰ２；Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｅｎ）ｒｅｌｉｃａｔｅｓ．ｐ２８ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究试验一３－．２血浆ＧＬＰ２的浓度ＬＰ－２的分泌－２的基础水为了研宄内源Ｇ，对血浆ＧＬＰ平进行了测定。表２显ＬＰＳＬＰ－２浓度的变化规律ＧＬＰ－２示了应激前各处理组血浆Ｇ。断奶后血浆水平发生了显著变化－２。对照组和低剂量组仔猪的血浆ＧＬＰ在断奶第７天均显著降低（Ｐ＜０＝１Ｐ＜００１）１４（Ｐ０２３１＆００５５）．００和．０，随后在第天提高至断奶前水平．．；－ＬＰＳ组血ＧＬＰ－２７天和第ｐｒｅ浆浓度在断奶后第１４天均显著低于断奶前水平（尸＜＝－－０而ＩＬＰ２．００１０．００６）ＧＬＰ２组，７７和尸；然，高齐Ｊ量的仔猪其血浆ＧＫ平在第天＝－与断奶当天的水平差异不显著（Ｐ０．５２２），而在第１４天ＧＬＰ２水平显著高于断＜奶前水平（尸０．００１）。－－在断奶第７天，与ｐｒｅＬＰＳ组相比还是高剂量的ＧＬＰ，，无论注射低剂量２均－＜＜２水平的降低（户０．００１和Ｐ０．００１）。至断奶第１４天显著抑制了断奶后ＧＬＰ，－－低剂量和高剂量ＧＬＰ－２ＧＬＰ２水平也显著高于ｐｒｅＬＰＳ组（尸＝０处理组的血浆．００１和Ｐ＜０．００１）。－－（表２川０匕２＾｝１＾２．对１＾５应激前断奶仔猪血浆０１＾２的浓度的影响／１１＾）１３４＾§１－－ｉＴａｂｌｅ２ＴｌｉｅｅｆｆｅｃｔｏｆｈＧＩ２ＧＬＰ２．４〇ｎｌａｓｍａＧＬＰ２ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｎｓｉｎｗｅａｎｅｄｉｌｅｔｓｂｅｆｏｒｅＬＰＳｃｈａｌｌｅｎｅ［ｙ］｜３ｐｐｇｇ项２４目Ｉｔｅｍ处理Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ比较Ｃｏｎｔｒａｓｔ—Ｐｏｏｌｅｄ对照ＬＳ＋？ｐｄＰＳ：ＳＥＭ，２３－ＣｏｎＬＰ－２ＧｒＬＰｐ２ｔｒｏｌＧ￣￣０ｄ２００２０２２０．．１２０２２０６４６０７７３０９２１７ｄ１７０１６４１８０１９５２．＜．００１＜．１０１２０００００４．．１＜．１１５１９１２１０２３０３９７００００００１ｄ９３０Ｐｏ－－ｏｌｅｄＳＥＭ３３３４－－－＜０．００＜０．００＜０．００．１１１１０５２２比较＜＜＜＜－－——２０．００．．１０００１０．００１０００］３Ｃｏｎｔｒａｓｔ＜０－－－－３０．２３１０．００６０．０５５．００１１＝＝Ｌ－－：－ＧＬＰ２低剂儀ＧＬＰ２；ＨＧＬＰ２高剂贵ＧＬＰ２＝－－＝－－ｗＬＧＬＰ２．ｌｏＧＬＰ２；ＨＧＬＰ２ｈｉｇｈＧＬＰ２＇２－对照和ｒｅＬＰＳ＋－ｐ：断奶后连续７天均按０ｎｍｏｌ／ｋｇ体ｆｉ注射含的无菌ＰＢＳ溶液；ＬＰＳＬＧＬＰ２ＬＰＳ－、和＋ＨＧＬＰ２：断奶后连续７２１０ｎｍｏｌ／ｋ体重注射含ｈＧ＾ＧＬＰＡ＾的无菌ＰＢＳ溶液天按ｇｔｊＣｏｎｔｒｏＬＰＳｔＢＷ２－２＋ＬＬＰ－ｌａｎｄ：ｉｓｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈｓｔｅｒｉｌｅＰＢＳｓｏｌｕｔｉｏｎｃｏｎａｉｎｉｎ０ｎｍｏｌ／ｋｈＧｌＧＬＰＧ２ｐｇｇｇ［ｙ］Ｎ３４；ＬＰＳａｎｄ＋－－ＬＰＳＨＧＬＰ２：ｉｌｅｔｓｉｎｅｃｔｅｄｗｉｔｈＰＢＳｓｏｌｕｔｏｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｈＧｌＧＬＰ２ａｔｄｏｓｅｓｏｆ２ｎｄｎｍｏｐｇｊｉｇ［ｙ２］｜．３４ａ１０ｌ／ｋｇＢＷｅｒｄａｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔ７ｄａｆｔｅｒｗｅａｎｉｎｇ．ｐｙ３比较＿．．：ｌ０ｄｖｓ７ｄ２７ｄｖｓ１４ｄ３０ｄｖｓ」４ｄ（）；（）；（）Ｃｏｎｔｒａｓ１．．１４．ｖ．Ｉ４．ｔ：０ｄｖｓ７ｄ；２）７ｄｖｓｄ；３０ｄｓｄ（）（（）４－ｖ－＝比较：（１）对照ｖｓＬＰＳ：（２）ＬＰＳｖｓ．ＬＰＳ＋ＬＧＬＰ２；３ＬＰＳｓ．ＬＰＳ＋ＨＧＬＰ２；重复数ｎ１０（）－－Ｃｏｎｔｒａｓｔ．Ｖ：１ｃｏｎｔｒｏｌｖｓ．ＬＰＳ２ＬＰＳｖｓ．ＬＰＳ＋ＬＧＬＰ２；３ＬＰＳｖｓＬＰＳ＋ＨＧＬＰ２ａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｅｎ；）（）；（）（ｒｅｌｉｃａｔｅｓ．ｐ２９ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究试验一３．３肠重和形态学ＧＬＰ－２ＬＰＳ３对应激后十二指肠、空肠和回肠重量的影响见表。如表所示，与对照组相比，ＬＰＳ应激显著降低了十二指肠、空肠和回肠的重量，以及小肠的总重和＝（、０．尸０．０３４、０．０３５、０．０１７０１６）。然而ＬＰＳ组相比小肠的肠重指数．００８和０，与，＾ＬＰ－２二＝低剂量的Ｇ处理显著提高了十指肠重、空肠重、小肠总重（７０．０１９、０．０４２－和０．０２６）ＧＬＰ２则显著提高了十二指肠重、空肠重、回肠重、小肠总重；高剂量的＝和小肠肠重指数（尸０．００５、０．００３、０．００１、０．００１和０．０１５）。＞－表３吋０丨７２０１＾２１．４对ＬＰＳ应激的断奶仔猪小肠各段重量的影响］３１－ｍｅｎ－ＴａｂｈｅｆｆｆＧｌ２ＧＬＰ２．ｏｎｔｈｅｗｅｉｈｔｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｅｔｉｎｗｅａｎｅｄｉｌｅｔｓｏｓｔＬＰＳｃｈａｌｌｅｎｅｌｅ３Ｔｅｅｃｔｏｈ［ｙ］１３４ｇｇｐｇｐｇ２３项目Ｉｔｅｍ处理Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ比较Ｃｏｎｔｒａｓｔ—Ｐｏｏｌｅｄ对照ｌｐｓ．ｌｌｐｓ．ｈｕ＞ｓｅｍｓＣｏｎ－ＧＬ－２ｔｒｏｌＧＬＰ２Ｐ￣￣￣￣十二指肠１Ｔ８１５＾２Ｖ７Ａ＼Ｔ９０４０００８Ｏ〇ｌ９０．００５Ｄｕｏｄｅｎｕｍ，ｇ３２５２８７３２３３４２７０．０３４０．０４２０空肠．００３Ｊｅｕｎｕｍ，ｊｇ４４３９４２４７１０．０３５０．．回肠１３４０００１Ｉｌｅｕｍ，ｇ小肠总重３８６３４０３８３４０７７０．０１７０．０２６０．００１ＧｒｏｓｓｗｅｉｈｔｏｆＳＬｇｇ０．．３８５０．０４０２０．０００６０．１．小肠肠重指数．０４０２００３６２０００６０１４７０．０１５ＳＩｗｅｉｇｈｔｉｎｄｅｘ＝＝＝＼－＝－－－ＧＬＰ２低剂量Ｇ２ＨＧＬＰ２高剂量ＧＬＰ２；ＳＩ小肠；小肠肠重指数小肠总重／体重ＬＰ；＝＝＝－＝－－－ＬＧＬＰ２ｌｏｗＧＬＰ２ＨＧＬＰ２ｈｉｈＧＬＰ２ＳＩＳｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅＳＩｗｅｉｈｔｉｎｄｅｘＧｒｏｓｓｗｅｉｈｔｏｆＳＩ／ＢＷ．；ｇ；；ｇｇ２＋－－对照：断奶第１４天注射无菌生理盐水；ＬＰＳ：断奶第１４天进行ＬＰＳ应激；ＬＰＳＬＧＬＰ２和ＬＰＳ＋ＨＧＬＰ２：－、应激断奶后前７天每天注射２１０ｎｍｏｌ／ｋＢＷ的ＧＬＰ２溶液，第１４天进行ＬＰＳｇＣｏｎｔｒｏｌ：ｉｌｅｔｓｉｎｅｃｔｅｄｗｉｔｈｓｔｅｒｉｌｅｓａｌｉｎｅｏｎｄ１４ｏｓｔｗｅａｎｉｎＬＰＳ：ｉｓｃｈａｌｌｅｎｅｄｂＳｏｎｄ１４ｏｓｔｗｅａｎｉｎＬＰＳｐｇｊｐｇ；ｐｇｇｙＬＰｐｇ；ＬＰ－２－－＋ＬａｎｄＬＰＳ＋ＨＬＰ：ｅｔｓｒｅｔｒｅａｔｅｉｔｈＬＰ２ａｔｏｓｅｓｏｆ２ａｎｄ１０ｎｍｏｌ／ｋＢＷｅｒａｆｏｒｈｅｉｒｓｔ７ＧＧ２ｐｉｇｌｐｄｗＧｄｇｄｔｆｄｐｙａｆｔｅｒｗｅａｎｉｎｗｅｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｂｙＬＰＳｏｎｄ１４ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ．ｇ３－－＝比较．．：（１）对照ｖｓＬＰＳ：（２）ＬＰＳｖｓＬＰＳ＋ＬＧＬＰ２３ＬＰＳｖｓＬＰＳ＋ＨＧＬＰ２；重复数ｎ１０；（）－－Ｃｏｎｔｒａｓ１．ＬＰ２．ＬＰＳ＋ＬＬＰ２３ＬＰＳｖ．ＬＰＳ＋ＨＬＰＶｔ：ｃｏｎｔｒｏｌｖＳＬＰＳｖＧ：Ｇ２ａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｅｎｒｅｌｉｃａｔｅｓ（）；（）（）；ｐＬＰＳ应激后十二指肠、空肠和回肠的形态学特征见表４。与对照组相比，ＬＰＳ组二＜＝指肠（Ｐ０．００１、户０．００１Ｐ＜０．００１），仔猪十、空肠和回肠的绒毛高度均显著降低和＝ＶＣＲ显著降低（Ｐ＜０．００１０．００５和尸＜０伴随绒毛高度与隐窝深度的比值．００１）。ＬＰＳ－。，２但是，处理对各肠段的隐窝深度没有显著影响与ＬＰＳ应激组相比低剂量ＧＬＰ处理显著增加了十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度（尸＜〇．〇〇１、尸＝０．０１９和０．０４１），ＣＲ值（Ｐ＜０－．００１）ＬＰ处理显著提高了各肠段绒毛高以及十二指肠的Ｖ；高剂量Ｇ２５Ｐ＜＜１尸＜＜、＝＜度（０．００１０．００和０．００１）和ＶＣＲ值（ｉ０．００１户０．００２和尸０．００１）。３０ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究试验一－表４１１０１２０１＾２＿对ＬＰＳ应激的断奶仔猪小肠形态学发育的影响１｜；￥］３４１Ｔ－ｒｅｒｅａｍｅｎｏｎｈｅｉｎｅｓｉｎａｌｍｏｒｈｏｌｏｏｆｗｅａｎｅｄｉｓｅｘｏｓｅｄＬＰａｂｌｅ４Ｅｆｆｅｃｔｏｆｈ［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ２＿ｔｔｔｔｔｔｔｏＳ］３４ｐｐｇｙｐｇｐ２项３目Ｉｔｅｍ处理Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，比较Ｃｏｎｔｒａｓｔ，—ＰｏｏｌｅｄＵ＞＋＋对照ＳＬＬＰＳＨＬＰＳＳ￡Ｍ３ＣｏｎＰ－２ＧＬＰ－２ｔｒｏｌＧＬ十二指肠Ｄｕｏｄｅｎｕｍ绒毛高度４３８３３５４２０４３８８＜０．００１＜０．００１＜０．００１Ｖｉｌｌｕｓｈｅｉｇｈｔ，ｐｍ隐窝深度２４２２５７２６４２３７３０．０９４０．４１５０．０２７Ｃｒｙｐｔｄｅｐｔｈ，｜ｉｍ．．．．．．．．比值ＶＣＲ１８１１３１１６０１８５００４＜０００１＜０００１＜０００１空肠Ｊｅｊｕｎｕｍ３４１２８４３２２３５３７０．００１０．０１９＜０绒毛高度．００１Ｖｉｌｌｕｓｈｅｉ＾ｉｔ，２．．隐窝深度１０２０７２２７２１２３０７０８００１７０．４７７Ｃｒｙｐｔｄｅｐｔｈ，ｉｍ＼比值．６３１．３８１．４３１．６７０．０３０．００５０．６０７０．００２ＶＣＲ１回肠Ｄｅｕｍ３０６２３９２５９３２４６＜０．００．．绒毛高度１００４１＜０００１Ｖｉｌｌｕｓｈｅｉ＾ｉｔｉｍ，ｊ２００２０５２１０２０９２０．２５９０．３７７０隐窝深度．８６３Ｃｒｔｄｅｔｈｉｍｙｐｐ，＼．．．２．．０＜０．００．．比值１５４１１６１４１５６０３１０２３７＜０００１ＶＣＲ１－＝ＬＰ－２Ｈ－＝－＝ＧＬＰ２ＬＰ２；ＶＣＲＬＧＬＰ２低剂量Ｇ；高剂量Ｇ绒毛高度／隐窝深度的比值＝＝－＝－－－Ｌ．ＧＬＰ２ｌｏｗＧＵ２ＨＧＬＰ２ｈｉｈＧＬＰ２ＶＣＲＶｉｌｌｕｓｈｅｉｈｔ／Ｃｒｔｄｅｔｈｒａｔｉｏ；ｇ；ｇｙｐｐ２－－１４天注射无菌生理盐水ＬＰＳ：断奶第１４ＬＰＳ应激ＬＰＳ＋ＬＧＬＰ２和ＬＰＳ＋Ｈ：对照：断奶第；天进行；ＧＬＰ２－断奶后前７天每天注射２、１０ｎｍｏｌ／ｋｇＢＷ的ＧＬＰ２溶液，第１４天进行ＬＰＳ应激Ｃｏｎｔｒｏｌ：ｐｉｇｌｅｔｓｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈｓｔｅｒｉｌｅｓａｌｉｎｅｏｎｄ１４ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ；ＬＰＳ：ｐｉｇｓｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｂｙＬＰＳｏｎｄ１４ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ；ＬＰＳ＋－＋－－ＬＧＬＰ２ａｎｄＬＰＳＨＧＬＰ２：ｉｇｌｅｔｓｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＧＬＰ２ａｔｄｏｓｅｓｏｆ２ａｎｄ１０ｎｍｏｌ／ｋＢＷｒｄａｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔ７ｄｐｇｐｅｐｙａｆｔｅｒｗｅａｎｉｎｗｅｒｅｃｈａｌｌｅｎｅｄｂＬＰＳｏｎｄ１４ｏｓｔｗｅａｎｉｎ．ｇｇｙｐｇ３＋－＋－＝（）ｖ．ｓ重复数ｎ比较：１对照ｖｓＬＰＳ；（２）ＬＰＳｓＬＰＳＬＧＬＰ２；（３）ＬＰＳｖ．ＬＰＳＨＧＬＰ２；１０－－Ｃｏｎｔｒａｓ．．＋．＋ｔ：（１）ｃｏｎｔｒｏｌｖＬＰＳ２ＬＰＳｖＬＰＳＬＧＬＰ２３ＬＰＳｖＬＰＳＨＧＬＰ２Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｅｎｒｅｌｉｃａｔｅｓ；（）；（）；ｐＬＰＳ应激后各处理组十二指肠、空肠和回肠的形态结构见图９。就形态发育而言，如图９Ｂ－、Ｆ、Ｊ所示，ＬＰＳ组仔猪的绒毛钝而短，而注射ＧＬＰ２的两组仔猪绒毛发育良好，绒毛长而呈指状。就ＬＰＳ应激造成的肠道损伤而言，如图９Ｂ、Ｆ、Ｊ所示，ＬＰＳ应激使肠绒毛结构受损，表现为绒毛顶端肠上皮发生侵润，肠上皮细胞脱落；－ＧＬＰ２处理很大程度上维持了肠道形态学结。因此－构的完整性，外源ＧＬＰ２的使用能保护肠粘膜免受ＬＰＳ应激的损伤。３１ ＊（ｇ？＜ｕ１Ｍｒ田－ｓｌｃ３絮３＾＾ｃ５．ａ洱ｒａ＜３）Ｔ｝ｕＩ３ｓ３拭？Ｓ顆｝＾ｌｐＸ茧罔ａＪ．ｓＪ＾？鹐评ｆＳ－ａ洱＞眾ＰＵ？ＥＳ虐Ｂ瓣ｕ．＿－Ｍ闰ｌｒａｍＢＩＩｌ＇ＩａｃＳ城＾ｉＰｄｏＪ１＾Ｕ邂Ｂｄ．ｄＥ＾＊．Ｓｏｓ－ｓ少（５ＳＳＥＥｌＭＩ制＇Ｏｐ＞ｆｉｔ＜ｕｒＢｓＭ３ｏｉｒｌｏ．Ｉｓｕｘ））３．／＞？＾（３．ｌｌＥｓｐｆ，ｆｉ－ａ，，？ｕ二墓（ｅ诹ＱＨ＇）：３爾Ｑ－０ｏ．ｎ？ｕ：佘ｏＪＪ＿ＢＳＳｗｄ．ｓＪ（Ｎ）－－Ｓｌ－？ｏｄｓ（ｌｉｌｘｔ６＾ｏ．ｓｏａｓ３ｏ（ｌ，ｌＤＯｑ：）（＾Ｘｌ．Ｅ＾ｊ．ａ０（」链ｏｏｏｆ２＊ｕｓｓＰＳ）ｄＵ＝ｕｐＥｍ４＝瞬３。０ｕ＞ＩＪ＿ｑ＜－ＥＴ３）３二ｍＣＱ＿ＵＥ＾Ｂｓｌ＾；Ｔ３。卹３（（ｕｆｉ＾＜Ｕ１体２＞ＢＪｔ＿ｕ３ｄ画ｓ）－－１ｏｑ４－？．ｄｌ＊ｕｏｎ＇０ｓｌ）ｓ）－－铵ｂｓ＜．ｗｄｓ＿ｎｍＩＷＳ＾ｌｏｕＪｄｚＳｏ＜Ｎｌ－ｐ－ｃ￡Ｎｃ（ｃｏ，－ｎ－Ｓ＇ｎａａ，ｏｌＢｏｎａｏｂ＇？ｒ＾／ｓ＃ｔｄ＾＿ｌｏ／ＤＩｓＯ．Ｊｃｉ＜ｎｏ變ＳｌＳ３ｔ，Ｊ£ｎ－．：Ｉ）（Ｓ＇ｌｆｓｓｉ３－ｇ：．ｕ；」．０ＳｆｅｏＪ－ｍｍＨＪ（ｕｒｓ：ｕＳ？５ｒｔＪｌＥＨ－ＵｌｆＮｒａ．－＝ｓｃ８ｇｎＳＡ私＾＾ｄ以ａ０ｌ？３ｕ洚鼸ｓｌ；．憂＾Ｊ＾（Ｓｓ／Ｉ赵ｃ３ｏＪｎｗ＃．ａ）屮ｉ＜３ｌｚ）ｐＨ＜班ｄｊＳ乂ｎｏＩ＃２ｓｒｄｕ３￥？－ｐＩａｐ刍？ｅａ＾ｎＤ＜髟ｓｍｕｏｅｏＢｌＵ三ｕＩＺ６ｓＢ￡ｄＴａ？ｌ３ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究试验一３．４消化吸收相关的酶活－ＧＬＰ２对ＬＰＳ应激的断奶仔猪肠道酶活的影响见表５。与对照组相比，ＬＰＳ显＜＝－二指（尸１５著降低了十肠０．００、户〇．〇４和０．０２０）和空肠的肠粘膜ＡＫＰ酶活、丫ＧＴ＝－酶活、食糜中的胰脂肪酶活（Ｐ０．０４７、０．０１９和０．０３１）。高剂量ＧＬＰ２处理显著提５－＝ＧＴ酶活（Ｐ＜０．００１／０）高了十二指肠肠粘膜的ＡＫＰ酶活和ｙ和．００４，以及食糜＝＜－中的胰淀粉酶和胰脂肪酶活（Ｐ０．０１９和尸０．００１）；同时，高剂量ＧＬＰ２组空肠－ＧＴ酶活＝粘膜的ＡＫＰ酶活、ｙ、食糜的胰脂肪酶活也显著提高（Ｐ０．００７、０．００８和－ＡＫＰ０．００４）。低剂量ＧＬＰ２的处理使十二指肠粘膜酶活及食糜中胰脂肪酶活显著降＋＋＜＝－－（户０．１），ａＡＴＰａｓｅ酶活以及低．００１和Ｐ００９。此外十二指肠和空肠粘膜的ＮＫ空肠淀粉酶活在ＧＬＰ－２组与ＬＰＳ组间差异均不显著。表ｈＧ－５ｌ２ＧＬＰ２Ｎ对ＬＰＳ应激的断奶仔猪小肠酶活的影响［ｙ］３４１－ｍｅ－Ｔａｂｌｅ５ＥｆｆｅｃｔｏｆｈＧｌＧ２．ｏｎｅｎｚａｃｔｉｖｉｔｉｎｔｈｅｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅｏｆＬＰＳｃｈａｌｌｅｎｅｄｗｅａｎｅｄｉｌｅｔｓ［ｙ２ＬＰ１３４］ｙｙｇｐｇ项２３目Ｉｔｅｍ处理Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ比较Ｃｏｎｔｒａｓｔ—Ｐｏｏｌｅｄ对照ＬＰＳ＋ＬＬＰＳ＋ＨＰｒｅ－ＳＳＥＭＬＰ！２３ＣｏｎＧ－２ＧＬＰ－２ｔｒｏｌＬＰ十二指肠Ｄｕｏｄｅｎｕｍ＋＋Ｎａ－Ｋ－ＡＴＰａｓｅ，５４．．．１５１１５３６５２２１８０５７３０６３６０８２８Ｕ／ｍｒｏｔｅｉｎｇｐＡＫＰ，４８２７４２５０２＜０．００．１＜．１＜００００００１Ｕ／ｍｒｏｔｅｉｎｇｐ＇ＧＴＹ，．．．１０３５８７２１０１５１１１７３０００４５００７９０００４Ｕ／ｒｏｔｅｉｎｇｐ淀粉酶Ａｍｌａｓｅｙ．７５６８７４７６．．．１００６０００６８００１９Ｕ／ｍｒｏｔｅｉｎｇｐ脂肪酶Ｌｉｐａｓｅ，１７７７７１５２２７１７７９２１９６０８４３５０．０２００．０１９＜０．００１Ｕ／ｍｒｏｔｅｉｎｇｐ空肠ｊｅｕｎｕｍｊ＋＋Ｎａ－Ｋ－ＡＴＰａｓｅ，５６６５２４５２４５３２１３０．２７５０．９９６０．８２９Ｕｉ／ｍｒｏｔｅｎｇｐＡＫＰ，．．．．．．．．１５４１２４１４４１６５０５００４７０１７８０００７Ｕ／ｍｒｏｔｅｉｎｇｐ－ＧＴｙ．９８８８１１．．．１８９４５０３２６００１９００７５０００８Ｕ／ｒｏｔｅｉｎｇｐ淀粉酶Ａｍｌａｓｅ，ｙ．．．１５４１４４１６６１６１５０４６７０１０３０２１５Ｕ／ｍｒｏｔｅｉｎｇｐ脂肪酶Ｌｉａｓｅ，ｐ．０３．．４８４３６３８６１６４４２８９５２２０９１６９５０１０２０４０００４Ｕ／ｍｒｏｔｅｉｎｇｐ】＝－二－：：－Ｌ：２；碱性碼Ｋ酶；谷氨基转移酶ＧＬＰ２低剂量ＧＬＰ２ＨＧＬＰ高剂量ＧＬＰ２ＡＫＰ３３ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究试验一＝－＝－－－＾－＝－ＬｌｏｗＧＬＰ２；ＨＧＬＰ２ｈｉｈＧＬＰ２ＡＫＰＡｌｋａｌｉｎｅｈｏｓｈａｔａｓｅＧＴＧｌｔｉ．ＧＬＰ２ｇ；ｕｔａｍｌｔｒａｎｓｅｄａｓｅｐｐ；ｙｙｙｐｐ２ＬＰ－－对照：：断奶第１４天注射无菌生理盐水；Ｓ：断奶第１４天进行ＬＰＳ应激；ＬＰＳ＋ＬＧＬＰ２和ＬＰＳ＋ＨＧＬＰ２７－断奶后前天每天注射２、ＢＷ的ＧＬＰ２溶液，第１０ｎｍｏｌ／ｋｇ１４天进行ＬＰＳ应激Ｃｏｎｔｒｏｌ：ｉｌｅｔｓｉｎｅｃｔｅｄｗｉｔｈｓｔｅｒｉｌｅｓａｌｉｎｅｏｎｄ１４ｏｓｔｗｅａｎｉｎＬＰＳ：ｉｓｃｈａｌｌｅｎｅｄｂＬＰＳｏｎｄ１４ｏｓｔｗｅａｎｉｎ：ＬＰＳｐｇｊｐｇ；ｐｇｇｙｐｇ＋Ｌ－－－ＧＬＰ２ａｎｄＬＰＳ＋ＨＧＬＰ２：ｉｌｅｔｓｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＧＬＰ２ａｔｄｏｓｅｓｏｆ２ａｎｄ１０ｎｍｏｌ／ｋＢＷｅｒｄａｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔ７ｄｐｇｐｇｐｙａｆｔｅｒ．ｗｅａｎｉｎｗｅｒｅｃｈａｌｌｅｎｅｄｂｙＬＰＳｏｎｄ１４ｏｓｔｗｅａｎｉｎｇｇｐｇ３丫＾＞－０＾＾－＝比较．０１＾１＾．只２：（１）对照５〇＾；（２）１５乂５３＋２３乂５１５＋０１＾；重复数！１１０；（）＋－－Ｃｏｎｔｒａｓｔ．．．＋：１ｃｏｎｔｒｏｌｖＬＰＳ２ＬＰＳｖＬＰＳＬＧＬＰ２３ＬＰＳｖＬＰＳＨＧＬＰ２Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｅｎｒｅｌｉｃａｔｅｓ（）；（）；（）；ｐ４．讨论４ＬＰ－．１断奶后血浆Ｇ２浓度的变化规律－研宄发现，ＧＬＰ２，１日龄达到高峰新生仔猪血浆的浓度显著提高在吮乳仔猪，９４［］之后伴随断奶相关的厌食而显著下降。在本研宄中，断奶后肠道适应性变化的同时，血浆ＧＬＰ－２的浓度急剧下降ＧＬＰ－２的降低后肠道的消化吸收能力也出现了下降，；－２水平和断奶仔猪肠道适应之间的相关关系以上结果揭示了ＧＬＰ。在新生仔猪、肠粘膜损伤或短肠综合征的大鼠研宄模型上的研宄发现－，肠道营养或外源ＧＬＰ２能诱２（｜９３１（）（）［，，］）－－导提高血浆ＧＬＰ２浓度。相似的，在本研究中，注射高剂量的０〇２显著抑Ｐ－２制了血浆ＧＬ基础水平的下降，甚至提高至高于断奶时的水平；尽管外源注射ＧＬＰ－２仅在试验最初７天进行－２，ＧＬＰ的基础水平却在断奶第１４天仍然保持在高水ＬＰ－２平，高低剂量的Ｇ处理均缓解了ＬＰＳ引起的肠粘膜损伤。分析血；更重要的是Ｐ－２－浆ＧＬ能保持高水平的原因，可能由于长期外源注射ＧＬＰ２不仅促进了断奶后仔－还增强－，猪肠道的适应性恢复，了仔猪分泌内源ＧＬＰ２的能力这可能归因于ＧＬＰ２刺激肠上皮细胞增殖和分化的作用效果。但是，由于其中的内源作用机制尚不清楚，因此ＬＰ－２ＬＰ－２，现在要想提高循环Ｇ的水平以调节肠道内环境可能还得依靠外源Ｇ的添加。４－２．２ＧＬＰ对肠重和形态学发育的影响仔猪断奶伴随着小肠形态学结构的巨大变化，包括绒毛萎缩、绒毛高度降低、隐１（）１［］窝深度增加，并导致肠道主动吸收功能的下降。在许多动物模型上的研究已表明－外源添加ＧＬＰ２与肠道发育有显著的相关关系。例如：有研宄报道，肠道营养和外９３［］－２可协同促进大鼠肠粘膜的发育生仔猪的研宄中源ＧＬＰ；在新，灌注不同剂量的２２２（）［［］－２提高了小肠的重量］ＧＬＰ，ＤＮＡ和蛋白的含量以及绒毛高度。与这些研宄结果３４ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究试验一一－致的是，本研究发现高剂量ＧＬＰ２显著提高了十二指肠、空肠、回肠的重量以及－小肠重和小肠肠重指数，低剂量ＧＬＰ２，。然而处理对回肠重没有显著作用效果分２（）［］－－析其原因，首先可能与ＧＬＰ２的剂量依赖作用有关，２；此外由于与ＧＬＰ特异性结合以激活下游信号转导途径发挥生物学功能的ＧＬＰ－２Ｒ主要分布于十二指肠和空３３［］－。肠，ＧＬＰ２Ｒ的高度组织特异性分布也可能与此有关９７］［－０小肠的绒毛隐窝结构变化可以反映小肠的健康状况。与Ｚｈｕ等（２１３）研宄一结果，本研究发现ＬＰＳ导致肠粘膜损伤相关的形态学改变致的是，如绒毛顶端上皮细胞脱落和绒毛萎缩－２抑制了ＬＰＳ对肠道形态学的作用。ＧＬＰ，表现为缓解绒毛上皮的脱落毛高度和ＶＣＲ值－。由此表明，ＧＬＰ，提高了各肠段的绒２能缓解ＬＰＳ应－－激对肠绒毛的损伤，，提示ＧＬＰ２可促进绒毛隐窝结构的发育并增强肠粘膜的屏障ｃｋｅｒ９９６）以及Ｎｉ等（２００４）功能，这与Ｄｒｕ等（１ｉｉｎｉｋｏｓｋ在全肠外营养的新一生仔猪上研宄报道的ＧＬＰ－２能抑制小肠萎缩的结果致－。分析本试验中ＧＬＰ２的作１（）４１（）５［’］，用效果可能归因于其促进小肠系膜血流量，刺激肠细胞存活及增殖以及抑制９（６１，１）［］细胞凋亡和蛋白水解的能力。４－．３ＧＬＰ２对小肠酶活的作用防止肠绒毛萎缩能有效改善断奶仔猪的养分消化吸收能力，消除断奶应激对仔猪９２［］生产性能的不利影响。本试验测定了十二指肠和空肠的多种酶活，包括肠粘膜ＡＫＰ、＋＋－ａ－Ｋ－ＡＴＰａｓｅ－ＧＴ和Ｎ，以及食糜中胰淀粉酶和胰脂肪酶。有趣的是７，ＧＬＰ２处理显－２著改善了脂肪酶活，这可能与ＧＬＰ通过提高胰腺血流量促进了胰腺脂肪酶的分泌６１［］－－有关。此外，ＧＬＰ２处理显著提高了十二指肠和空肠的ＡＫＰ酶和ｙＧＴ酶活。肠１Ｇ７道ＡＫＰ酶是肠粘膜的酶标志物［］近年来发，反映上皮细胞增殖和肠道吸收的能力；（）８１｜ＡＫＰ能改善Ｔ］，现Ｊ蛋白的表达水平和定位是肠粘膜通透性的重要调节因子。＋＋＋一－－ＫＡＴＰａｓｅ是细胞上－Ｎａ种完整的膜蛋白，负责维持胞内外Ｎａ梯度以促进Ｎａ偶－－，ａ葡萄糖共转运载体（Ｎａｃｏｓｅｃｔ１联载体的共转运过程如Ｎｇｌｕｏｔｒａｎｓｐｏｒ，ＳＧＬＴ）、＋＋＋＋［＿－－－－ＮａＨ交换泵（ＮａＨｅｘｃｈａｎｇｅｒ，ＮＨＥ）。ｙＧＴ酶能分解谷胱甘肽生成丫谷氨－－酰，，将其转到外来的氨基酸上生成Ｙ谷氨酰氨基酸最后将其转运到胞内，因此该ｕ（）［］酶在细胞中可通过转肽反应进行细胞间的氨基酸转运。在许多动物模型上的研究－。－２对如，均显示了ＧＬＰ肠道酶活的积极作用效果：在肠外营养的早产仔猪上ＧＬＰ２２２［］显著提高了空肠麦芽糖－葡糖淀粉酶和蔗糖－异麦芽糖酶ｍＲＮＡ的表达丰度和酶活；３５ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄试验一１１｜［］－在全肠外营养的仔猪上，ＧＬＰ２能防止全肠外营养引起的肠道对己糖的吸收障碍，１１２［］此外上乙烯基ＧＬＰ－２并急性刺激肠道对葡萄糖的利用。，在断奶仔猪，聚的处理１１３［］ＬＰ－提高了空肠的蔗糖酶活性，以及十二指肠和空肠的乳酸酶活性。由此表明，Ｇ２可促进肠道的消化吸收功能７０％回ＬＰ－２显。在肠切除的大鼠上研究发现，外源Ｇ著－浓度－提高了血浆ＧＬＰ２，并使位于肠神经元细胞和内分泌细胞上的ＧＬＰ２ＲｍＲＮＡ［ｍ］表达量提高３倍，从而增强残余小肠的适应性生长和消化能力。尽管目前对外源－２注射ＧＬＰ影响ＬＰＳ应激的断奶仔猪相关酶活的具体作用机制尚不清楚，但是可以１１４［］－推测这不仅与血浆ＧＬＰ－２浓ＧＬＰ２Ｒ表达的丰度有关度的增加以及，也可能与肠１６［］系膜血流量的提高有关。－４．４ＧＬＰ２对生产性能的影响ＬＰ－２ＡＤＧ和Ｇ断奶应激会抑制仔猪的生长。本研究结果显示Ｇ提高了：Ｆ，改善了断奶仔猪的生产性能。早前在大鼠上的研究也发现，无论是发生炎症时立刻注射还２９［］Ｐ－２是延迟注射ＧＬ，均能提高动物体重在全肠外营养造成肠粘膜萎缩的啮齿动物；ｉ５ｎ］上２４０的ＧＬＰ－２可ＬＰ－〇Ｇ２，以剂量连续注射促进肠道发育，增加体增重－的促生长作用很大可能归因于ＧＬＰ２改善肠道发育的作用。１１６１１７３４］［］［［］－ｓｔｅｎｓｅ（２ａｖ（、ａｎＴａｎｇＣｈｒｉｎ等０００）、Ｄｌｉ等２０１２）Ｇｕ等（２０１２）一的研究表明ＧＬＰ－２作为种神经递质抑制啮齿动物的摄食行为ＬＰ－２。Ｇ在大脑中１１８一［］是种强厌食肽，能上调下丘脑中食欲调节神经肽ｍＲＮＡ的水平。外周短期内１１９［］－注射ＧＬＰ２能降低小鼠的采食量。然而，与此相反的是，本试验研究发现，断０？７ｄ？？ＡＤＨ奶后、７１４ｄ、０１４ｄ各处理组间仔猪的均没有显著差异。与本研宄结１２（）［］－，ｃｈｍｔ研宄指出果相似的是Ｓｉｄ等（２００３），外周施用ＧＬＰ２并不能影响人的食欲和自由摄食ＬＰ－２对食欲的。造成这种分歧的原因可能在于生理浓度的循环Ｇ２１１［］调节没有显著的作用效果。５．小结ＬＰ－２能促进肠道形态学发育１）Ｇ，增强肠道中消化吸收相关酶的活性，改善断奶仔猪的生产性能。－２能缓解ＬＰＳ应激条件下肠上皮细胞的脱落２ＧＬＰ，维持肠绒毛的完整），有利于肠粘膜屏障功能的发挥。３６ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验二试验二ＧＬＰ－２对ＬＰＳ应激的断奶仔猪肠粘膜屏障损伤的作用１．前言众所周知，，，仔猪断奶后受到各种应激可能增加肠上皮的通透性使得肠腔中的蛋白抗原，过度吸收的抗原可能触发Ｔ、微生物内毒素及其代谢产物侵入粘膜下层９１（３４２２，１］［ｎ］。Ｌａ（细胞发生免疫反应，释放促炎性细胞因子ｌｌｈ等２００４）认为断奶仔猪促炎性细胞因子的上调很可能是造成早期肠道功能失调性腹泻的重要原因。抗生素被应用于治疗炎症的发生。然而，抗生素在畜牧生产中的应用可能增加通过食物链造成抗生素抵抗的风险，，因此，为了减少或避免抗生素的过度使用有必要在动物遭受应一激时预防炎症的发生－２。ＧＬＰ作为种由肠道Ｌ内分泌细胞分泌的特异性肠营养多肽，２３１１２４［］［］在啮齿动物和新生仔猪上具有特异性刺激肠上皮细胞增殖，，抑制细胞凋亡缓１２５１２６１２７［＇］止肠粘膜通透性增加的作用［］解肠道炎症，和防。在断奶仔猪上，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ等９４一［］－（２００３）和本试验的研宄结果显示，断奶后血浆ＧＬＰ２浓度急剧下降，小肠的－此外消化吸收能力降低，表明ＧＬＰ２水平与肠道适应之间可能存在相关关系，试；一验－２显著抑制了断奶后血浆ＧＬＰ－２基础水平的下降研宄还发现外源ＧＬＰ；即使仅－２－－在试验前７天注射了外源ＧＬＰ，第１４天ＧＬＰ２处理组仍维持了血浆ＧＬＰ２的高水ＬＰ－？平，Ｇ２的预处理是否能抑制ＬＰＳ诱导的肠屏障通透性的增加呢又能否。那么［％］预防随后发生的肠炎呢？Ｌｉｕ等（２００８）研宄认为断奶后肠上皮通透性的增加与ＴＪ－ｌ蛋白ＺＯ１和ｏｃｃｕｄｉｎ的表达及超微结构改变有关；而增加的促炎性细胞因子可能通４８－－１２８［］［］－过调节ＺＯ１和ｏｃｄｕｄｉｎ蛋白的表达和分布，进步增强肠上皮的通透性。由此，可以推测应激导致的肠道炎症很可能与ＴＪ结构的早期适应性变化导致肠上皮通－，透性的增加有关。是否如此，尚需研宄探明。因此本研究于注射ＧＬＰ２结束的第７９６一［］（天断奶后第，Ｓ诱１４天）以ＬＰ导肠粘膜损伤的断奶仔猪作为研宄模型，进步－研究当动物遭受肠应激损伤时，ＧＬＰ２的预处理能否抑制促炎性细胞因子的增加，其相关作用机制是否与ＴＪ信号相关。３７ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验二２．材料与方法２．１试验动物和饲验设计一同试验。２．２试养管理一同试验。２．３试验仪器和试剂２．３．１试验仪器Ｎｉｋｏｎ荧光生物显微镜（ＮｉｋｏｎＣｏ．，日本）、石蜡切片机（Ｌｅｉｃａ，德国）、７２２智能分光光度计上海（上海第三分析仪器厂）、ＷｅｌｌｓａｎＭＫ型酶联免疫分析仪（美国－Ｔｈｅｒｍｏ公司）、超净工作台（ＳＢ２，上海净化设备厂，中国）、冷冻离心机（Ｌｅｇｅｎｄｍｉｃｒｏ－Ｂ１７ＲＴｈｅｒｍｏＵＳＡ）、超纯水系统（ＭｉｌｌｉｏｒｅｉｏＣｅｌ，ＵＳＡ）、核（ＤＵ８００，，ｐ酸蛋白检测仪，－Ｂ－Ｂｅｃｋｍａｎ，ＵＳＡ）、ＰＣＲ扩增仪（ＰＴＣ０２００，ＩＯＲＡＤ，ＵＳＡ）、凝胶电泳图像分析？－－ｅｎｅＧｅｎ，ＲＡＤ，ＵＳＡ（Ｔ系统（ＧｉｕｓＢＩＯ）和荧光实时定量ＰＣＲ仪ＣＦＸ９６ＲｅａｌｉｍｅＢ－Ｓｙｓｔｅｍ，ＩＯＲＡＤ，ＵＳＡ）等。２．３．２主要试剂Ｄ－乳酸检测试剂盒（南京建成生物技术研宄所二ＤＡＯ检）、胺氧化酶测试剂盒（南京建成生物技术研究所）、显色基质终点显色试剂盒（厦门鲎试剂实验公司）、－－－－ＩＬｌ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＴＮＦａ的ＥＬＩＳＡ检测试剂盒（美国ＧＢＤ生物公司）ｐ、羊抗兔ＳＡＢＣ）、兔多克隆抗体ＺＯ－Ｋ博士德生物技术公司）免疫组化试剂盒（博士德生物技术公司，兔多克隆抗体ｏｃｃｌｕｄｉｎ（博奥森生物技术公司）、ＤＡＢ显色液（北京中杉）、ＲＮＡ抽？ＲＮＡｉｓｏＰｕｓ（宝生物工程（大连、反转录ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｔＲＴｒｅａｅｎｔｋｉｔ提ｌ）有限公司）ｐｇｗｉｔｈＤＮＡＥｒａｓｅｒ（ｅｒｆｅｃｔｒｅａｌｔｉｍｅ）试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）ｇｐ、实时？ＹＢＲ？ＰｒｉｍｅＳｃｒ－荧光定量ＳｉｐｔＲＴＰＣＲＫｉｔＩＩ试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）、氯仿、异丙醇、无水乙醇、氢氧化钠等试剂为国产分析纯。Ｗｅｓ－ｔｅｒｎｂｌｏｔ试剂：兔多克隆ＺＯ１抗体，兔多克隆ｏｃｃｌｕｄｉｎ抗体，购自ＰｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈＴｈＨ８／ＳｅＨ９中国分公司；兔抗ｐＭＬＣ多克隆抗体，购自美国ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公上海生工公ＨＲＰ－司，购；；兔抗ＭＬＣＫ多克隆抗体自中国司羊抗兔辣根过氧化物酶３８ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验二ｋ？２４ｋＤｌ标记的二抗ｅａｒｔｈｏｘ公司；ｅｒ（１１５）Ｓｏａｒｂｉｏ，购自美国蛋白预染ｍａｒ，购自中国公司，ｂｅｓｔｂｉｏ；ＢＣＡ蛋白定量试剂盒、跨膜蛋白提取试剂盒购自上海贝博生物公司；一，购自中国碧云天生物技术研宄所，抗稀释液、ＥＣＬ特超敏化学发光试剂盒；Ｔｒｉｓ购自美国Ｓｉｍａ公司过硫酸按、甘氨酸Ｇｌ（分析纯），购自ａｍｒｅｓｃｏ公司１．５ｍｏｌ／Ｌｇ；ｙ；－ｘ－（丁ｒ，ｉｓＨＣｌ（Ｈ８．８）、ｌｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌＨ６．８）购自中国Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司５ｐｐ；蛋白上样－－Ｄ缓冲液（含Ｐ疏基乙醇），购自中国Ｃｏｏｌａｂｅｒ公司；ｓｋｉｍｍｉｌｋ，Ｔｗｅｅｎ２０，购自ｉｆｃｏ；－３０ｃｒ－Ｂ它常用试剂均为国产ｉｓ（２９：１）、ＳＤＳ和ＴＥＭＥＤＢｉｏＲａｄ公司％Ａ，购自；其分析纯试剂或生化试剂。２．３．３溶液酉己制１）转膜缓冲液：Ｔｒｉｓ５．８２．９ＳＤＳ０．３７６００ｍＬｇ，甘氨酸ｇ，ｇ，去离子水约溶解后，加入２００ｍＬ甲醇后，加去离子水定容至１Ｌ，室温保存。＇２）１０父丁８８缓冲液（？］＾７．６）：１出２４．２层，他（：１８０§，去离子水８００１１１［溶解，ＨＣ１调至ｐＨ７．６，去离子水定容至１Ｌ。－３）ＴＢＳＴ缓冲液：１０ＸＴＢＳ缓冲液１００ｍＬＴｗｅｅｎ２０２ｍＬ，加去离子水至，１°Ｌ，４Ｃ保存。４ＸＳＤＳ－Ｔ）５ＰＡＧＥ电泳缓冲液（Ｈ８．３）：甘氨酸９４，ｒｉｓｌ５．１，ＳＤＳ５ｐｇｇｇ，加入约８００ｍＬ去离子水，搅拌溶解后加去离子水定容至１Ｌ，室温保存。５）ｔＤＳｌ１０％（ｗ／ｖｏｌ）ＳＤＳ溶液：Ｓｇ，１０ｍＬ去离子水配制，室温保存。°６）１０％过硫酸铵ＡＰＳ溶液：过硫酸铵ＡＰＳ０．１ｌｍＬ４Ｃ短ｇ，去离子水溶解，期保存。°７）封闭液：０．５ｇ脱脂奶粉溶于１０ｍＬＴＢＳＴ溶液，４Ｃ可短期保存，现用现配。８）（Ｈ６．０）三钠４柠檬酸钠溶液ｐ：柠檬酸．０，柠檬酸０．４，加入去离子水溶ｇｇ解并调节ｐＨ值，继续加去离子水定容至１Ｌ。２．４样品采集２．４．１血；孜采集分别于断奶后第０、７、１４天早上使用医用无菌注射器通过前腔静脉空腹采血用－－于测定血浆ＬＰＳ、Ｄｌａｃｔａｔｅ和ＤＡＯ酶活性和血清促炎性细胞因子水平。样品釆集（）一１流程图同试验图，但是具体的时间点稍有不同，即断奶后第１４天的血样于注射ＬＰＳ溶液１ｈ后进行采集。采集的血液样品分别注入含有和不含ＥＤＴＡ抗凝剂的采血３９ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验二管中分别制备血浆和血清。此外，按试剂盒说明书的方法用装有２ｍＬ去热源肝素的试管２ｍＬ血２倍稀释，制得的血浆用于ＬＰＳ浓度的检测。将血（去热源）将液进行°样静置３０１＾１１后，于４０：条件下，１５０（＞§离心１５〇１丨１１，将制得的血清和血浆样品进°－２０Ｃ保存待测行分装后。２．４．２组织样品采集一４ｃｍ肠仔猪麻醉处死时间和方法同试验。分别于各小肠中段采集约段用于免５ｃｍＲＴ－ＰＣＲ和ｗｔ疫组织化学分析肠段用于ｅｓｅｒｎｂｌｏｔ分析，进行分装后置；取约１ｑ°－８０Ｃ保存待测此外于液氮中速冻，于十二指肠和空肠中段用玻片刮取，之后转入；肠粘膜用于ＤＡＯ酶活的检测。２．５测定指标２．５．１肠道通透性变化的测定ＬＰＳ－ｔｅ和ＤＡＯ酶、Ｄｌ为了评估断奶仔猪的肠粘膜损伤，本试验分别对血浆（＞ａｃｔａ－ＤＡＯ酶活进行了测定－ｃａｅ。Ｄｌａｔｔ，活，以及肠粘膜的（）采用手工比色法操作严格按试－－－－－－剂盒说明书进行测定。Ｄｌａｃｔａｔｅ的检测原理：Ｄ（）ｌａｃｔａｔｅ能被Ｄ（乳酸脱氢酶氧化（））－－生成在波长４５０ｎｍ处有最大光吸收的有色产物。Ｄｌａｃｔａｔｅ检测试剂盒的有效检测限（）？ｍｏｌ〇为０．０１１０ｍ／ＬＤＡＯ酶活使用手工比色法，按照试剂盒说明书的操作方法进行测定。ＤＡＯ酶活－的检测原理＿ＣＨＮＨ００生ＲＣＨＯ、ＮＨ：ＤＡＯ催化Ｒ２与和Ｈ成３和Ｈ２０２；ＮＨ３进２２２一ａ－二ＮＡＤＨ反应生成谷氨酸和ＮＡＤ通过检测３４０ｎｍ处ＮＡＤＨ吸步与酮戊酸和；－／光度的降低率（ＡＡｍｉｎ）计算ＤＡＯ的酶活。对于肠粘膜ＤＡＯ酶活，需要在检测前对ｘ，肠粘膜进行预处理，方法如下：称取约５００ｍｇ肠粘膜按１０倍体积加入的ｌＰＢＳ溶°＞１１１〇１１１７４）４１００００３〇１０八０检．１＾．，于（：条，１１１丨１，吸取上清用于液（０，？件下＾离心１２９］１。测。ＤＡＯ酶活使用该样品相应的蛋白浓度进行校正，表示为Ｕ／ｍｇ蛋白肠粘膜蛋白浓度采用考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒进行测定。ＤＡＯ检测试剂盒的有效检测限为（Ｍ００Ｕ／Ｌ〇ＬＰＳ的测定使用显色基质终点显色法按试剂盒说明书进行操作，使用７２２智能分光光度计在波长为５４５ｎｍ条件下进行检测。其检测原理为：ＬＰＳ激活鲎试剂（ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ一ａｍｅｂｏｃｙｔｅｌｙｓａｔｅ，ＴＡＬ）中酶的级联反应，活化的酶分解底物产生种黄色产物；黄一成一ｎｍ处，该色产物进步与重氮试剂反应，形种在波长５４５有最大吸收峰紫色产物４０ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验二０￣紫色产物的吸光度与内毒素水平呈正比。该试剂盒的有效检测限为．００５１ＥＵ／ｍＬ。２．５．２血清中促炎性细胞因子的测定－－－－分别采用猪ＩＬ１３、ＩＬ６、ＩＬ８和ＴＯＦａ的ＥＬＩＳＡ检测试剂盒进行测定，操作按照｜试剂盒说明书的试验步骤进行。２．５．３上皮细胞ＴＪ蛋白的免疫组织化学分析采用免疫组化学技术检测十二指肠－ｏｃｃｕｄ、空肠和回肠中段Ｚ０１和ｌｉｎ蛋白的分布。采用羊抗兔ＳＡＢＣ免疫组化试剂盒按说明书进行操作。具体操作步骤如下：１）将４％多聚甲醛固定的肠组织样品经酒精层级脱水、浸蜡、包埋、切片（５ｍｍ厚）后，室温放置ｌｈ；一２，）脱蜡：切片放于染缸经二甲苯浸泡脱蜡１０ｍｉｎ后转入另装有二甲苯的染缸再次浸泡１０ｍｉｎ；３）水合经１００％乙醇一０一９５％乙醇一９０％乙醇一乙醇：脱蜡后将切片１０％乙醇８０％一一７０％乙１０ｍ醇层级浸泡ｉｎ，然后将切片用自来水冲洗段时间（约５ｍｉｎ），再转移至ＰＢＳ缓冲液中孵育５ｍｉｎ；４）于染缸内加入３％Ｈ０溶液抑制内源性过氧化物酶，将切片浸泡１０ｍｉｎ，然后２２用蒸馏水水浸洗３次；５）抗原修复：为了将抗原的结合位点暴露出来，将切片装入切片架浸入０．０１ｍｄ／Ｌ枸橼酸缓冲液（ｐＨ６．０）中，微波炉中火加热至沸腾后保持３ｍｉｎ，自然冷却至室温，反复两次。将缓冲液倒掉后，水洗两次；６）封闭：将切片取出置于湿盒中，滴加ＰＢＳ液浸洗２ｍｉｎｘ３次，擦干组织周围ＰＢＳ°液，滴加山羊血清封闭非特异性结合位点，于３７Ｃ培养箱中孵育３０ｍｉｎ；一７）加，ＰＢＳ抗：用ＰＢＳ液沿玻片轻轻冲洗掉血清用吸水纸将组织周围的液吸千。ＺＯ－１１００１２将兔抗１多克隆抗体按：稀释，兔抗ｏｃｃｌｕｄｉｎ多克隆抗体按：５０稀释后，滴°加于组织上，４Ｃ冰箱中孵育过夜。阴性对照滴加磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）作为代替；８）加二抗：将切片用ＰＢＳ液浸洗２ｍｉｎｘ３次。滴加生物素标记的羊抗兔ＩＧ二抗，ｇ于°３７Ｃ培养箱孵育３０ｍｉｎ；°９）加ＳＡＢＣ：将切片用ＰＢＳ液浸洗２ｍｉｎｘ３次。将ＳＡＢＣ按１：１００稀释后于３７Ｃｘ孵育２０ｍｉｎ。用ＰＢＳ液浸洗５ｍｉｎ４次；１０）显色：将ＤＡＢ浓缩液（２〇ｘ）按１：２０比例进行稀释后，擦干组织周围的ＰＢＳ４１ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验二液后滴加ＤＡＢ显色液；一，７０１１）脱水：将显色后的片子装入染缸用清水冲洗段时间将切片依次浸入％乙°－－－－－乙醇－／乙醇－醇８０％９０。９５％乙醇１００％乙醇１００％乙醇二甲苯二甲苯，每个试剂中放置２ｍｉｎ；１２）封片：滴加中性树脂，用盖玻片轻轻盖上。封片后使用Ｎｉｋｏｎ荧光生物显微镜ｘｘ）观察，于光镜下（ｌ〇〇）随机选取３个视野，并在高倍镜下（４０〇观察阳性颗粒在肠上皮细胞间的分布并拍照。２．５．４ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ的合成使用ＴａＫａＲａＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ抽提各肠段肠粘膜组织样品的总ＲＮＡ。对ＲＮＡ浓度和质量进行检测，取总ＲＮＡ原液１此，加入９９ｆｉＬ的ＤＥＰＣ水，混匀后在核酸蛋白分析仪？中测定２８０ｎｍ和２６０ｎｍ处的ＯＤ值及浓度。ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值在Ｌ８２．２符合反转录对总ＲＮＡ的浓度要求。另外，取少量ＲＮＡ经１％琼脂糖凝胶电泳检测提取ＲＮＡ的质量，以２８Ｓ核糖体ＲＮＡ条带的亮度约为１８Ｓ的２倍为好。？然后，将检验后质量较好的ｍＲＮＡ按反转录试剂盒ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔｋｉｔｗｉｔｈ一ｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ（ｐｅｒｆｅｃｔｒｅａｌｔｉｍｅ）说明书进行配制反转录反应体系。第步配制去基因组°ＤＮＡ的反应体系，，混合均匀后在４２Ｃ加热２ｍｉｎ后按反应体系加入其它试剂，混合均°°°ＣＡ－匀后于３７ｌ５ｍｉｎ，８５Ｃ５ｓｅｃ进行反转录，将反转录获得的ｃＤＮ模板置于２０Ｃ冰箱保存待用。反应体系配制如表６：表６反转录反应液配制Ｔａｂｌｅ６Ｍｉｘｔｕｒｅｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎｑｐ１＾３Ｓｉ５ｘｇＤＮＡＥｒａｓｅｒＢｕｆｆｅｒ２ｉＬ＼ＤＮＡＥｒａｓｅｒ１ＬｇｐＴｏｔａｌＲＮＡ２ｉＬ＼ＲＮａｓｅｆｒｅｅｄＨ２０５ｉＬ（°混合均匀后４２Ｃ２ｍｉｎ５ｘＰｒｉｍｅＳｃｒｉｔ？Ｂｕｆｆｅｒ２（ｆｏｒＲｅａｌＴｉｍｅ）４ｐＬｐＰｒ１ｉｍｅＳｃｒｉｐｔ？ＲＴＥｎｚｙｍｅＭｉｘＩＲＴＰｒｉｍｅｒＭｉｘ１ｉＬ｜ＲＮａｓｅＰｒｉｍｅｒｄＨ２０４ｉＬ（Ｔｏｔａｌｖｏｌｕｍｅ２０°３７０１５１１１丨１１８５１５５６（：混合均匀后，进行反转录４２ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宂：试验二２．５．５引物设计及合成－－在ＮＣＢ－八／１７、／Ｌ６、／Ｌ－＆７ＷＦ－ａ和Ｉ网站上查找猪ＺＯＭＬＣ／Ｃ基因序列，利用Ｏｌｉｇａ软件设计引物序列，引物序列见表７，引物交由？Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ英杰生命技术公司合成，内参基因为表７ｑＲＴ－ＰＣＲ引物１－Ｔａｂｌｅｉｍｅｒ７ＲＴＰＣＲｒｑｐＳｅｕｅｎｃｅｏｆｒｉｍｅｒＧｅｎＢａｎｋｑｐＧｅｎｅＬｅｎｇｔｈ（ｂｐ）Ｆ：ｆｏｒｗａｒｄＲ：ｒｅｖｅｒｓｅａｃｃｅｓｓｉｏｎ（，）＇，－－ＧＡＰＤＨＦＣＴＧＡＧＧ３ｉ〇２ＮＭ：５ＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡ００１２０６３５９Ｊ＇＇Ｒ－ＧＣＡＡＴＧ－：５ＴＧＧＴＣＧＴＴＧＡＧＧ３＇＇－－ＺＯ１Ｆ：ＳＡＡＡＧＣＣＣＴＡＡＧＴＴＣＡＡＴＣＡ＾１４５ＸＭ００３１２１６７２．１，，Ｒ－－：５ＧＴＧＴＣＡＡＣＧＣＣＡＣＴＡＴＣＡ３，，ＯｃｃｌｕｄｉｎＦ＿－：５ＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＡＧＣＧＴＡＴ３１１２ＮＭ００１１６３６４７＇，Ｒ－－：５ＡＣＡＴＣＡＣＧＡＴＡＡＣＧＡＧＣＡＴＡ３，，Ｌ－－－ＩｉＦ：５ＴＡＣＡＴＧＧＴＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＡＴ３１５８２ｐ１４０５５ＮＭ．１，＇Ｒ－－：５ＴＧＡＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＴ３，，－－－ＩＬ６Ｆ５ＧＣＴＴＣＣＡＡＴＣＴＧＧＧＴＴＣＡＡＴ３１６４：ＮＭ２１４３９９．１，＿－Ｒ５－ＣＣＴＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＴＧ３：’＇－ＩＬ－８Ｆ－：５ＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＡ３１１１ＮＭ２１３８６７．１’，Ｒ－－：５ＡＣＡＡＣＧＴＧＣＡＴＧＧＧＡＣＡＣＴ３’．－＿ＴＮＦ－ａＦ３３：５ＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡ１７ＮＭ２１４０２２．１，＇－Ｒ－：５ＴＧＣＣＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＡＡＡＧＴＣ３’＇ＭＬＣＫＦ－－：５ＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧＧＡＴＧＡＡ３１１４ＸＭ００１９２９０７８．３＇＇Ｒ－－：５ＣＣＡＣＴＧＡＧＣＣＣＴＧＡＧＡＴＣＡＴ３＇＝＝＝－－ｄ－－－ａＧＡＰＤＨｌｃｅｒａｌｄｅｈｄｅ３ｈｏｓｈａｔｅｄｅｈｒｏｅｎａｓｅＺＯ１ｚｏｎａｏｃｃｌｕｄｅｎ１ＴＮＦｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｇｙｙｐｐｙｇ；；＝ｆａｃ－ＭＬＣＫｉｌｉｈｉｋｉｔｏｒＳａｍｏｓｎｔｃｈａｎｎａｓｅ；ｙｇ２－．５．６ｑＲＴＰＣＲ？－－采用ＩＱ５ＢＩＯＲＡＤ荧光定量ＰＣＲ仪进行ＲＴＰＣＲ扩增反应，按ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘ？ＴａＲＮ）－ｑＩＩ（ＴｌｉａｓｅＨＰｌｕｓＲＴＰＣＲ试剂盒说明书配置１２．５＾Ｌ反应体系（见表８）。°°实时定量ＰＣＲ反应程序为：预变性９５Ｃ，１０ｓｅｃ：变性９５Ｃ，５ｓｅｃ：退火延伸°３０ｅｃ－７－ｓ，共４０个循环；（２４ＰＤ／／、ＺＯ和ｏｃｃ／ｗｄ／？的退火温度均为５５Ｃ，辽以、／Ｋ、°°°°°°－／Ｕ、７７ＶＦａ、ＭＺＣ尺分别为６０Ｃ、６０Ｃ、５９Ｃ、５８Ｃ、５８Ｃ。扩增完成后以０．５Ｃ°°５Ｃ逐步升温到９一为温度梯度从６５Ｃ读取融解曲线，以检验扩增产物的特异性。同－批样品不同板间的Ｃｔ值采用ＢｉｏＲａｄＣＦＸｍａｎａｇｅｒｖｌ．６软件进行板间校正，校正后１３Ｃ）［１的结果采用Ｐｆａｆｉ法（２００１）进行相对表达量的计算。４３ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验二表８荧光定量反应体系Ｔａｂ－ｌｅ８ＭｉｘｔｕｒｅｏｆｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｓｓｔｅｍｙ试齐ｕＷｍ上游引物（５ｎｍｏｌ／Ｌ）１ｎＬ下游引物（５ｎｍｏｌ／Ｌ）１ｈＬＳＹＢＲ（ｘ．ＩＩ２）６２５ＬｎｃＤＮＡ模板１ｉＬ（ＲＮＡａｓｅｆｒｅｅｄｄＨ２０３．２５Ｌｎ总体积１２．５Ｌｎ２．５．７Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ一抗均列于表９中试验所用。一表９Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ的抗Ｔａｂｌｅ９ＬｉｓｔｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｕｓｅｄｆｏｒＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｅｄｉｌｕｔｉｏｎＭａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｙｐ－ＲａｂｂＺＯｉｔｏｌｃｌｏｎａｌ１：１０００ＰｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈＧｒｏｕＩｎｃ．ＵＳＡ１ｐｙ，ｐ，ｏｃｃｌｕｄｉｎＲａｂｂｉｔｏｌｃｌｏｎａｌ１：１５００ＰｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈＧｒｏｕＩｎｃ．ＵＳＡｐｙ，ｐ，ＭＬＣＫＲａｂｂｉｔｏｌｃｌｏｎａｌ１：５００ＳａｎｏｎＢｉｏｔｅｃｈＣｈｉｎａｐｙｇ，－ＭＬＣＴｈｒｌｌｌｉｉ１８／Ｓｅｒ１９Ｒａｂｂｉｔｏｌｃｏｎａ１：１０００ＣｅｌＳｎａｌｎＴｅｃｈｎｏｌｏＵＳＡｐ，，ｐｙｇｇｇｙＧＡＰＤＨＭｏｕｓｅｌｔｉｍｏｎｏｃｌｏｎａ１：１００００ＰｒｏｅｎｔｅｃｈＧｒｏｕＩｎｃ．ＵＳＡ，ｐ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试验具体操作步骤如下：１）制样，：将冷冻肠样经液氮速冻后使用研磨杵研成粉末使用总蛋白提取试剂盒严格参照试剂盒说明书的操作步骤提取样品的总蛋白。具体操作步骤如下：取约１００ｍｇ粉末，加入５００（ｘＬ含有２ｐＬ蛋白酶抑制剂（成分为ＡＥＢＳＦ、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、－ｔｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ、Ｅ６４、ｂｅｓａｔｉｎ和ＥＤＴＡ）的蛋白裂解液，使用Ｐｏｌｙｔｒｏｎ勾楽机勾衆。将°匀浆于４Ｃ条件下１２０００ｘｇ离心１５ｍｉｎ后吸取上清液。２）蛋白定量：按照ＢＣＡ蛋白定量检测试剂盒说明书进行测定。将标准蛋白浓度倍比稀释为２０００ｐｇ／ｍＬ、１０００｜〇＿ｇ／ｍＬ、５０〇ｎｇ／ｍＬ、２５０（ｉｇ／ｍＬ、１２５（ａｇ／ｍＬ、５０ｐｇ／ｍＬ和２５ｐｇ／ｍＬ；将ＢＣＡ反应试剂Ａ与试剂Ｂ按照５０：１的比例混合，制成工作液；°，与２００ｐＬＢＣＡ工作液混匀后３７Ｃ放置３０ｍｉｎ取２０＾Ｌ适当稀释的蛋白样品，于波长５６２ｎｍ测吸收值Ａ，绘制标准曲线，并根据标准曲线确定样品的蛋白含量，根据°－Ｃ。。稀释倍数计算样品的蛋白浓度，然后将蛋白样品分装保存于８０配方配制－３）配胶：按以下１２％的ＳＤＳＰＡＧＥ分离胶和５％的浓缩胶（见４４ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验二表１０）。－１０２％ＳＤＳＰＡＧＥｍＬ表１分离胶配方表（单位：）ｌｆ－Ｔａｂｅｌｉ１０ｔｈｅｏｒｍｕａｔｏｎｏｆ１２％ＳＤＳＰＡＧＥｓｅｐａｒａｔｉｏｎｅｌｓｇ￣￣Ｗ＆１２％分离胶５％浓缩胶￣￣ｄｄＨ２０３３２１３０％聚丙烯酰胺４．００．６７—－．ｉ２５１．５ｍｏｌ／ＬＴｒｓＨＣｌ，ｐＨ８．８—－０．５ｌ．Ｏｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌＨ６．８，ｐ．．１０％ＳＤＳ０１００４．１０％ＡＰ０１０．０４ＴＥＭＥＤ０．００４０．００４４）蛋白变性：根据测得的蛋白浓度结合总蛋白上样量（３０Ｍｇ）和上样体积（２０＞＜ｐＬ）计算５ｌ〇ａｄｉｎｇｂｕｆｅｒ的添加体积，加入ｂｕｆｅｒ后手动混匀后瞬时离心，于沸水中煮５ｍｉｎ，冷却后再次瞬时离心。５）垂直电泳：每孔加入２０ｐＬ蛋白样进行垂直电泳，电泳程序为：恒压６０Ｖ，３０ｍｉｎ，然后恒压１２０Ｖ，９０ｍｉｎ，时间根据所测蛋白的大小适当延长或缩短）。６）转膜：以半干转方式进行转膜。电泳结束后取出胶板，根据预染ｍａｒｋｅｒ大小判断目的条带所在位置，用切割刀修好胶，将胶浸没于转膜缓冲液中平衡约１５ｍｉｎ；根据胶块大小将ＰＶＤＦ膜和上下两块转膜滤纸进行裁剪１００％甲醇浸泡活化ＰＶＤＦ，用一膜，约１５ｓｅｃ后取出与滤纸同浸于转膜缓冲液中。待到滤纸浸透转膜缓冲液后，则一ＰＶＤＦ一一在转膜槽内的板式电极上按以下顺序叠放：下层滤纸膜胶块上层滤纸一层过程中可能产生的气泡（用滚轮赶去每）。然后用棉花将上下板式电极擦上转膜缓冲液，，２０，并吸去槽内多余液体装好电极以恒压Ｖ转膜４５ｍｉｎ（转膜时间视本试验中目的蛋白大小可适当延长或缩短。）７）封闭：加入由５％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂奶粉和ＴＢＳＴ缓冲液（１３７ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，２０－ＨＣ－ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓｌＨ７．４０１％Ｔｗｅｅｎ２０，，ｐ，．）配制的封闭液常温下摇床摇２ｈ，以抑制非特异性结合。一８）回收封闭液，将膜用ＴＢＳＴ漂洗１０ｍｉｎ，加入由抗稀释液按相应比例稀释°一Ｃ冰箱孵育过的抗，于４夜。一ｘ，将膜用ＴＢＳＴ漂洗１０ｍ二９）回收抗ｉｎ３次。将抗按１：１００００比例用封闭液进行稀释，加入二抗，常温摇床摇２ｈ。４５ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验二１０）回收二抗，ＴＢＳＴ洗膜１０ｍｉｎｘ３次。将ＥＣＬ化学发光试剂Ａ液和Ｂ液按１：１比例混匀，将膜用吸水纸蘸干后浸于显色液中３ｍｉｎ。１１）将膜置于凝胶成像系统的载物台上，用ｍａｅＬａｂ软件操作界面设置程序，Ｉｇ拍照并进行图片分析。２．６统计分析ＧＬＰ－２１７试验数据均以平均值±ＳＥＭ表示，ＳＰＳＳ．０。以注射剂量作为主效应采用软件进行Ｏｎｅ－ｗａＡＮＯＶＡ单因素方差分析组间平均值采用ＬＳＤ法进行ｙ，不同试验，户＜０。差异显著性检验以．０５表示差异有显著性意义３．结果－２Ｄ－－ｃｅ３．１ＧＬＰ对血浆ＬＰＳ、ｌａｔａｔ和ＤＡＯ酶活以及肠粘膜ＤＡＯ酶（）活的影响断奶当日１０，所有仔猪的血浆ＬＰＳ水平均低于试剂盒最低检测限。如图所示，断奶第７天（ＬＰＳ应激前），各处理组血浆ＬＰＳ浓度提高到可以检测但相当低的水平。－－２ＬＰＳ的浓度与ｐｒｅＬＰＳ组相比，高剂量ＧＬＰ的处理显著降低了血浆（尸＜０．０５）。断奶后第１４天（注射ＬＰＳｌｈ后），与对照组相比，ＬＰＳ应激组仔猪的血浆ＬＰＳ水平＜－２组仔猪血浆ＬＰＳ显著低于ＬＰＳ应激组＜显著提高（户０．０５）高剂量ＧＬＰ（尸，但是－ＬＰＳ组－０，ＬＰ２．０５）。断奶第７天（ＬＰＳ应激前），与ｐｒｅ相比低剂量Ｇ对断奶后血浆－－－ＤｌａＣｔａｔｅ和ＤＡＯ酶活的提高没有显著的作用效果，高剂量ＧＬＰ２显著抑制了断奶（）Ｄ－ｔｔｅＤＡＯ＜）。，后血浆（Ｘ）ｌａｃａ和酶活水平的提高０．０５断奶后第１４天在ＬＰＳ应Ｄ－－ｔｔＤＡＯ激ｌｈ后，与对照组相比，ＬＰＳ应激组仔猪血浆ｌａｃａｅ和酶活水平显著提（）高（Ｐ＜０．０５）；ＬＰＳ应激２４ｈ后，所测十二指肠中段和空肠中段肠粘膜ＤＡＯ酶活则Ｐ＜０）Ｐ－ＬＰＳ引起的出现了显著降低（．０５。高剂量ＧＬ２预处理组显著逆转了－－ＤＡＯ＜－Ｄｌａｃｔａｔｅ和酶活水平的改变（尸０．０５），显示出外源ＧＬＰ２缓解ＬＰＳ引起的（）肠屏障损伤的长期作用效果。３－．２．ＧＬＰ２对促炎性细胞因子的影响ＬＰ－ＥＬ－２对断奶仔猪肠炎的作用效果ＩＳＡＲＴＰＣＲ为了研宄Ｇ，试验分别采用和ｑ－－－检测技术测定了ＩＬ－ｌ、ＩＬ６、ＩＬ８和ＴＮＦａ的血清水平以及小肠中ｍＲＮＡ的相对表ｐ４６ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验二－－达量。如图１１所示，断奶后第７ｅＬＰＳ组相比ＧＬＰ２天（ＬＰＳ应激前），与ｐｒ，高剂量－Ｌ－－ＴＮＦ－处理显著抑制了血清ＩＬｉｐ、Ｉ６、ＩＬ８和ａ水平的提高（＾＜０．０５）。断奶第１４－－－－天，与对照组相比，ＬＰＳ应激显著提高了ＩＬ１３、ＩＬ６、ＩＬ８和ＴＮＦａ的血清水平（Ｐ（＜）－０。２，．０５然而，与ＬＰＳ应激组相比，尽管低剂量ＧＬＰ预处理的作用效果不显著ＬＰ－２＜０但是高剂量Ｇ预处理显著提高了血清促炎性细胞因子的水平．０５）。ＡＢ－－■＝！ＬＰＳｄＤｌａｃｔａｔｅ（）２５６＊＊１５＊＊１，１，ｅ＾ｎｓｉｎｒｓｒｉ－§１２８广ｉｌ§Ｈａ－１。ｆｉ鬥专丄３ｆ６４〇．５丁一￣＾―目〇防｜５＊０－—１．２５§ｉＰｌｆｌｎｉｐ－ｉ－１２５Ｂ＾ｒｉｎｉｌｉｎｎＭｌ＿！丄ｉ■ＩＩ一０Ｉ（／）？ＩＶｙｊ＾／／１／／／＼＼ｏｎｔｒｏ－＋－級ＣｌａＬＰＳ＋ＬｏｗＧＬＰ２ｏｎｔｒｏｌＯＬＰＳＬｏｗ織ＣＧＬＰ２ＳＰＳ＋－＋－Ｅ３ＬＰａＬＨｉｇｈＧＬＰ２Ｅ３ＬＰＳＣＤＬＰＳＨｉｇｈＧＬＰ２ＣＤＰｌａｓｍａＩｎｔｅｓｔｉｎａｌＭｕｃｏｓａ２０－，★★＇ｒｖ〇〇－＊＊．３｜＂ｌ－＾１４ｌｘ１ｉｌｒ＇－°－２ｉ〇＊＾１Ｉｒ！６Ａｆ！■ｒＳｉ：ＵｉｌｔｉｌｋＩｂｕｈｉｍｙＩＩ＾＾＾＜〇〇ｊ＿ｊ—邊６＃《／／Ａ＋－＋－ｔｍｔｒｏｌ口ＬＰＳＬｏｗＧＬＰ２酺Ｃｏｎｒｏｌ□ＬＰＳＬｏｗＧＬＰ２ｉＣｏｎＥ３ＬＰＳＯＬＰＳ＋Ｈ－ＳＬＰＳ＋Ｈ－ｉｈＧＬＰ２ｍＬＰ口ｉｇｈＧＬＰ２ｇ图－＾（八）、０七＾８０酶活（：１００１＾２对血浆１＾（６（）和０八（）以及肠粘膜０八０（０）的影响（重＝复数ｎ１０）ｆｆ－－－Ｆｌｌｈｅｉｉｕｒｅ１０ＴｈｅｅｅｃｔｏｆＧＬＰ２ｏｎａｓｍａＬＰＳＡＤａｃｔａｔｅＢａｎｄｔａｃｔｖｉｔｏｆＤＡＯｉｎｌａｓｍａＣｇｐ（），（）（），ｙｐ（）＊＜－Ｄｏｆ．ａｎｄｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａｗｅａｎｅｄｉｌｅｔｓ．：Ｐ０．０５ｖｓｒｅＬＰＳｏｎ７ｄａｎｄ１４ｄ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆ（）ｐｇ（ｐ）ｔｅｎｒｅ．ｐｌｉｃａｔｅｓ４７ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验二－Ａ－ＢＩＬ６ＩＬ１ｐ－１－－１５００．￡８０，＊＊￡Ｉｔ＊口ｎｎ？－？ｂ１１０００ｔＩｘｉｉｉｉｆｌｆｉ￡．；１ｍＡ＊Ｉ：ｓ＊５ｎｉ！ｉｌ＊！ｌｌｉｌｉｌｉｉｌｌ＾？／，，，＋－Ｃｏｎ＋Ｌｏ－ｔｒｏｗＧ醐ｔｒｏｌ〇ＬＰＳｗＧＬＰ２＠９Ｃｏｎｌ〇ＬＰＳＬｏＬＰ２＋Ｈ－－Ｅ３ＬＰＳＣＤＬＰＳＥＤＬＰＳＯＬＰＳ＋ＨｉｇｈＧＬＰ２ｉｇｈＧＬＰ２ＣＤ－＾ｏＩＬ８ＴＮＦ８００－８０－ｎ＊￡￡＿｜１Ｉ：ｒ＾Ｔｃ６００－Ｘｃ６０－－４０－！ｌＩｆｆ］ｌ２００－ｔｇｎｉＩ２０－Ｉ〇ｌ｜ｉｏｉｔｉ｜｜／ｚ／／／／ｏｎ＋ｗ－－ｍＣｔｒｏｔｒｏＰＳ＋ｗｌＯＬＰＳＬｏＧＬＰ２ｍＣｏｎｌＤＬＬｏＧＬＰ２Ｅ３ＬＰＳ□ＬＰＳ＋Ｈ－＋－ｉｇｈＧＬＰ２ＥＳＩＬＰＳ〇ＬＰＳＨｉｇｈＧＬＰ２－＝图１１断奶和ＬＰＳ应激后ＧＬＰ２对血清中促炎性细胞因子含量的影响（重复数ｎ１０）－－－Ｆｌｌｆｉｌｔｋｆｔｉｉｇｕｒｅ１１ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＧＬＰ２ｏｎｓｅｒｕｍｅｖｅｓｏｒｏｎｆａｍｍａｏｒｃｔｏｉｎｅｓａｅｒｗｅａｎｎａｎｄｏｓｔＬＰＳｐｙｙｇｐ＊ｃｈａ＜－ｌｌｅｎｇｅ．：Ｐ０．０５ｖｓ．ｒｅＬＰＳｏｎ７ｄａｎｄ１４ｄ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｅｎｒｅｌｉｃａｔｅｓ．（ｐ）ｐ１２－－如图所示，ＬＰＳ应激２４ｈ后，ＬＰＳ应激导致各肠段中／Ｌ从、／Ｚ６、／Ｕ和－－Ｆａ的ｍＲＮＡ表达量显著增高（尸＜０．０５）。与ＬＰＳ组ＬＰ２７７Ｖ相比，低剂量Ｇ预处理－＜－显著抑制了空肠和回肠中／Ｌ６ｍＲＮＡ的相对表达量（尸０．０５），而高剂量ＧＬＰ２预＜处理则显著抑制了各肠段以上促炎性细胞因子的基因表达（Ｐ０．０５）。４８ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验二Ｌ－－ＩＬ６ＡＩ１Ｂ６－５＊＊１，ｎ气ｒｒｎ＾＊＊＊＊＊＊＊§Ｉ〇＊￥１ＴＩＩＪｉ爸Ｓ＂ＡＩｔＩＴｘＩＩ．＿［］２＇５＇—ｉＵ＜？３＜，ｌ，ＩＩ１１ａ（］ＩＪＭｉｌｌｉｌｌＩＱ／，／，ｙ，＋－ｆｌｏｎｔｒｏｗＧＰ２＋－ｌＣｌ□ＬＰＳＬｏＬ＿Ｃｏｎｔｒｏｌ〇ＬＰＳＬｏｗＧＬＰ２Ｅ３ＬＰＳＣＬＰＳ＋－ｍＬＰＳ＋－ＤＨｉｇｈＧＬＰ２ＬＰＳＣＤＨｉｇｈＧＬＰ２ＣＤ－－８ＴＮＦａＩＬ＊＊ｆｉ６４ｎ＾＊＊二￣ｒｒｎ—ｉ＊＊＊§ｒＴ〇３－＊丄＊＊Ｔ—￣？？—３－５４ＴＴ｜ＪＬ厂１厂ＴＴａ；ＪＬＴｐｉａ＿ＳＪＬ＾ＴＴ２－１ｉｉｎｉｉ１！ｉｉｉ！ａＩｋＴ１？５５２．ｉＸ％§ｔｉｉｉＪｉＭｉｊｉＪｉｉｉｌｌｌｉｉ／．／＾／命／／＾＜／＜／＋－＋Ｌｏｗ－ｔｒｏｗＷｋＣｏｎｒｏＬＰＳＧＬＰ２ＷｋＣｏｎｌ□ＬＰＳＬｏＧＬＰ２ｔｌ〇＋－＋Ｈ－ＥＤＬＰＳａＬＰＳＨＥ３ＬＰＳ〇ＬＰＳｉｈＧＬＰ２ｉｇｈＧＬＰ２ｇ图２ＬＰＳ应激后ＧＬＰ－２１对十二指肠中段、空肠中段和回肠中段促炎性细胞因子基因表达的影响（重＝复数ｎ１０）Ｆ－－－ｉｕｒｅ１２ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＧＬＰ２ｏｎｔｈｅｅｎｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｃｔｏｋｉｎｅｓｉｎｔｈｅｍｉｄｄｕｏｄｅｎｕｍｇｇｐｐｙｙ，＊－ｅｕｎｕｍ－＜ｍｉｄａｎｄｍｉｄｉｌｅｕｍａｆｔｅｒＬＰＳｃｈａｌｌｅｎｅ．：Ｐ０．０５ｖｓ．ＬＰＳ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｅｎｒｅｌｉｃａｔｅｓ．ｊｇｐｊ３－Ｔ．３．ＧＬＰ２预处理对ＬＰＳ应激的断奶仔猪肠道Ｊ屏障的作用效果３．３．１ＴＪ蛋白的结构分布－２为了测定ＧＬＰ对肠道ＴＪ蛋白结构的影响，本试验采用免疫组织化学分析技术分别Ｔ－１Ｊ１ｃｃ，测定了蛋白ＺＯ和ｏｌｕｄｉｎ在肠上皮细胞间的超微结构分布。如图３所示各肠段－－对照组中，ＺＯ１蛋白的免疫染色呈典型的蜂窝网状ＴＪ结构（图１３：方框）。ＺＯ１蛋白的免疫阳性染色呈棕色，其亚细胞定位于细胞膜上，在绒毛顶端沿着肠上皮细胞的胞间区４９ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验二ＬＰＳ应激Ｚ０－１域呈线状分布的结构分布发生了改变，。导致沿细胞边缘分布的连续性线）ＬＰＳＰ－状结构断裂（图：黑色箭，网，２１３头状结构消失。相比于应激组低剂量ＧＬ处－ＬＰ－理组Ｚ０１蛋白的线状结构大多数亦有断裂，有少数完整的网状结构；然而，高剂量Ｇ２处理组Ｚ０－组相似呈更加完整的网状结构分布。１的超微结构染色与对照，少有断裂，并１－４所示，与Ｚ０１如图阳性染色相似，各肠段对照组ｏｃｄｕｄｉｎ的免疫阳性沿绒毛肠上皮细胞边缘呈线状分布，整体看来呈典型的蜂窝网状结构（图１４：方框）。在ＬＰＳ应激的仔猪上，ｏｃｄｕｄｉｎ线状免疫阳性染色出现断裂，网状结构瓦解（图１４：－２黑色箭头ｏｃｃｌｕｄｉｎ组的免疫阳性形态学与ＬＰＳ应激组相似，但是）；在低剂量ＧＬＰ阳性染色更深、线状分布偶有断裂，高剂量，可见部分完整的蜂窝网状结构；然而ＧＬＰ－２处理组ｏｃｃ。ｌｕｄｉｎ的阳性分布几乎恢复到与对照组相似的状态３．３．２ＴＪ蛋白的表达－－本试验通过ＲＴＰＣＲ和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测技术测定ＴＪ蛋白Ｚ０１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ基因ｑ的相对表达量－ｉ。如图１５Ｂ、Ｃ所示，ＬＰＳ应激导致十二指肠、空肠、回肠中段ＺＯｃｃＲＮＡ表达量显著降低－－ＲＮＡ相和ｏ／ｗＡ＞？ｍ；低剂量ＧＬＰ２处理组ＺＯｉ和ｍ对表达量有所提高ＬＰＳ组ＬＰ－２组则显著提高了ＬＰＳ，但与相比差异不显著；高剂量Ｇ一－降低的Ｚ（９７和基因的相对表达量。进步使用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测技术检测－Ａ所－Ｚ０１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的表达量。如图１５示，结果发现，同ＧＬＰ２对ｍＲＮＡ表－－达量的影响相似，ＬＰＳ降低了Ｚ０ｏｃｃｌｕｄｉｎ的蛋白表达１和，ＧＬＰ２剂量依赖地抑制－ｏｃｃｕｄｎ蛋白的表达量－１ｌ。ＰＴ了ＬＰＳ降低的Ｚ０和ｉ以上结果显示ＧＬ２对于维持Ｊ结构完整性的重要作用。－３．４．ＧＬＰ２对ＬＰＳ应激的断奶仔猪ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ旁路的影响一为了进步研宄ＬＰＳ降低Ｚ０－ｏｃｄｕｄｉｎ蛋白表达的胞内分子机制１和，我们检测了ＭＬＣＫ的基因和蛋白表达，，并对其革巴蛋白ＭＬＣ的磷酸化水平进行了测定。如图１６所示ＬＰＳ应激导致十二指肠、空肠和回肠中段ＨｍＲＮＡ相对表达量显著高于对照组，低ＬＰ－２处理的作用效果不显著－２ＭＸＸ的剂量Ｇ，而高剂量ＧＬＰ处理使基因表达显著低于一ＬＰＳ应激组（尸＜０．０５）。与ＭＬＣ／ＣｍＲＮＡ相对表达量的变化相致，ＬＰＳ提髙了ＭＬＣＫ－的蛋白表达，而ＧＬＰ２剂量依赖地抑制了ＭＬＣＫ蛋白表达量的增高。如图１７所示，与上游ＭＬＣＫ蛋白表达量变化一致ＬＰＳＭＬＣ的，应激组仔猪各肠段磷酸化水平出现了显－著地提高，而ＧＬＰ２预处理剂量依赖地抑制了ＬＰＳ应激提高的ＭＬＣ磷酸化水平。５０ 曰＾Ｓｄ§评ｓＩｌ－？—＞３Ｓ３Ｃ眾ｌ＾。ｏｘ）Ｔｎ（－ＣｒａＯ製ＯｉＴ３恂３ｗｌｕ＾闰ｃａｓ３－ｌ）Ｍ＾ｒ腠Ｊ￡－Ｃ－ｓＯｉＨＴＩ（ｓＵｓｉｓ３））ｓｓＭ？－ｄｌ、￡ｓｌｌ－＾ｆｌ＾３ｐｌｏ３＋Ｍ一ｚ－ｓ－ｉ７ｄＤｆ，＾Ｉ＾ｏ－ｌＯｕｎｒＮ日＾ｘ＋５ｏｃＺｎ力ｏｏｎｔ＾口ｏｔｓ？３ｓｏ＃＾回＾农〇３ｚ＾）－－Ｉ２ｄＩ味１、－￡ｓ．ｌ－ｗ坭曰ｏ３ｏＳ仁＾３Ｉ留３ｕｎ？￥如「ｗａ．－３ｌａｎ思『ｕｗ＋涨＾－？ｗｃａｓＦｆｗ＾＞ｓｄ补－＾’￡＾１Ｔ＋ｏ＾＾３－乂ｑ０＜窓ｏｆ｜＜＾ｕＳ）ｏ怔＞ｏ１＾｜蓝Ｅ￡Ｉ３３崁＝Ｏ－ｓｚ袋０Ｎ－识３Ｏｄ勺Ｊ｜－＊０Ｊ－３ｃａｗ０逗勺ｌＭｕ乂２－．２规ｆ二＾＾．ｓｌｌｓＩ諶莽日＋ｓ。ｃ琮眾３ｄｏ、裨ｌｌ＾（ｓ＃！ｓ莽ｓ３￡３＾Ｊ）馘ｓ０ｏｓ二七ｄｚｘ谢§趑￥５３ｓ啣亡乐鞦０Ｐｗ？ｓ｜Ｕ！Ｉ１Ｅｚ０－舀＾Ｉ９３ｄ闰５Ｊ，ｌ回淫ｎｌｆ卻３ｃ＞ＭＪｓ３＾ｏ呆Ｉ５？＾ｎＵ多蒸ｃ．（．＾ｏ＾ｑ’ｅ９－ｓ１１Ｇｗ袒Ｗ＋９＝－ｓ）？ｄ？ｓ＾，（ｗＱＪ窃槲乂＞Ｎ０４２ｓ０ｓｐ－寸＾（Ｌ＞Ｋ４【＾）Ｊｏ－§２＾０＾－昂＝ｃｓ．－ｗ２ｏ３｝Ｚ＝ＯＪ，Ｊ－＾ｐ（＊２Ｎ朴、ｓｗ３ｒｌ－５＾－ｆ＜．＊！＝：－ｏ屮＞）＾ｑ１／乂７ｌｆＭ｜ｓ二ｑｌｓｃＩ０一赶盔＾－ｘ２Ｅ＜Ｌ—）补－ｓｗ＋＊犮』Ｏｓ＾￥０Ｎｄ婆。＾ｆｌ－刍３３５班£］§＜Ｎ７ｓ〇３Ｑ髟１哉Ｉｓ￡二＾＋£］二ｓ〇３ａ１ｎ１５０斑一ｚ＾＋ｄ－夔搂￡ｏ３，ｌｌ运￡上ｓｆ？）§ｕ［／ｌ３Ａ胡ｕ０＜ｃＳ１杷ｗＪ＋Ｃｓ制肆ｏ＜ｒｌ劑鍫驶９蒙±＜０１＾？ｏ盔袒ＷＧ￡１汆＾？漱 鼯逗ｑ￥ｓ怨寸ｗ－（Ｎ＾５ａＳ￡Ｊ３＜３ｓ￡Ｊ赇．＾＾１ＩＣ．銜力ｓｒ３§Ｕｓｏ＊Ｋ－５。ｎｗ３＾Ｉ１７垢Ｍ￡－ＪＳ０Ｗｓ＋－Ｊ０农Ｏ．－－寸（Ｐ１ｏ）漱ｕ＾）扫ｃ？￡ｏ＾碧ｎｏｃＡ帐３ｒａｌｌ思－７ｎｎｌ坭Ｊ！ｕ■＾３ｕＫ如ＩｃＵＴＩ琛ｓ？ｐ婆ｕ？Ｅ补ｃａ舭Ｓｙ（ＩｇｄｌＨ苌Ｗ）ｕＩＪｓｊ＞ＥｌＩ袋ｍ＾＿ＳＩｎＩｉ．￣ｕ＾＾ｕ龊Ｏｎ０＾Ｊ逗＇＾Ｕ，＇识ｏｒ怨ｆＣ３Ｓ，－０－ＯＩｐ＾＾Ｏ箕ｌ３３ｔ＾晒＾１ｕ一０ｆ潞一Ｚ００￥．ｓ＃０ｏ１ｐ。Ｙ＾ｒ）ｎ馘构ｓｐ日兰３＾姻＝ｓｏ０芸Ｓｕｏ（ｉ入Ｈｗ运Ｌ）ＩｐｓｓＩｗ芸ｏｃａＩｎ＾＾－ｓ．ｌ－０２１＃ｇ邾＞－＾ｓｓＰ＾ｏＨＰ＞３Ｇ轫Ｊ＝ｊ＾）Ｕｄ眾ｌｉ淫ｏｘ１ｌ３ｕ－趑袒友０ｏｐ幽＾旮？］邶ｃ±：ｕ？ｅｓ获窓ｗｕ＾３ｓＪｏＳｊｃ＾ｆｌ：回ｗ＾－３ｐｃ３Ｆ足Ｓ峯＜ｌ）ｏＬｓＰ＾Ｕ（３Ｓ忍＜Ｌ）Ｉｎ８ｓｓＰｓｕｕｆ）Ｕ劫ｌｓＪａｐ＾ｕ０｝ｏｕ口谳ｌｎ．ｓ）趑ｔｃｏ＿足．￡ｏ３－－ｉ＾Ｂ（０ｌ垢ｘ窓ｌｏｌＰ尔ｏ３匪＾Ｊ识寸０－＆￡ｓ）—）Ｋ灰ｓＳ，３ｉ３＜ｓ（ｕｃＪｌ。ｌ＜ｕ＾Ｐｌ赵）卸３（ｕｉ－ｉ３ｌ０ｑ补涨ｓ０赵－ｗｌ０ｑ屮Ｓ如．ａｘＪ缶－ｏ３．＾班Ｉ繫ｎ婆Ｓｐ（ｕ补挺ｏＳ－｜靶ｏＵｄｃ，ｍ￥ｓ３ｕＪ＾＜０ｌＯｐｉｉＨ３３－＿－１Ｑｓ刍＇Ｓ＾＾－０３ｏｏｌｘ＾劣胆＆）ｏｌ？ｅｌ恤ｆ＾ｍｓｉ奮＾鏊二ｃｏＣ＾ｅ３＾Ｈ龌ｏｖｙ＾＋ｍ§词ａｐ（％ｕｏＭ＊ｌ｜／５－ｆｌｑｃｃｕｏ＾－ｊ０．ｃ＿１－２－ｔ？ｉｓ－＿－ｌ制＾Ｐ＞ｏ＾？｜漱ｕｏ｜ｎｕ３￡ｃ＾－＿＾￡ｊ矗＾１激３０？突３Ｃ靶＾２蝴§ｓ０函趔 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宂：试验二ＡＤｕｏｄｅｎｕｍＪｅｊｕｎｕｍＩｌｅｕｍｆＭｒｆ？Ｍ＾＂５ｓ§５－ｉｘ〇ＩＯ－ＪＸ２２ｌａＳＳ１＾Ｉｓｉ§ＺＯ－１－？？Ｒｍｍ濟義＿鑛齡ＭＩ２３０ｋＤ．ＬＯｃｃｕｎ－ｍ－＿ｍｍ＿＿ｍｍ？＊？？ｍ＿？？＊＊ｌｄｉ？ｍｕｔｍｍｍｍ５９ｋ〇ｐｄｈ－＿？ｇａ｜＿＿嚷＿＿１１３６ｋ〇ＢＣＯｃｃｕｄｎｌｉ４ＺＯ－１８－ｉ飞＜＊弋．ｒｌｉｆｃｉｌｉｉ＋ｎｗ－ＣｏＬＰＳＬＧＬＰ－２ＨｉＣｏｔｒｏ＋ｎｌ口ＬＰＳＬｏＧＬＰ２ｍｔｒｏｌ□ｏｗ＋－＋Ｈ－ＥＤＬＰＳ〇ＬＰＳＨｉｇｈＧＬＰ２Ｅ３ＬＰＳ□ＬＰＳｉｇｈＧＬＰ２－－ｌｄｉｎ、图１５ＧＬＰ２预处理对ＬＰＳ应激的断奶仔猪后ＺＯ１和ｏｃｃｕ在十二指肠中段空肠中段和回肠中段组织－－中表达的作用效果。Ａ：ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＺＯ１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白表达，ＧＡＰＤＨ为内参蛋白；Ｂ：高剂量ＧＬＰ２＝抑制了－／ｍＲＮＰｎ０ＬＰＳ降低的ＺＯ和ｏｃｃ／ｗ必？Ａ的表达，ＧＡＤＨ作为内参校正基因。重复数１。Ｆ－－－ｉｇｕｒｅ１５ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＧＬＰ２ｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｎｔｈｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆｚｏｎａｏｃｃｌｕｄｅｎ１ＺＯ１ａｎｄｏｃｃｌｕｄｉｎｉｎｔｈｅｐｐ（）－ｍ－－－－ｍｉｄｄｕｏｄｅｎｕｍｉｄｅｕｎｕｍａｎｄｍｉｄｉｌｅｕｍｉｎＬＰＳｃｈａｌｌｅｎｅｄｗｅａｎｅｄｉｌｅｔｓ．Ａ：ＺＯ１ａｎｄｏｃｃｌｕｄｉｎｒｏｔｅｉｎ，ｊｊｇｐｇｐｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．ＧＡＰＤＨｗａｓｕｓｅｄａｓａｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂ：Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ－－ｄｈｅ－ｔｈｅｉｄｉｄｏｃｃｌｕｄｌｌ．ｈｉｇｈｄｏｓｅｏｆＧＬＰ２（１０ｎｍｏｌ／ｋｇｒｅｖｅｎｔｅｔＬＰＳｎｄｕｃｅｄｅｃｒｅａｓｅｎＺＯ１ａｎｉｎｍＲＮＡｅｖｅｓ）ｐＧＡＰＤＨｗａｓｕｓｅｄａｓａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｅｎｅｆｏｒｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｅｎｒｅｌｉｃａｔｅｓ．ｇｐＡＤｕｏｄｅｎｕｍＪｅｊｕｎｕｍＩｌｅｕｍｆＳ＾ｆＭ＾＾＾一含吾｜＾ＳＳ一！ｓｉｉＩａｓｉＩ§ｉｉ■－－２１ｍ＾１ｋＤｉｃｋｍｍｗｍｄｈ＇邡ｇａｐｍｍｍｍｍ個齡确＿ｍｍ■＿＿ｋｄ—ｎｍｍｉｉｍＢＭＬＣＫ５ｎ＊＊气ｒｒｎｃ４．Ｉ＊＊￣．＊爸ｉｌ１Ｔ＼３－２：Ｉｒ）ｉｉ爆愈ＭＩ／／ｙ命＜／ＣｏｎＬＬＰ－２明ｔｒｏｌ口ＬＰＳ＋ｏｗＧＩＳ＋Ｈ－ＬＰｉｈＰＥ３ＬＰＳ□ＧＬ２ｇ－图１６ＧＬＰ２预处理对ＬＰＳ应激的断奶仔猪各肠段ＭＬＣＫ表达的作用。Ａ：ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＭＬＣＫ蛋５３ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验二白表达－２＾，ＧＡＰＤＨ为内参蛋白；Ｂ：高剂量ＧＬＰ抑制了ＬＰＳ提高的ＭＬＣＫｍＲＮＡ的表达，ＧＡＩＤＨ作为内参校正基因＝，重复数ｎ１０－－ＦｉｌｉｉＭＬＣＫｉｇｕｒｅ１６ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＧＬＰ２ｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｎｍｏｓｎｉｈｔｃｈａｎｋｎａｓｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎｅａｃｈｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐｙｇ（）ｐ－ｉｌｉｌ．ＣＫｉｉＷｅｓｓｅｇｍｅｎｔｎＬＰＳｃｈａｌｅｎｇｅｄｗｅａｎｅｄｅｔｓＡ：ＭＬｒｏｔｅｎｅｘｒｅｓｓｏｎｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｔｅｒｎｂｌｏｔ．ｐｇｐｐｙＧＡＰＤＨｗａｓｕｓｅｄａｓａ－ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇｒｏｔｅｉｎ．Ｂ：ＰｒｅｔｒｅａｌｍｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｈｉｈｄｏｓｅｏｆＧＬＰ２１０ｎｍｏｌ／ｋｐｇ（ｇ）ｒｅｖｅｎｔｅｄ－ｐｔｈｅＬＰＳｉｎｄｕｃｅｄｉｎｃｒｅａｓｅｉｎＭＬＣＫｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓ．ＧＡＰＤＨｗａｓｕｓｅｄａｓａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｅｎｅｆｏｒｇｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｆｔｅｎｒｅｌｉｃａｔｅｓ．ｏｐＤｕｏＩｄｅｎｕｍＪｅｕｎｕｍｌｅｕｍｊ＾＾ｒＭ＾７？ｉａｉ色ｉｅ：？」工Ｏ１工〇－Ｊｉｇ３－＊＊＋＋＋＋４＋＋ｗｃｔｔｔ￡ｉｃｏｔｎｃ（／＞ｌｄｌｏｒ）ｏｏ３＾＾＾３ｓ±５Ｔｈｒ１８／Ｓｅｒ１９獻ＭＬＣ－？＿＿ｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍ＜ｍｍｍｐ１ｇｋ〇ｇａｐｄｈ－ｌ＿葡麵＿ｍｉｌ＿３６ｋＤ图－２１７ＧＬＰ对ＬＰＳ应激的断奶仔猪小肠各段肠组织中ＭＬＣ磷酸化的作用。采用ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术进行检测，ＧＡＰＤＨ为内参蛋白。Ｆ－ｍｉｕｒｅ１７ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＧＬＰ２ｏｎｈｏｓｈｏｒｌａｔｅｄｏｓｉｎｌｉｈｔｃｈａｉｎＭＬＣｉｎｔｈｅｅａｃｈｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｇｐｐｙｙｇ（）－ＭＬＣＷｅｓｅｍｅｎｔｉｎＬＰＳｃｈａｌｌｅｎｅｄｗｅａｎｅｄｉｌｅｔｓ．Ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｒｏｔｅｉｎｗａｓｄｅｅｒｍｉｎｅｄｂｓｔｂｌ．ｇｇｐｇｐｐｔｙｅｒｎｏｔＧＡＰＤＨｗａｓｕｓｅｄａｓａｈｏｕｓｅｋｅｅｉｎｒｏｔｅｉｎ．ｐｇｐ４．讨论４－．１．ＧＬＰ２对受损肠粘膜屏障通透性的影响Ｄ－－ａＣｔａｔｅ，ｌ是细菌发酵产物在哺乳动物组织中不能生成或代谢，在血浆中的水（）３一１［－－平相当低。因此，Ｄｔｔ＼由ｌａＣａｅ被认为是种有效评估肠道通透性的早期指标（）于ＤＡＯ主要存在于肠粘膜中，而血浆中几乎不存在，所以肠粘膜ＤＡＯ酶活可作为２９１［］ＤＡＯ，血肠粘膜完整性及损伤的标志物；此外浆酶活也作为预测肠道损伤的标志３２３３１，１［］。ＬＰＳ是革兰氏阴性菌的外膜，可引起动物强烈的免疫反应。本试验中，断奶当天血浆ＬＰＳ的水平低于试剂盒最低检测限，提示仔猪肠道健康，肠粘膜屏障功能７ＬＰＳ水平提高到平均水０２１ＥＵｍＬ，正常。在断奶第天由血浆中平为．／对照组血浆－Ｄ－ｔａｔ５１％ＤＡＯ０００％（）ｌａｃｅ水平较断奶水平提高了．００，同时酶活较断奶水平提高了６．，结果提示断奶应激导致了轻微的肠粘膜屏障损伤，从而使肠上皮通透性有所提高。本－－试验中在断奶后第１４天，对照组血浆ＤｌａＣｔａｔｅ和ＤＡＯ（）酶活水平已降至断奶水平，ＬＰＳＤ－－ｔＤＡＯ应激组血浆（）ｌａｃａｔｅ和酶活分别较断奶水平高８３．８３％和８１．６４％；而与５４ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验二－－，ＬＰＳ应激导致断奶仔猪血浆ＤａｃｔａｔｅＡＯ对照组相比（）ｌ和Ｄ酶活，分别显著提高了１００．００％和１８０．００％，并使应激２４ｈ后十二指肠和空肠粘膜的ＤＡＯ酶活分别降低了１２９ＰＳ［］３６％和４９％，以上结果表明Ｌ应激严重损伤了肠粘膜屏障功能，而这与他１１等的研究结果相似。－－－然而，断奶第７天ＤｔＤＡＯ，高剂量ＧＬＰ２处理显著抑制了血浆ｌａＣａｔｅ和酶活（）－的提高，，ＧＬＰ２；并且断奶第１４天预处理剂量依赖地缓解了ＬＰＳ引起的肠粘膜通透性的增加，对抑制细菌及其代谢产物的入侵显示出长期的作用效果。本试验结果与２８一［］ＧＬＰ－２ａｍｅｒｏｎｅｒｄｕｅ）在其它动物模型上的研究结果致。Ｃ和Ｐ（２００５在小鼠上发现ＬＰ－２预处理能降低细菌的粘附和对上皮的入侵，提前４ｈ进行Ｇ，改善由缺水应激（ｗａｔｅｒａｖｏｉｄａｎｃｅｓｔｒｅｓｓ）导致的空肠、回肠和结肠上皮屏障通透性的增加Ｈａｄｉａｎｎｉ。ｊｙ３［］（２００９）在非肥胖的糖尿病（ｎｏｎｏｂｅｓｅｄｉａｂｅｔｉｃ）小鼠上发现上ｌ〇／ｄ，ｎｇ剂量连续－ｄ２显著改善了空肠的跨膜电阻－１４注射ＧＬＰ。总而言之，以上结果提示ＧＬＰ２能缓解断奶仔猪肠道损伤，并增强肠屏障功能以抵御断奶后遭遇各种应激因素的损害。４－．２ＧＬＰ２对ＬＰＳ应激导致的断奶仔猪肠炎的影响在病理条件下，，，随着肠道通透性的增加抗原物质直接侵入固有层触发Ｔ细胞－－－产生促炎性细胞因子。研究证实，许多促炎性细胞因子（包括ＩＬｌ、ＩＬ６和ＴＮＦａ）ｐ５６５８５９１３４１，＇，］能刺激细胞旁路的通透性。本研宄测得断奶第７天仔猪促炎性细胞因子９［一］－－－－ＩＬｌｐ、ＩＬ６、ＩＬ８和ＴＮＦａ的血清水平均显著提高。这与Ｐｉｄ等（２００４）的报道－ＩＬｌ－致，该研宄指出仔猪断奶后血清ｐ水平显著增加，伴随小肠中和７７＾〇（ｍＲＮＡ表达量显著增加。此外，本研宂结果显示，ＬＰＳ应激后，促炎因子的血清水平及在小肠各段中ｍＲＮＡ的表达量均显著提高ＧＬＰ－２；处理抑制了断奶引起的血清促炎性细胞因子的提高ＬＰ－２。本试验中Ｇ的抗炎作用与在其它研究模型上得到的结果（一３）２６１３５［］［］［］致，、、，包括肥胖小鼠患小肠炎葡聚糖硫酸酯引起的急性结肠炎术后肠５１１３２７１［］］［］梗阻的小鼠，ＬＰＳ应激的断奶仔猪，患炎性肠病、三硝基苯磺酸引起的回肠２９］２６［一［］］－炎、坏死性小肠结肠炎的大鼠等。本研究还发现ＧＬＰ２的预处理在断奶后定时期内抑制了由ＬＰＳ提高的促炎性细胞因子的血清水平及小肠各段中基因的表达水一－平，。分析其原因很可能与试验中测得的ＧＬＰ２内源基础水平的显著提高有关；—从断奶当日起至断奶第－２１４天，高剂量组血浆ＧＬＰ直保持在断奶及以上的水平，这可能使得断奶后肠道适应性恢复更快完成，这有利于断奶期间肠道对营养物质的消５５ 二四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验化吸收；，，以及后期生产性能的改善其次通过肠道形态学的变化可以看出体内较高－水平的ＧＬＰ２有利于保护仔猪肠粘膜结构屏障的完整性以抵抗不良应激的破坏作用。－ＬＰ－２ＧＬＰ２的以上研究结果揭示了通过外源Ｇ提高内源基础水平，可作为防治应激导致肠炎的一种途径。４－．３ＧＬＰ２对ＴＪ蛋白表达量的影响那么－２在？越，ＧＬＰ断奶仔猪遭受应激的条件下是如何影响肠炎的发生发展的呢来越多的观点认为，防御性的肠道ＴＪ屏障对于肠炎的发生发展有着至关重要的作用１３６１，３７［］－。Ｌ。因此推测，ＧＬＰ２可能经ＴＪ信号影响参与抗炎响应的关键蛋白的表达ｉｕ９６２［］等（００８）研究发现早期断奶仔猪肠通透性的增加可能归因于肠上皮ｏｃｄｕｄｉｎ一－ｃｃｍＲＮＡ表达的降低。ＺＯ１是种膜蛋白，定位于胞衆ｏｌｕｄｉｎ的末端，从而形成稳－定的连接系统。ＺＯ１和ｏｃｄｍｉｉｒｉ表达的増加对于降低细胞旁路通透性有着重要的作１３９１ＺＯ－用。本研究中，我们对肠组织中１和ｏｃｄｕｄｉｎ的表达及分布进行了测定。Ｏ－结果显示１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ表达下降而本研究首次在断，ＬＰＳ引起断奶仔猪肠上皮Ｚ；－２在ＬＰＳ应激条件下促进了十二指肠奶仔猪上研宄发现外源ＧＬＰ、空肠和回肠中段－－ＺＯ１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的表达。关于ＧＬＰ２对ＴＪ蛋白的影响，仅见零星文献报道。与１４Ｇ］Ｃｈ２００［本研究结果相似地，在体内试验中ｅｎ等（８）在梗阻性黄瘡的小鼠上发现－－ＧＬＰ－２促进了肠ＺＯ／和ｏｃｃ２不仅促进未感染／ｗｄ／ｎ的ｍＲＮＡ表达。在奶牛上ＧＬＰ１４１［］艺的奶牛ＴＪ相关蛋白的表达，也能抑制引起的肠组织ＴＪ蛋白的下调。－２显Ｃａｃｏ－２细胞系ＺＯ－此外，在体外试验中，ＧＬＰ者提局了１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的表达，６１４２［］［】－缓解了ＴＮＦａ引起的通透性的增加。在离体培养的断奶仔猪空肠肠段以及正常１４３［｝－Ｊ２－的ＩＰＥＣ细胞上研究发现，添加ＧＬＰ２能显著促进ＴＪ蛋白的表达，增强肠上皮屏障功能－２剂量ＬＰＳ对ＴＪ。此外，免疫组织化学分析显示ＧＬＰ依赖地抑制了蛋白超－ＺＯ１ｌｕｄｉｎ。微结构和分布的破坏作用，使和ｏｃｃ蛋白的蜂窝网状结构更为完整因此，断奶后ＧＬＰ－２的高水平可持续促进ＴＪ相关蛋白表达以抵抗不良应激对ＴＪ结构的改。变，，，有利于肠屏障功能的维持从而减少入侵粘膜下层的有害物质缓解肠炎的发生４－２ＬＣＫＭＬＣ旁路的影响．４ＧＬＰ对Ｍ／ｐ在维持ＴＪ结构稳定方面，研究发现ＭＬＣＫ表达量的增加可提高ＭＬＣ的磷酸化ＭＬＣ的磷酸化牵拉肌动蛋白Ｆ－ａｃｔｉｎ，水平，骨架使其发生位移由此导致与其相连的“”－ｏｃｃＺＯ１和ｌｕｄｉｎ蛋白结构发生重排，ＴＪ发生泄露，从而提高肠上皮细胞间通透性５６ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验二１４４丨３４１４５［［，］］Ａ－－ｌ（（ＴＮＦ。Ｓａｄｉ等２０１６）和Ｙｅ等２００６）报道，促炎性细胞因子ａ通过－Ｊ－ｋＢ激活ＭＸＸ的基因表达引起肠上皮Ｔ通透性的增力，ＩＬｌＮＦ［］。此外ｐ也通过提高５７一Ｊ［］－依赖的ＭＸＸ基因转录水平介导Ｔ通透性的增强。为了进步阐明ＧＬＰ２与断奶－仔猪肠道ＴＪ之间的关系，我们测定了ＧＬＰ２和ＭＬＣＫ信号旁路的信号分子之间的关系。研究结果显示，伴随肠炎的发生，ＬＰＳ应激提高了ＭＬＣＫ的表达量及ＭＬＣ的磷－２的预处理在降低促炎因子产生的同时酸化水平，显著降低。值得注意的是，ＧＬＰ了小肠各段中ＭＬＣＫ的基因和蛋白表达，并伴随ＭＬＣ磷酸化水平的下降。以上结果表明７ＭＬＣＰ－２缓解ＬＰＳ应激的断奶仔猪肠道炎症及屏障损伤中处，ＭＬＣＫｐ可能在ＧＬ于关键地位。然而，根据前人研宄指出促炎性细胞因子的产生也会刺激肠上皮细胞一ＭＬＣＫ的表达ＭＬＣ信－，因此我们有必要进步研究阐明ＭＬＣＫ／ｐ号是直接受到ＧＬＰ２调节还是间接受到下调的促炎性细胞因子的调节－２对肠屏。那么，在应激早期，ＧＬＰ－障功能的维持除了促进ＴＪ蛋白的表达外，ＧＬＰ２能否通过直接作用于ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ“”防止肠炎发生前肠上皮细胞间ＴＪ结构的泄露，以减少或避免抗原物质或ＬＰＳ等入侵粘膜下免疫系统呢？回答这个问题，可以帮助我们更好理解仔猪断奶后肠炎的病理发生发展过程，使得防预工作更具靶向性。５．小结－结果表明：ＧＬＰ２能缓解ＬＰＳ应激的断奶仔猪肠粘膜屏障损伤及炎症的发生；这与ＧＬＰ－２调节紧密连接ＺＯ－ｏｃｃｌｕｄ１和ｉｎ蛋白的表达和分布有关。５７ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三试验三ＧＬＰ－２对应激的ＰＥＣ－Ｊ２肠上皮细胞间通透性Ｉ的调控作用及分子机制研究一（）研究模型的建立１前言试验二结果显示ＧＬＰ－２能缓解断奶仔猪应激后的肠屏障功能损伤，这可能主要与ＴＪ结构的稳定有关。然而，试验二中可能参与调节ＴＪ结构稳定的ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣＬＰ－２ＬＰ－２信号是受到Ｇ的直接调控，还是Ｇ抗炎作用的间接结果尚不能明确。为了一一ＧＬＰ－２对肠上皮细胞间通透性的调节作用及其分子机制进步明确，有必要进步开展体外细胞试验进行研宄ＬＰ－２在不同细胞上的营养生理效应受到添加剂。由于Ｇ－２ＬＰＳ量的影响而有所不同，ＧＬＰ，因此本试验通过体外试验研究的添加对应激的仔猪肠上皮细胞单层通透性的作用效果，确定ＬＰＳ应激条件下的最适添加剂量。此一－２Ｒ在－，夕卜，表达ＧＬＰ２Ｒ的细，ＧＬＰ肠道中分布是Ｇ蛋白偶联受体超家族成员之ＬＰ－２ｃＡＭＰ－胞排它性地响应Ｇ增加的生成，但是对ＧＬＰ１或相关肽没有响应，表明３５［］－－２Ｒ信号转导途径发挥肠道营养效应ＧＬＰ２特异性激活肠道中ＧＬＰ。因此，本试验－－有必要对选取的仔猪肠上皮细胞系ＩＰＥＣＪ２能否表达功能性ＧＬＰ２Ｒ进行鉴定后再用于后续试验。２材料与方法一－，试验三（）共需３个小１）ＩＰＥ为实现研究目的开展试验：ＣＪ２细胞系表达－－－－ＧＬＰ２Ｒ的鉴定２）ＬＰＳＩＰＥＣＪ２３）ＧＬＰ２缓解应激的ＩＰＥＣＪ２；诱导应激模型的建立；细胞单层通透性的作用研宄。２１－．ＧＬＰ２Ｒ的鉴定２．１．１实验材料２．１．１．１原材料和试剂５８ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三－ＡＴＣＣ（Ａｍｅｃａｎｅｕ新生仔猪空肠上皮细胞系ＩＰＥＣＪ２，购买自细胞库ｒｉＴｙｐＣｌｔｕｒｅ？ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＵＳＡ）；ＧｉｂｃｏＤＭＥＭ高糖培养基、澳洲胎牛血清ＦＢＳ，购自中国Ｔｈｅｒｍｏ，Ｆｉｓｈｅｒ科技公司；胰岛素，购自美国ｓｉｇｍａ公司；ＥＧＦ，购自Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ中国分公司；青链霉素双抗，购自中国Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司；无菌ＰＢＳ溶液，购自美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；ＰｒＳｔＲＴＲｔＫｔＷｔｈＤＮＡＥＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａＴＭｉｍｅｃｒｉｐｅａｇｅｎｉｉｇｒａｓｅｒ反转录试剂盒、ｑ－ＩＩＴＨＰｌｕｔｌｉＲＮａｓｅｓＲＴＰＣＲｋｉ，购自中国大连宝生物ＴａＫａＲａ生物技术有限公司。（）ｅｓ－２Ｗｔｅｒｎｂｌｏｔ：兔多克隆抗体ＧＬＰＲａｎｔｉｂｏｄｙ，购自北京博奥森生物技术有限公司，购自美国ｅａｒｔｈｏｘ公司蛋白ｍａｒｋｅｒ；羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗；￣（ｌｌ２４５ｋＤ），购自中国天根生化科技有限公司；ＢＣＡ蛋白定量试剂盒、跨膜蛋白提上海贝博ｂ一ｅｓｔｂｉｏ生物公司取试剂盒，购自；抗稀释液、ＥＣＬ特超敏化学发光试剂ｒｓ，ＡＰ过硫酸盒，购自中国碧云天生物技术研究所ｉ购自美国Ｓｉｍａ公司；Ｔｇ；铵、－－甘氨酸Ｇ（，购自ａｍｒｅｓｃｏ；１．５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（Ｈ８．８）、ｌｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌｌｙ分析纯）ｐｘ－（６８，ｏｌａｒｂｉｏ５ｐＨ．）购自中国Ｓ公司；蛋白上样缓冲液（含ｐ巯基乙醇），购自中国ａｂｅ－－ｍｗｅｅｎｃｏＡｃｒｓ（：），Ｃｏｏｌｒ公司；ｓｋｉｍｉｌｋ、Ｔ２０，购自Ｄｉｆ；３０％Ｂｉ２９１、ＳＤＳ和ＴＥＭＥＤｏ－Ｒａｄ公司购自Ｂｉ；其它常用试剂均为国产分析纯试剂或生化试剂。－免疫荧光相关试剂：免疫染色固定液、Ｔｒｉｔｏｎ１００Ｘ、免疫染色封闭液、ＦＩＴＣ标记山羊抗兔ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＤＡＰＩ染色液，均购自碧云天生物技术研究所。２．１．１．２器仪超净工作台（苏净安泰）、普通ＰＣＲ仪、ＩＱ５实时荧光定量ＰＣＲ仪（美国Ｂｉｏｒａｄｅ－公司）、ＷｌｌｓａｎＭＫ型酶联免疫分析仪（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司）、Ｂｉｏｒａｄ蛋白电泳仪／倍－－乐小型垂直电泳槽、ＢｉｏＲａｄ半干电转移槽、Ｂｉｏｒａｄ凝胶成像系统（美国Ｂｉｏｒａｄ公）（司、莱卡荧光倒置显微镜德国Ｌｅｉｃａ公司）、低温离心机、水浴锅、普通摇床等。２．１．２试验方法２．１．２．１细胞培养－２６Ｊ孔细胞培养板ｏｌ／ｖｏｌ）将仔猪空肠上皮细胞系ＩＰＥＣ接种于，添加含有１０％（ｖ胎牛血清、１％抗生素（１００Ｕ／ｍＬｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ和１００ｉ／Ｌｓｔｒｅｔｏｍｃｉｎ）、４ｘ／ｍＬ胰岛［ｇｐｙｊｇＥＧＦ素、ｌ＾ｉｇ／ｍＬ的含４．５ｍｇ／ｍＬ葡萄糖的ＤＭＥＭ高糖培养基进行培养。将培养板°置于３７Ｃ，５％Ｃ０２，９５％湿度的二氧化碳培养箱中培养，每隔１天更换培养基。待，铺满培养板底部，将细胞用无菌的ＰＢＳ缓冲液（Ｈ７４细胞完全汇合ｐ．）洗３次，每５９ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三１１ＲＮＡ隔天换液次，待细胞完全融合铺满孔底，收集细胞分别提取ｍ和跨膜蛋白。２．１．２．２ｍＲＮＡ提取和反转录２—方法同试验二．５。ＲＮＡｚｏＲＴ总细胞的提取使用ＴＲＩｌ步提取法，用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲｅａｇｅｎｔＫｉｔＷｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ反转录试剂盒将提取的ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，保存于－２０Ｔ：备用。２．１．２．３细胞跨膜蛋白的提取－Ｊ２按跨膜蛋白提取试剂盒操作步骤提取ＩＰＥＣ细胞的跨膜蛋白，将蛋白样品用°ＢＣＡ－８０Ｃ待测０ｍｍ法定量后分装保存于。操作步骤如下：将细胞接种于１细胞培养皿中，待细胞铺满皿底，吸去培养基，用预冷的ＰＢＳ缓冲液漂洗细胞，吸干残余液体；加入２００卟试剂Ａ，２卟蛋白酶抑制混合物和２卟磷酸酶抑制剂混合物，涡旋°振荡１５ｓｅｃ混匀，冰上静置１５ｍｉｎ；再次涡旋振荡５ｓｅｃ混匀，在４Ｃ条件下，１３０００ｘｇ°１上清＞离心５〇１丨１１，于３７£〇１１１丨１１温２０００１１１丨１１，；吸取水浴１，常＾离心５溶液分为上层￣水相和下层有机相吸去水相后，用１５０２００，冰上放置２ｍｉｎ；ｐＬ试剂Ｂ稀释有机相°，３７（：水浴１〇（＾５，后１１１丨１１，常温２００§离心１＾１１溶液再次分为上层水相和下层有机，相：根据有机相的体积用适量试剂Ｃ进行稀释得到跨膜蛋白。２．１．３检测指标２１３１ＧＬＰ－２ＲＲＮＡ．．．的ｍ检测－ＧＬＰ－２ＲＲＮＡＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａＴＭＩＩＴｌｉＲＮａｓｅＨＰｌｕｓＲＴＰＣＲ的ｍ使用ｑ试剂（）－盒进行荧光定量ＰＣＲ反应。ＧＬＰ２Ｒ的引物序列见下表１。１－表１ＧＬＰ２Ｒ１引物序列Ｔ－ａｂｌｅ１ＧｅｎｅｒｉｍｅｒｓｓｅｅｏｆＧＬＰ２Ｒ１ｐｑｕｅｎｃ’’’’Ｆ（５－３）Ｒ（５－３目的片段基因）ＧＬＰ－２Ｒ５－ＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＴＴ－３５－ＣＣＡＧＧＧＡＡＴＡＡＣＡＡＡＣＡＧＣ－３１６３－采用ＩＱ５实时荧光定量ＰＣＲ仪进行定量ＲＴＰＣＲ扩增。按照试剂盒说明书配制１２．５＾１＾？〇１反应体系，体系组成见表１２。１１７＾〇１程序如下：９５１：预变性１０５６（：，°Ｃ变性°循环１次；９５５ｓｅｃ，５５Ｃ退火３０ｓｅｃ，循环４０次。为了鉴定ＰＣＲ产物的特异°Ｃ°°性，进行溶解曲线分析：扩增完成后以０．５为温度梯度从６５Ｃ逐步升温到９５Ｃ读取融解曲线。６０ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三表１２荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ反应体系Ｔａｂｌｅ１２Ｍｉｘｔ－ｕｒｅｏｆｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ体系组成体积ＳＹＢＲＩＩ２ｘ６．２５Ｌ（）ｐｆｏｒｗａｒｄｒｉｍｅｒ５．ｍｏｉ／Ｌ１．０ｐ（ｐ）ｒｅｖｅｒｓｅｒｉｍｅｒ５ｉｍｏｌ／Ｌ］．０Ｌｐ（［）ｐｃＤＮＡｌ１．０Ｌｔｅｍｐａｔｅｉ＾ＤＥＰＣｔｒｅａｔｅｄｗａｔｅｒ３．２５ｉＬ＼２－．１．３．２ＧＬＰ２Ｒ的ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检须！｜－二２１方法同试验．５．７，兔多克隆ＧＬＰ２Ｒ抗体的稀释比例为１：００。２－．１．３．３免疫荧光技术检测ＧＬＰ２Ｒ的细胞亚定位ｘ，用预热的３ｍ细胞培养结束后ｌＰＢＳ缓冲液漂洗次；每孔加１Ｌ免疫染色固定－液，，，室温静置孵育２〇１？丨１１去除固定液每孔加入１１１１１＾＾３洗６次０１＾２１１；由于为跨膜蛋白，染色过程不进行通透处理。每孔加入ｌｍＬ免疫染色封闭液，室温静置一ｘＰＢＳＬＰ－２ｈｌ６２Ｒ：２５，洗次；将兔抗Ｇ多克隆抗体用免疫染色抗稀释液按１的比°°６００ＧＬＰ－２ＲＣ过夜ｘ例稀释后，于３７Ｃ静置３０ｍｉｎ，１ＰＢＳ，每孔加入叫抗体稀释液，４００－溶液洗６次用免疫染色二抗稀释液按１，：１的比例稀释羊抗兔ＦＩＴＣ标记的二抗；二°每孔加入６００ａＬ抗稀释液，避光于２５Ｃ静置２ｈ，用ｌｘＰＢＳ溶液洗８次每孔加；ｉ入５００吣ＤＡＰＩ染液，在摇床上室温轻摇１ｈ，ｌｘＰＢＳ洗３次；每孔加入１ｍＬ５０％甘油抗淬灭剂（ＰＢＳ配制，ｖｏｌ／ｖｏｌ），在室温下进行避光观察。２．２ＬＰＳ应激模型的建立２．２．１试验设计使用不同终浓度０、１０、５０、１００、１５０／ｍＬＬＰＳ（Ｍｇ）的溶液进行试验（见表１３）。共分为５个处理，每个处理３个重复，每个重复１孔细胞。根据２４ｈ内通透性变化及细胞毒理活性的结果确定最适应激剂量用于后续研究。６１ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三表１３ＬＰＳ应激损伤的试验设计Ｔａｂｌｅ１３ｔｈｅｄｅｓｉｇｎｏｆＬＰＳｓｔｒｅｓｓ处理组１２３４５重复数３３３３３ＬＰＳ应激（／ｍＬ）０１０５０１００１５０ｎｇ２．２．１实验材料２．２．１．１原材料和试剂一２．细胞培养试剂同试验三（）．１．１．１五ｃｏ／／ＬＰＳ、ＨＲＰｉｍａ公；，购自美国Ｓｇ司；ＴＭＢ底物显色试剂盒Ｚｏｍａｎｂ－ｉｏ生物基因科技有，购自北京限公司；ＣＣＫ８细胞活ｏｎｄｏ公ｒａｎｓｗｅ－性检测试剂盒，购自日本Ｄｉ司ｌｌＣＯＬ细胞嵌套培ｊ；６孔胶原包被的Ｔ２’７ｃｍＨＢＳＳ养板（４．６，０．４ｍ孔径），购自美国ｃｏｍｉｎ公司Ｈａｎｋｓ）ｐｇ；平衡盐溶液（，购自中国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ科技公司。２．．２１．２仪器Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ－ｅｃｔｒＥｌｉｃａｌＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＳｙｓｔｅｍ细胞电阻仪（美国Ｍｉｌｌｉｏｒｅ公司、Ｗｅｌｌｓａｎｐ）ＭＫ型酶联免疫分析仪（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司）、Ａ２００型倒置相差多功能生物显微镜（德国Ｚｅｉｓｓ公司）、ＢＢ５０６０ＵＶ型细胞培养箱（德国Ｈｅｒａｅｕｓ公司）。２．３．２试验方法５一ｘ细胞培养方法同试验三（）２．１．２。进行细胞通透性试验时将细胞以ｌｌ〇的密６Ｔｒａｎｓｗｅ－度接种于孔胶原包被的的ｌｌＣＯＬ嵌套膜上。当单层细胞跨膜电阻达到１００００２？ｏｈｍｓｃｍ，更换完全培养基为无血清的ＤＭＥＭ高糖培养基，细胞饥饿１２ｈ后，添加不同终浓度（０、１０、５０、１００、１５〇ｎｇ／ｍＬ）的ＬＰＳ溶液进行攻毒，分别在加入ＬＰＳ后不同的时间点０４、８、１２、１６、２０、２４ｈ、测定单层细胞跨上皮电阻值ＴＥＲ；ＴＥＲ试验结束后，测定２ｈ内细胞单层对大分子物质ＨＲＰ的漏过率。２．２．４检测指标２．２．４．１跨膜电阻ＴＥＲ的测定ｃｅ－ＥｅｃｔｒｉｃａＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｓｔｅｍ采用ＭｉｌｌｉｌｌｌｌＳｙ仪器按照仪器使用说明分别测定各组单层细胞处理０４、８、１２、１６、２０２４ｈ的ＴＥＲ。使Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、和用时将电极插入待测量的６２ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三嵌套，长电极在外部，短电极在内部ｅｌｌ３个，；每个Ｔｒａｎｓｗ均在不同位置进行测定Ｔｍｎ一重复测定至读数接近时记录数值。因为ｓｗｅｌｌ膜本身也具有定的ＴＥＲ，因此标准的ＴＥＲ应将样品的实测ＴＥＲ值减去空白对照的ＴＥＲ值，再乘上Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ面积便２得到计算细胞单层的跨上皮电阻值（ｏｈｍｓｗｍ）；２．２．４．２ＨＲＰ漏过率４６１［］ＨＲＰ－Ｊ２使用大分子物质测定ＩＰＥＣ细胞单层的通透性。ＴＥＲ试验结束后（加°’２４ｈ－入ＬＰＳ溶液，ａｎｓｗｅｌＣ的Ｈ后）移去ＴｌＣＯＬ嵌套中的培养基，用预热到３７ａｎｋｓ°（底室）换为３７ＣＨＢＳＳ溶液２６００Ｌ（平衡盐溶液洗１次；将外室ｐ，内室顶室）°％加入ＨＲＰ（１００吨／ｍＬ，溶于ＨＢＳＳ液）５００ｐＬ；于３７Ｃ、５Ｃ０２条件下孵育２ｈ后，收集底室液体。使用ＴＭＢ底物显色试剂盒测定ＨＲＰ的浓度。试验原理：ＨＲＰ催化ＴＭＢ显色底，加酸终止反应，０物工作液产生蓝色阳离子产物，蓝色转变为黄色吸收峰在波长４５ｎｍ。用ＨＲＰ制作标准曲线：称取ｌｍＨＲＰ，溶于ｌｍｌＨＢＳＳ溶液中。采用倍比稀释ｇ０１１１Ｌ。法配制各浓度标准液．５６２５、０．２５３、０．６２５、１．２５、２．５、５、０ｎ／ｍ，其浓度分别为０、ｇ将标准品和样品分别与ＴＭＢ工作液充分混匀室温避光孵育３０ｍ，反应产物为蓝色。ｉｎ每孔加５０ｐＬ浓度为０．５ｍｏｌ／Ｌ的Ｈ２Ｓ０４溶液终止显色，产物变为黄色，用酶标仪在４５０ｎｍ波长下进行测定。根据标准曲线计算ＨＲＰ含量，以通过的底室ＨＲＰ的浓度（用ｎｇ／ｍＬ表示）反映单层肠上皮的通透性。２．２．４．３细胞毒性活力检测－ｅ－检测原理：在１ＭｔｈｏｘｙＰＭＳ存在条件下，ＣＣＫ８被还原生成橙黄色水溶性的甲臜产物，，细胞毒性越大颜色越浅。在４５０ｎｍ波长处的吸光度Ａ可间接反映活细３胞数量和试剂的毒理效应。试验方法：在９６孔细胞培养板中按ｌｘＩ〇密度滴加１〇〇°％细胞悬液，将细胞培养板置于３７Ｃ、５Ｃ０２的细胞培养箱中预培养，待细胞贴壁并°？融合至５０％６０／。，每孔加入１０吣不同剂量的ＬＰＳ溶液，使其终浓度为０、１０、５０、ｌＬＣＣＫ１００、１５０ｐｇ／ｍＬ，继续培养２４ｈ后，每孔加入〇ｉ８溶液，继续将培养板置于ｔ培养箱中孵育２ｈ，测定４５０ｎｍ波长处的吸光度Ａ。？＝－Ａ－Ａ（加Ａ（（Ａ细胞活力的计算公式？细胞活力（％）药）空白）］／［未加药）［ｘ（空白）ｌ００］Ａ（加药）：加入细胞、ＣＣＫ８溶液和药物溶液的孔的吸光度；６３ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三Ａ（空白）：加入培养基和ＣＣＫ８溶液，但没有细胞的孔的吸光度；Ａ（０加药），但没有药物溶液的孔的吸光度。：加入细胞、ＣＣＫ８溶液２－．３ＧＬＰ２最适剂量的确定２．３．１试验设计＃７－Ｘ？采用不同浓度（Ｉ１０１（Ｔｍ〇Ｉ／Ｌ）ＧＬＰ２进行最适浓度摸索（见表１４）。试验共分为６个处理，每个处理３个重复，每个重复１孔细胞。－表丨４ＧＬＰ２保护作用的试验设计－ＴｉＬＰ２ｉａｂｌｅ１４ＴｈｅｄｅｓｎｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｏｆＧｒｅｔｅｃｔｖｅｅｆｆｅｃｔｓｇｐ处理组１２３４５６重复数３３３３３３＇＇＇＇！０９８７－２ＧＬＰｌ／）００ｌ〇１０１０１０浓度（ｍｏＬＰ－ＧＬ２丨ｈＬＰ２４ｈ预处理后，添加Ｓ应激Ｓ应／）０１ＬＰ激（ｎｇｍＬ１００００１００１００１００２．３．２实验材料２．３．２．１原材料和试剂一三（）２．１细胞培养试剂同试验．１．１。２．３．２．２仪器ｃｅｌ－ｎＭｉｌＨｌＥｌｅｃｔｒｉｃａｌＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＳｙｓｔｅｍ细胞电阻仪（美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）、ＷｅｌｌｓａＭＫ型酶联免疫分析仪（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司）２．３．３试验方法一２２三（３考察细胞单层通透性的细胞培养方法同试验）．．。当测得ＴＥＲ值约为２＊ＧＬＰ－２预处理１００００ｏｈｍｓｃｍ，加入不同剂量的１ｈ后，添加１００ｉ／ｍＬＬＰＳ，考察ｉｇ２４ｈ内不同时间点细胞单层跨上皮电阻ＴＥＲ以及２４ｈ后的ＨＲＰ漏出率。２．３．４检测指标三一１）跨膜电阻ＴＥＲ的测定：同试验（）２．２．４．１。一２）ＨＲＰ漏过率：同试验三（）２．２Ａ２。３一ｘ３）细胞毒性活力：同试验三）２，２．４．３。９６孔细胞ＩｌＯ密度（在培养板中按６４ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三滴加１００ｐＬ细胞悬液，将细胞培养板置于细胞Ｃ〇２培养箱中预培养，待细胞贴壁并融合至５０％？６０％－，每孔加入１０必不同剂量的ＧＬＰ２溶液，使其终浓度为－１Ｇ７ｘ？ｘｍ〇ｌｌ〇ｌｌ（Ｔｌ／Ｌ，处理１ｈ后添加１００ｐｇ／ｍＬＬＰＳ继续培养２４ｈ后，每孔加入１０Ｋ－８溶液，置，５０ｎｍ处的吸光度ＨＬＣＣ于细胞培养箱中继续孵育２ｈ测定波长４，计算细胞活力。２．４试验数据处理±ＳＥＭ表ＰＳＳ７０－ＡＮＯＶＡ试验数据均以平均值示，采用Ｓ１．软件进行Ｏｎｅｗａｙ单＜因素方差分析，不同试验组间平均值采用ＬＳＤ法进行差异显著性检验，以尸０．０５表示差异有显著性意义。３结果３ＧＬＰ－２Ｒ．１的鉴定结果ＲＴ－ＰＣＲ－本试验分别使用ｑ、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ和免疫荧光染色技术对ＩＰＥＣＪ２细胞系－的ＧＬＰ－２Ｒ表达。结果如图情况进行了鉴定１８所示，ＩＰＥＣＪ２细胞系能表达具有生－－物学功能的ＧＬＰ２Ｒ。图１８Ａ显示了ＧＡＰＤ／／内参基因和ＧＺＰ２／？基因的扩增曲线、溶解曲线和溶解曲线峰值；图１８Ｂ中对细胞总蛋白进行ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测，结果发ｍａｒｋｅｒ为对－现，以预染照，ＧＬＰ２Ｒ分子量大小为６８ｋＤ左右，与所购６８ｋＤ的兔抗一ＧＬＰ－２Ｒ多致－－－２克隆抗体分子量大小。图１８Ｃ显示了ＦＩＴＣ标记的ＧＬＰ２Ｒ在ＩＰＥＣＪ细胞系中的亚细胞定位主要位于细胞膜和胞浆。３．２ＬＰＳ应激模型的建立３．２．１不同剂量ＬＰＳ处理对细胞单层ＴＥＲ的影响如图１９Ａ中２４ｈ内细胞单层ＴＥＲ的变化趋势图所示，与对照组相比，剂量为１０｜ｉｇ／ｍＬ的ＬＰＳ处理对ＴＥＲ的作用效果不明显；５０ｎｇ／ｍＬＬＰＳ处理使细胞ＴＥＲ在８ｈ内急剧降低，之后趋于平缓ＬＰＳ／ｍＬ５０／ｍＬ，；而当的添加剂量为１００ｇｇ和１ｐｇ添加ＬＰＳ２４ｈ内细胞单层ＴＥＲ值持续降低。通过对ＬＰＳ处理２４ｈ后的ＴＥＲ值进行统计分析（如图１９Ｂ所示），结果显示：与对照组相比，剂量为１００和１５０ｐｇ／ｍＬ的ＬＰＳ溶液显著降低了细胞单层的跨膜电阻ＴＥＲ值（户＜０．０５），二者之间差异不显著６５ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三（尸＞００５）。．ｃ＊ｖｍｒ？－８０００Ｔ－￣￣——Ａｒ１，Ｔ基｜＊Ｍ－■＃（ｆ＼ｉ－２０００‘０ｆｆ５００丁ＧＡＰＤＧＡＰＤＨ＼、＇？－■，Ｍ〇－＜Ｐ２Ｒ？ｍＧ－／ＬＰ２Ｒ；＾＜－－■■■－－：〇ＴＴ－Ｌ——吟…；７Ｔ—ｒｒｉ〇６５７０７８ａ〇８５＃０？６ｆ〇２０３０４０＾ＣＭＴ＊ｍｐ？ｒ？ｔｕｉｒｔ．Ｃ？ｌｓｈＭｙｔｍｔｋ＾１１＇一ＧＡＲＤＨＢ：：：丨＝：：鲁■｜ＧＬＰ－２Ｒ—？＿—－Ａｌ—＝／０－．ｒ．口：…－４．－一一？２５ｋＤＵ＾６６７０７Ｓ８０８５９０９５＾２０ｋＤ－Ｔ＊ｍｐ？ｒａｔｕ（？，Ｃ＾ｈｉａＦ－－ｔＭｅｒ職ＩＴＣＧＬＰ２ｇｅｄ｜：、■■■■■■Ｉｃ－ｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈｂｂｂｗｉｉｉｈｉｉｈｈｉｈｈｈｈｉｈｂｈｉｈｉｉｈｈｉｈｈｈｈｈｈｈｉ－－－ＬＰ２Ｒ－、图１８ＩＰＥＣＪ２细胞．ＡＬＰ２／？ｍＲＮＡＰＣＲ系Ｇ表达的鉴定：分别展示Ｇ的ＲＴ扩增曲线溶解曲Ｐ－２Ｒ－ＺＷｌ：ＧＬＰ２Ｒ线图（内参基因Ｇ４Ｐ为对照）；Ｂ：ＧＬ的ｗｅｓｔｅｒｎｂｏｔ结果图Ｃ；免疫荧光技术对ｘ－－？的细胞亚定位（３２〇，绿色：ＦＩＴＣＧＬＰ２Ｒ色．ＤＡＰＩ：蓝染核）Ｆ＾－－ｉｒｅ１８ＩｎｄｅｎｔｉｔｏｆＬ２ＲｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎＩＰＥＪｃｅｌｌｌｉｎｅ．ＡＲＴＲａｍｌｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅ，ｍｅｔｃｕｒｖｅｇｕｙＧＰｐＣ２，ＰＣｐｆｉｌ－Ｐ－２ＲｔＷｅｓｔｅｒｎｂｉｎｉｌｌｌｉａｎｄｍｅｌｔｅａｋｏｆＧＬＰ２ｍＲＮＡ．ＢｌｏｔｒｅｓｕｌｔｏｆＧＬｒｏｅ．Ｃ：ｔｈｅｓｕｂｃｅｕａｒｏｃａｌｉｚａｔｏｎｏｆｐ：ｐ－ｍｍｕｎｏｏｒｅｓｃｅｎｃｅＧＬＰ２ＲｂｙＩｆｌｕｓｔａｉｎｉｎｇ６６ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三－１２．５Ａ，ｃｏｎｔｌ＾ｒｏ１〇１★１０ｊ／ｍｌ〇．〇［ｇ＋５０／ｍｌＭｇｔ卜一＂＾？一１７－．５？ＩｌＯＯ／ｍｌ＾Ｍｇ令１５〇ｍｉ邮５－＼．０—＞－０．０Ｉ１１１１１？１０４８１２１６２０２４２８Ｔｉｍｅｈｏｕｒｓ｛）Ｂ－Ｓ１５ｎＩＬＰＳＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ－＝图１９不同剂量ＬＰＳ对２４ｈ内ＩＰＥＣＪ２细胞单层跨膜电阻ＴＥＲ的影响（重复数ｎ３）Ｆ－ｉｇｕｒｅ１９ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＬＰＳａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅＴＥＲｏｆＩＰＥＣＪ２ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ２４ｈａｆｔｅｒＬＰＳ＊ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ．：Ｐ＜０．０５ｖｓ．ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｈｒｅｅｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．３．２．２ＨＲＰ漏过率通过检测大分子物质ＨＲＰ的透过率可以反映细胞旁路的通透性。如图２０所示，随着ＬＰＳ应激剂量的增加，在２ｈ内透过ｔｒａｎｓｗｅｌｌ嵌套膜进入底室的ＨＲＰ浓度逐渐增加１５０／ｍＬＰＳ处理２４ｈ，２ｈ内进入底室的ＨＲＰ浓度；当用１００和ｐｇ剂量的Ｌ后显著高于对照组（Ｐ＜０．０５）二组之间差异不显著（Ｐ＞０．０５）。，２０００｜１〇＞三＊－＊１５００Ｉ＊＾１１０００．■ｓｏ５００－ｍｌｍｌ／，ＶＶＶＬＰＳＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ＝图２０不同剂量ＬＰＳ应激对２４ｈ后细胞单层对ＨＲＰ漏过率的影响（重复数ｎ３）＊－＜ＦｄｉｆｆｅｄｏｓｅｓｏｎｌｅａｋａｅｏｆＩＰＥＣ２ｃｅｌｌｍｏｎｏｌａｅｒｓ．：．．ｉｇｕｒｅ２０ＴｈｅｅｆｅｃｔｏｆＬＰＳａｔｒｅｎｔＨＲＰｙｒｔＪｙＰ００５ｖｓｃｏｎｌａｌｕｅｓａｒｅｈｌｉｔｒｏ．Ｖｍｅａｎｓｏｆｔｒｅｅｒｅｃａｔｅｓ．ｐ６７ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三３－．２．３不同剂量ＬＰＳ对ＩＰＥＣＪ２细胞形态和细胞活力的影响ＬＰＳ－不同剂量的处理１ＰＥＣＪ２细胞２４ｈ后细胞形态变化情况见图２１。如图所示，“”对照组－Ｊ２ＩＰＥＣ细胞表现出正常的形态，贴壁细胞呈铺路石状，贴壁状况良好，２ＬＰＳ细胞轮廓清晰，折光性好１Ａ）０／ｍＬ，形成细胞单层（图；当浓度为１ｐｇ时，Ｂ细胞形态正常，形成细胞单层２１）ＬＰＳ浓度为５０／ｍＬ，有零星死细胞残骸（图；当ｐｇ时，细胞形态变得有些不规则，有少量死细胞残骸（图２１Ｃ）；当ＬＰＳ达到１００ｐｇ／ｍＬ一时，细胞形态进步改变，结构出现损伤，边缘线条不再圆润，相邻细胞间的界限模一糊，（２１Ｄ）更进步，当ＬＰＳ达到１５〇／ｍ死细胞数目增加见图；ｎｇｌ时，细胞结构，细胞完全失去了原有的形状，破坏更加严重，变得不规则，细胞轮廓不清晰有大量死细胞残骸（图２１Ｅ）。不同剂量ＬＰＳ对细胞活力的影响见图２２：与。结果发现对照组相比，ＬＰＳ剂量依赖的降低了细胞活力，当剂量达到１００ｉ／ｍＬ和１５０网／ｍＬ时，｜ｇ细胞活力下降达到显著水平。结果说明：为了避免细胞单层结构完全受损对细胞间通透性的结果分析带来干扰（死细胞大量增加，单层结构的完整性被破坏，同样会导致通透性的增强），结合ＬＰＳ对ＴＥＲ值、ＨＲＰ漏出率和细胞活力的影响，我们选择以１００ｐｇ／ｍＬ作为ＬＰＳ的应激剂量用于后续试验。Ｃｏｎｔｒｏｌ１０／ｍｌＬＰＳ５０／ｍｌＬＰＳ叩叩＇－：：１００／ｍｌＬＰＳ１５０／ｍｌＬＰＳｐｇｎｇ２１ＰＳ对细胞形态的影响１０〇ｘ图不同剂量Ｌ（）Ｆｉｇｕｒｅ２１ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＬＰＳａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｏｓｅｓｏｎｃｅｌｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．６８ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三－１．２．‘ｒｌ＿．。．￥．４■§■／／／／／ＬＰＳＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ图２２不同ＬＰＳ剂量对细胞活力的影响＊Ｆ＜．ｆｉｇｕｒｅ２２ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＬＰＳａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｏｓｅｓｏｎｃｅｌｌｖｉｔａｌｉｔｙ．：Ｐ０．０５ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｔｈｒｅｅｒｅｌｉｃａｔｅｓ．ｐ－ＩＰＥ－３．３ＧＬＰ２缓解ＬＰＳ应激的ＣＪ２细胞单层通透性的作用３－．３．１ＧＬＰ２对单层上皮细胞ＴＥＲ值的影响如图２３所示ＬＰ－２２４ｈＰＳ，Ｇ剂量依赖地抑制了内Ｌ降低的细胞单层ＴＥＲ值。＿＿７８ｘｍｏ－ＬＰＳ处理后，各组的ＴＥＲ值在４ｈ内急剧降低，而ｌｌ〇和ｌ〇ｌ／ＬＧＬＰ２组的ＴＥＲ值从第８ｈ开始趋于平稳。通过对２４ｈ后细胞单层ＴＥＲ值进行统计分析发现，ＬＰＳ－８—７｜Ｑ９－ｘ组、ｌｘｌｌ．ｌ（１〇和（Ｔｍｏｌ／ＬＧＬＰ２组ＴＥＲ值显著低于对照组（Ｐ＜００５），ｌＪ和〇－（００５ｍｏｌ／ＬＧＬＰ２组的ＴＥＲ值与对照组差异不显著尸＞．）。Ａ１２．５？ｃｏｎｒｌｆｔｏＩ汪－５０■８７親１〇ｍｏＭ－＾７１０＾？ｇＨ０．０Ｉ１１１１１１４８２４０１２１６２０２８Ｔｉｍｅ（ｈｏｕｒｓ）－ｇ１５．ｌ＿祕１ｉ＇１０９８７ｃｏｎｔｒｏｌＬＰＳ１０１ＣＴ１（ＴＩｆｆ！｜ＧＬＰ－２Ｃｏｎｃｅｎｉｌｌｔｒａｔｏｎ（ｍｏ／）图２３不同剂量ＧＬＰ－２对单层上皮细胞ＴＥＲ值的作用效果＊０＂１７＊ｆｆ－－＜ＦＧ２ａｄｏｓｏｆ１ｘ１０ｔｏ１０ｍｏｌ／ＬｏｎＴＥＲｏｆＩＰＥＣＪ２ｃｅｌｌｍｏｎｏｌａｅｒｓ．Ｐｉｇｕｒｅ２３ＥｅｃｔｏｆＬＰｔｓｅｙ：０．０５ｖｓ．ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｈｒｅｅｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．６９ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三３－．３．２ＧＬＰ２对细胞单层ＨＲＰ漏过率的影响ＨＲＰＰ＜０如图２４所示．０５），与对照组相比，ＬＰＳ处理组的漏过率显著提高（，＃９ｘ－－、ｌ（ｍｏｌ／ＬＧＬＰ２不能抑制由ＬＰＳ引起的ＨＲＰ漏过率的增加ＧＬＰ２１１０Ｔ，但是当８７剂量达到１Ｘ１ＣＴ和ｌ（Ｔｍｏｌ／Ｌ，ＨＲＰ漏过率与对照组差异不显著，有效抑制了ＬＰＳＰ－引起的ＨＲ漏过率的增加。由此，ＧＬＰ２剂量依赖地抑制ＬＰＳ引起的单层上皮通透性的增加。１５００－＾Ｓ＊１〇〇°－Ｉ．＊ｉＴｈｏｃＩＩ〇喔■Ａ－＂－￡■Ｉ；，ｍ＇＇１０＇９８＇７ｃｏｎｔｒｏｌＬＰＳ１０１０１０１０－ｔｔｍｏＧＬＰ２Ｃｏｎｃｅｎｒａｉｏｎｌ／Ｌ（）图２４ＧＬＰ－２对单层上皮细胞ＨＲＰ漏过率的作用效果＊－－＜Ｆｉｇｕｒｅ２４ＥｆｆｅｃｔｏｆＧＬＰ２ｏｎｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｏｆＩＰＥＣＪ２ｍｏｎｏｌａｅｒ．：Ｐ０．０５ｖｓ．ｐｙｙｃｏｎｔｒｏｌ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｈｒｅｅｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．３－＿．３．３ＧＬＰ２对ＬＰＳ应激的ＩＰＥＣＪ２细胞形态和细胞活力的影响ＬＰ－２－不同浓度Ｇ对ＩＰＥＣＪ２细胞形态的保护作用见图２５。对照组细胞形态正常，“铺”绝大部分贴壁细胞呈路石状，细胞轮廓清晰，线条圆润（图２５Ａ）；ＬＰＳ应激２４ｈ后有所改变，，部分细胞边缘界限不清，死细胞残骸增多但显微镜下，细胞形状＃９２５Ｂ－细胞单层结构依然保持完整（图）加ｌＸｌＯｌ（Ｔｍ〇ｌ／ＬＧＬＰ２；添和对ＬＰＳ引起的细胞形态的改变没有明显的作用效果，依然可见细胞边缘线条模糊，细胞形态不规－８７－丨ｌ（２维持贝，但死细胞数目有所减少（图２５Ｃ、Ｄ）加１Ｘ１０Ｔｍ〇ｌ／ＬＧＬＰＪ；添和了细胞形态的正常，细胞拉丝的现象得到明显改善，可见零星漂浮的死细胞（图２５Ｅ、Ｆ）。如图２６所示，与对照组正常细胞相比，ＬＰＳ应激显著降低了细胞活力（Ｐ＜０．０５），－１（）－ｘＬＰＳ引起细胞活力显著低于对照组ＧＬＰ２的剂量为ｌｌ〇ｍｏｌ／Ｌ时，（尸＜０．０５）；而＿９８＿７－ｘ当ＧＬＰ２剂量为ｌｌ０、ＫＴ、１０ｍ〇ｌ／Ｌ时，细胞活力提高至与对照组差异不显著的＞。水平（Ｐ０．０５）７０ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三ｓｉｓ＇１０ｎｒｏｌ１００／ｍｌＬＰＳＬＰｍｏ－ＣｏｔＨｇＳ＋１０ｌ／ｌＧＬＰ２■■■＇９８＂７－ｍｏ－＋ｍｏｌ／ｌＬＰ２ｍｏＰ２ＬＰＳ１０ｌ／ｌＬＰＳ＋１０ＧＬＰＳ＋１０ｌ／ｌＧＬ２５ＬＰ－２ＬＰＳ－ｘ图不同剂量Ｇ对应激的ＩＰＥＣＪ２细胞形态的影响（０〇１）－－－ｘＦｆｆＧＬＰ２ｏｎｌｌ．ｉｇｕｒｅ２５ＴｈｅｅｅｃｔｏｆｃｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＬＰＳｃｈａｌｌｅｎｅｄＩＰＥＣＪ２ｃｅｌｌ（１０〇）ｇ－１．２．－＊０ｉ．８ＢＴＴｉｖ丨１１１－ｍｏＧＬＰ２Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｌ／ｌ（）２６ＬＰ－ＬＰＳ应激的－图不同Ｇ２剂量对ＩＰＥＣＪ２细胞活力的影响＊Ｆ－－＜ｉｇｕｒｅ２６ＴｈｅｅｌｆｅｃｔｏｆＧＬＰ２ａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｏｓｅｓｏｎｃｅｌｌｖｉｔａｌｉｔｙｏｆＩＰＥＣＪ２ｃｈａｌｌｅｎｅｄｂＬＰＳ．：Ｐｇｙ０．０５ｖｓ．ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｈｒｅｅｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．７１ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三４．讨论４－ＬＰ－２Ｒ．１ＩＰＥＣＪ２细胞系Ｇ的鉴定结果４７［１］ＩＰＥＣ－Ｊ２细胞系是非致瘤性的仔猪空肠上皮细胞系，被越来越多地被用于研宄动物和人微生物病原体包括沙门氏菌、致病大肠杆菌，甚至轮状病毒与肠上皮细胞间１４８１４９［］［］－的相互关系。在ＩＰＥＣＪ２的研究中，可通过建立轮状病毒Ｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｓ感染模型１＞ｉ：ＬＰＳ［］和来自沙门氏菌妙？ｆｏｃ／ｚｅＷｃ／ｚ／ａｃｏ／／的应激模型研究－－仔猪的先天性免疫反应，因此２，本试验初步选择ＩＰＥＣＪ细胞系用于ＧＬＰ２在仔猪肠１５２［］－－２－上皮细胞的功能研宄。然而，，ＧＬＰ２Ｒ是ＧＬＰ的功能性受体ＧＬＰ２需要与－２Ｒ特异性结合发挥肠营养效应ＧＬＰ。为了初步确定本研宄中所用细胞系能否用于对－－－ＧＬＰ２功能的研究，我们首先对ＩＰＥＣＪ２细胞系ＧＬＰ２Ｒ表达情况进行了检测。结果ＧＬＰ－２ＲｍＲＮＡ和蛋白均在－－显示ＩＰＥＣＪ２２Ｒ，细胞中表达；通过免疫荧光染色对ＧＬＰ－２Ｒ－ＩＰＥ的细胞亚定位进行分析，结果显示ＧＬＰ位于ＣＪ２的细胞膜和胞浆中。由此可－－－，ＩＰＥＣＪ２细胞系能表达ＧＬＰ２ＲＬＰ２对仔猪以确定，可应用于Ｇ肠上皮细胞的保护作用研宄。４．２ＬＰＳ应激模型的建立１４６通过考察细胞单层跨膜电阻ＴＥＲ和大分子物质ＨＲＰ的漏过率［］评价单层肠上６４８４１３６［，’］皮细胞的通透性变化。ＬＰＳ作为革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，在许多体外试验中都被证实能破坏肠上皮屏障功能。为了确定本试验中ＬＰＳ造成肠上皮细胞通透性变化的最适添加剂量，试验共设４个ＬＰＳ添加剂量，主要以通透性的变化确定ＬＰＳ应激模型的建立。结果显示，ＬＰＳ剂量依赖地提高了２４ｈ内肠上皮细胞的通透性，当剂量达到１００ｐｇ／ｍＬ，ＬＰＳ对肠上皮细胞通透性的作用效果达到显著，与１５０ｐｇ／ｍＬＬＰＳ作用效果差异不显著。本试验还考察了不同剂量ＬＰＳ对细胞形态和细胞活一，Ｌ力的影响，结果与通透性的试验结果致当ＬＰＳ剂量达到１００／ｍ，细胞形态发ｐｇ１生明显变化，但仍保持了完整的细胞单层结构；５０，死细胞增加然而，当剂量达到ｐｇ／ｍＬ，细胞出现大量死亡，形态完全受损，细胞边缘线条残破，细胞单层结构受损。此外，，ＬＰＳ应激剂量达到１００／ｍＬ时细胞活力开始出现显著下降。由于本试验关ｐｇ于ＬＰＳ剂量的选择原则是要保证单层细胞间通透性的改变是由于ＴＪ结构开放引起，，因此／ｍＬ而非由于细胞大量死亡导致细胞单层出现漏洞所引起，本试验选择以１００ｐｇ７２ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三作为ＬＰＳ引起肠上皮通透性增加的最适添加剂量用于后续试验。与本试验所用ＬＰＳ５９［］Ｙ－１ＬＬＰＳ引Ｉ剂量不同的是，ａｎｇ等（２０１５）研究使用ｐｇ／ｍ起了ＰＥＣＪ２细胞单层１４３２００６［］通透性的改变。与本试验相同的是，Ｙｕ等（）报道１００ｐｇ／ｍＬＬＰＳ增加了－ＩＰＥＣＪ２细胞的跨膜电阻ＴＥＲ值。分析造成用于建立应激模型的ＬＰＳ剂量不同的原５９［］因（２０１５）并未给出剂量选择的指标及相关数据，我们不能通过与，由于Ｙａｎｇ等之对比找到造成差异的原因。但是，可以推测，这可能与细胞自身的生理状态、培养条件、处理时间等不同有关。４－．３ＧＬＰ２处理对ＬＰＳ应激的肠上皮通透性的缓解作用在本研究中，以ＴＥＲ值和ＨＲＰ漏过率这两个指标的变化来评价单层细胞的通透－２的最适添加剂量性的改变，并以细胞通透性、细胞形态和活力的变化确定ＧＬＰ。结果显示，ｌＯＯｐｇ／ｍＬＬＰＳ引起细胞单层通透性显著提高，细胞形态发生改变，并显８７Ｐ－２进行ｘｌｌｍｏＬ著降低了细胞活力，当剂量达到（Ｔｌ／，；添加不同剂量的ＧＬ处理和ＨＴ－２处理有效缓解了细胞形态的改变和单层通透性的变化ＧＬＰ，显著提高了细胞活力。－－以上研究结果表明，ＧＬＰ２具有保护ＩＰＥＣＪ２细胞单层屏障功能免受ＬＰＳ损伤的作用－－效果，并且ＧＬＰ２的作用呈现明显的剂量依赖效应。ＧＬＰ２的剂量依赖效应与它在２（）［］－，Ｂｕｒｒ（ＬＰ２其它研究模型上得到的结果相似。在体内ｉｎ等２００５）研究报道Ｇ以３３ａｎ０６［］剂量依赖的方式促进新生仔猪肠细胞的增殖和存活；Ｇｕ等（２０）研究发现－（ｓｕｅｒＧＬＰ２以剂量依赖的方式刺激大鼠肠系膜动脉ｐｉｏｒｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａｒｔｅｒｉａｌ，ＳＭＡ）血ＬＰ－ＬＰ－Ｒｔ流量的增加，Ｇ２２ａｂｈａｍｓｅｒ。在体外剂量依赖地提高了转染Ｇ的小仓鼠肾（ｂｙ３７［］ｋＨＫＡＭＰ的累Ｐ－ｉｄｎｅ，Ｂ）细胞中ｃ积水平。２ｙ，促进了细胞增殖本试验中当ＧＬ＿８的剂量达到１Ｘ１〇ｍｏｌ／Ｌ能有效缓解ＬＰＳ增加的肠上皮细胞间通透性。因此，选择８ＧＬＰ－２Ｘ〇的剂量为１１（Ｔｍｌ／Ｌ用于后续试验研究。５小结－－２－试验三结果显示，，ＩＰＥＣＪ２细胞系能表达ＧＬＰＲ可用于ＧＬＰ２的功能研究；ＬＰＳ剂量为１００ｍＬＬＰ－２建立影响肠上皮通透性的应激模型适宜的ｐｇ／；Ｇ可以缓解８ＬＰＳ应激的仔猪肠上皮单层细胞间的通透性变化，其适宜添加剂量为ｌｘｌ（Ｔｍ〇ｌ／Ｌ。７３ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宂：试验三（二）ＧＬＰ－２对ＬＰＳ应激的ＰＥＣ－Ｊ２细胞ＴＪ蛋白表达Ｉ及重排的影响及ＭＬＣＫ／ＭＬＣ的介导作用研究ｐ１前言７ｄＬＰ－２７ｄ试验二动物试验结果发现给断奶仔猪连续注射外源Ｇ，继续饲喂后血浆ＧＬＰ－２的基础水平显著高于对照组，并且缓解了ＬＰＳ免疫应激造成的肠道炎症－２上－ｏｃｃｕｄｎ蛋白表和屏障通透性的增强，可能与ＧＬＰ１和ｌｉ；分析其作用机理调Ｚ０达，以及下调ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ信号维持ＴＪ结构的稳定有关；然而，对于下调的ＭＬＣＫ／ＭＬＣ信号是直接受到ＧＬＰ－２作用还是间接受到减少的细胞因子调节则还需ｐ一一进步研宄阐明。试验三（）研究结果确定了本试验中用于ＬＰＳ应激２４ｈ后造成＿８－２剂ｘｌｌ肠上皮细胞单层通透性显著增加的最适添加剂量，并且确定了当ＧＬＰ量为〇－ｍｏｌ／Ｌ时对抑制ＬＰＳ增强的ＩＰＥＣＪ２细胞单层通透性具有显著的作用效果。那么，相？此外应的与肠上皮细胞间通透性相关的ＴＪ蛋白的变化如何呢，ＬＰＳ在应激起始阶段是否通过激活ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ信号途径造成肠上皮细胞间ＴＪ结构的开放？ＧＬＰ－２在？应激早期对ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ信号通路的调节作用又如何呢因此，本试验将添加ＭＬＣＫ抑制剂考察ＧＬＰ－２对紧密连接蛋白表达及超微结构分布的作用是否受到ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ信号的介导。２材料与方法２１－２－Ｔ．ＧＬＰ对ＬＰＳ应激的ＩＰＥＣＪ２细胞Ｊ的影响２．１．１试验设计３ＬＰ－２＋ＬＰＳ组试验共分为个处理，每个处理３个重复，即对照组、ＬＰＳ组和Ｇ，每个重复１孔细胞（试验设计见表１５）。２．１．２试验材料－ＺＯ１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ多克隆抗体Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ兔抗，均购自中国分公司；兔抗ＴｈＨ８／ＳｅＨ９多克隆抗体，购自美国ＣｅｌｌＳｉｎａｌｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏ公司ｐＭＬＣｇｇｇｙ；兔抗ＭＬＣＫ多７４ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三克隆抗体，，购自生工生物工程（上海）有限公司；跨膜蛋白提取试剂盒磷酸化蛋白提取试剂盒，购自中国贝博生物科技有限公司。一细胞培养所需试剂和仪器同试验三（）２．３．２；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试剂等同试验二２．３．２；一免疫荧光检测试剂等同试验三（）２．１．１。表１５试验设计Ｔａｂｌｅ１５Ｔｅｓｔｄｅｓｉｎｇ＂＂＂＂＂处理组ＬＰＳＬＰＳ＋ＧＬＰ－２组重复数３３３＂８－—一〇ＧＬＰ２浓度ｍｏｌ／Ｌ）ｌ（ＧＬＰ－２预处理１ｈ后，添加１００／ｍＬＬＰＳ继续作用２４ｈｎｇ—ＬＰＳｌ〇〇ｌ〇〇应激（ｎｇ／ｍＬ）２．１．３试验方法２．１．３．１细胞培养－将仔猪空肠上皮细胞系ＩＰＥＣＪ２接种，添加含有（ｖｏｌ／ｖｏｌ）于６孔细胞培养板１０％胎牛血清１％青链霉素（１００Ｕ／ｍＬｅｎｉｃｉｌｌｉｎ和１００ｉ／Ｌｓｔｒｅｔｏｍｃｉｎ）、４ｘ／ｍＬ胰岛、ｐ（ｇｐｙｊｇ素１ａ／ｍＬＥＧＦ４．５ｍ／ｍＬＤＭＥＭ、｜ｇ的含ｇ葡萄糖的高糖培养基进行培养。将培养板置°于３７Ｃ，５％Ｃ０２，９５％湿度的二氧化碳培养箱中培养，每隔１天更换１次培养基。待°８０？９０／￣细胞汇合至。，将培养基换为无血清的ＤＭＥＭ培养基继续饥饿培养１２１４ｈ。８ｘ－待细胞完全铺满培养板底部，按ｌ（Ｔｍｏｌ／Ｌ剂量添加无菌ｈＧｌ２＿Ｉ作液混ｌＧＬＰ２［ｙ］１３４°勾，Ｃ培养箱中培养ｌｈ，０／ｍＬ，置于３７；然后再按１０ｐｇ剂量添加ＬＰＳ工作液混匀°Ｃ培养箱中继续培养置于３７。分别于ＬＰＳ添加培养４５ｍｉｎ和２４ｈ后按试剂盒说明书。跨膜蛋白提取的具体方法同试验二２．１２操作方法提取细胞磷酸化蛋白和跨膜蛋白．．３。２．１．３．２磷酸化蛋白的提取磷酸化蛋白的提取操作步骤如下：１）制备提取液：每５００ｎＬ冷的磷酸化蛋白提取液中加入２ｐＬ蛋白酶抑制剂混７，ＦｔｔＡＢ合物（含种蛋白酶抑制剂包括ＡＥＢＳ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｉｎ、Ｐｅｐｓａｔｉｎ、ｅｓｔａｔｉｎ、７５ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三－Ｅ６４、ＥＤＴＡ），混合均匀置于冰上备用；２）细胞培养完成后，每孔用冷的ＰＢＳ溶液洗涤细胞两次，洗涤后尽量将液体吸干，然后每孔加入６０ｐＬ预混提取液，将贴壁细胞用细胞刮片刮下后，转移至２００ｐＬ°无菌卩〇１管中，４（：条件下振荡２０１＾１１；°一３）在４Ｃ条件下，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ；快速将上清吸入另预冷的千净ＰＣＲ管中，即可得到磷酸化蛋白。２．１．４检测指标－１２．１．４．１ＴＪ蛋白ＺＯ和ｏｃｃｌｕｄｉｎ的表达量二２－ｅｓｔｅｒｎｂｔ技术进行检测同试验．１．３．２，１使用ｗｌｏ兔抗ＺＯ多克隆抗体使用—ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ抗稀释液按１：１０００进行稀释；兔抗ｏｃｃｌｕｄｉｎ多克隆抗体的稀释比例为１：１５００。２－．１．４．２ＺＯ１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的亚细胞分布ＺＯ－１ｏｃｃｕｄｎ蛋白的亚细。使用免疫荧光分析技术检测和ｌｉ胞定位及超微结构用ＺＯ－于免疫荧光分析的兔抗１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ多克隆抗体的稀释比例分别为为１：４０和１：５０。一）２．１具体操作方法同试验三（．３。２．１．４．３ＭＬＣＫ表达量和ＭＬＣ磷酸化水平—使用ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术进行检测ｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ抗，兔抗ＭＬＣＫ多克隆抗体使用ｗＴ１＂１８／ＳｅＨ９稀释液按１：４００进行稀释；兔抗ｐＭＬＣ多克隆抗体的稀释比例为１：１５００。２．２ＭＬＣＫ对细胞单层通透性的影响２．２．１试验设计－９－－使用ＭＬＣＫ的特异性抑制剂ＭＬ对细胞进行预处理，ＭＬ９和ＧＬＰ２预处理１－ｈ后，添加１０〇ｎｇ／ｍＬＬＰＳ进行攻毒。试验分组分别为：对照组，ＬＰＳ组，ＧＬＰ２＋ＬＰＳ－ＬＰＳ组和ＭＬ－－组９＋９＋ＧＬＰ２＋ＬＰＳ组，３个重复，每个重复１孔细胞。，ＭＬ每个处理一步明确ＭＬＣＫ－２通过本研究可以进／ｐＭＬＣ信号途径在ＧＬＰ调节细胞单层通透性中的关键地位。试验设计见表１６。７６ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三表１６试验设计Ｔａｂｌｅ１６ＴｅｓｔｄｅｓｉｎｇＭＬ－－ｍｏ９ｍｏｌ／ＬＬＰＳｘ／ｍＬＧＬＰ２ｌ／ＬＮ组别（ｐ）（＼ｇ）（）对照组〇〇０３一０处理１０００３－８处理二０１００１０３处理三１５１０００３＇８处理四１５１００１０３２．２．２材料与方法２．２．１．１原材料和试剂２－６孔胶原包被的ＴｒａｎｓｗｅｌｌＣＯＬ细胞嵌套培养板（４．６７ｃｍｍ，，０．４＿ｉ孔径）１２孔｜一ｃｏｍ－细胞培养板ｉｎ：兔１ｃｃｌｕｄｉｎ，购自美国ｇ公司；抗抗ＺＯ多克隆抗体和兔抗ｏ多克隆抗体，购自Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ中国分公司；兔抗ＭＬＣＫ多克隆抗体，购自生工生物ＴｌｗＳＣＴｌ９工程（上海）有限公司兔抗ＭＬＣ多克隆抗体，购自美国ＣｅｌｌＳｉｎａｌｉｎ；ｐｇｇＴｅｃｈｎｏｔ－ｌｏ公司免疫荧光相关试剂：免疫染色固定液、Ｔｒｉｏｎ１００Ｘ、免疫染色封闭ｇｙ；液、ＦＩＴＣ标记山羊抗兔ＩｇＧＨ＋Ｌ、ＤＡＰＩ染色液，均购自碧云天生物技术研究所（）；ｗｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ相关试剂：磷酸化蛋白提取试剂盒、总蛋白提取试剂盒购自上海贝博生物；ＰＶＤＦ膜、ｍｉｎｉ型转膜滤纸，购自美国Ｂｉｏｒａｄ公司。２．２．１．２仪器超净工作台（苏静安泰）、数显恒温水浴锅（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）、ｅｒｍｏ－细胞Ｃ〇２培养箱（美国Ｔｈ司）、ＭｉｌｌｉｃｅｌｌＥｌｅｃｔｒｉｃａｌＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＳｙｓｔｅｍ细胞电阻仪（美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）、ＷｅｌｌｓａｎＭＫ型酶联免疫分析仪（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司）、ＮｉｋｏｎｃＡ－ＥｌｉｐｓｅＴＳ１００荧光倒置显微镜（日本Ｎｉｋｏｎ公司）、ＳＳＰＡＧＥ电泳槽（美国Ｂｉｏｒａｄ公司）、凝胶成像系统（美国Ｂｉｏｒａｄ公司）、莱卡ＤＭＩ４０００Ｂ倒置荧光显微镜（德国Ｌｅｉｃａ公司）７７１ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三２．２．３试验方法２．２．３．１细胞培养一用于通透性测定的细胞培养同试验三（）２．３．３；ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ的细胞培养同试验三（二）２．１用于免疫荧光检测分析和．１３．。２．２．３．２蛋白的提取一三（）２．．．２跨膜蛋白提取方法同试验．１２．３磷酸化蛋白提取同试验三（二）２１．３；；一ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ操作方法同试验三（）２．１．３．２。２．２．４检测指标一１）细胞通透性：同试验三（）２．２．４。一２ＴＪ蛋白的超微结构及分布（２．．）：免疫荧光染色技术检测同试验三）．１３３。３）攻毒后４５ｍｉｎｐＭＬＣ的憐酸化水平：ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术检测，方法同试验三（二）２１．．４。４）２４ｈ后的ＴＪ蛋白表达水平：ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术检测，方法同试验三（二）２．１．４。２．３试验数据处理－蛋白质定量分析用Ｉｍａｇｅ－ｌａｂ软件（美国Ｂｒｏｒａｄ公司）进行相对定量试验数；±ＳＥＭ－据均以平均值表示１７．０ｎｅｗａＡＮＯＶＡ单因，采用ＳＰＳＳ软件进行Ｏｙ素方差分析，不同试验组间平均值采用ＬＳＤ法进行差异显著性检验，以户＜０．０５表示差异有显著性意义。３结果－－３．１ＧＬＰ２对ＬＰＳ应激的ＩＰＥＣＪ２细胞ＴＪ的影响－３－２ＩＰＥＣＪ２．１．１ＧＬＰ对细胞形态的影口向“”如图２７所示，正常对照组中细胞边缘平滑，贴壁细胞呈现铺路石的形态分布（图２７Ａ），然而，ＬＰＳ应激引起细胞形态改善，细胞边缘界限模糊不清，严重的８２７Ｂｘ－２ＰＥＣ－；ｌｌ（Ｔｍ〇ｌ／ＬＧＬＰＪ呈现拉丝形状（图，箭头）预处理缓解了Ｉ２细胞形态学的改变，维持了细胞的完整性（图２７Ｃ）。７８ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三Ｃｏｎ－ｔｒｏｌＬＰＳＬＰＳ＋ＧＬＰ２８２７ｘ－ｘ图１ｌ（Ｔｍｏｌ／ＬＧＬＰ２对细胞形态学的影响（１０〇）ｓＦ－ｘｘｉｇｕｒｅ２７ＴｈｅｅｆｉｆｅｃｔｏｆＧＬＰ２ｌ１０ｍｏｌ／Ｌｏｎｃｅｌｌｍｏｒｈｏｌｏ１００（）ｐｇｙ（）－３１ＬＰＴ．．２Ｇ２对Ｊ蛋白的影响３．１．２．１ＴＪ蛋白的超微结构分布“”ＴＪ蛋白ＺＯ－１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ主要分布在上皮细胞膜上，使相邻细胞相吻合。在“”对照组正常细胞上－１ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的免疫荧光呈边缘，ＺＯ和平滑的典型铁丝网１５３］［（２８Ａ、Ｄ）。１００／ｍＬＬＰＳ处理－状结构图然而，ｉ２４ｈ后ＺＯ１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ免｜ｇ的，８Ｂ疫荧光染色出现断裂和缺失不能形成完整的网状结构（图２、Ｅ，白色箭头）。８ｘ－以上结果表明ＬＰＳ导致ＴＪ蛋白分布异常。但是，ｌｌ（Ｔｍ〇ＬＧＬＰ２处ＬＰＳｌ／理缓解了“”－１ｃｃｕｄ导致的ＺＯ和ｏｎ蛋白定位失，ｌｉ调其免疫荧光与对照组相似呈现铁丝网状８Ｃ－结构（图２、Ｆ）。此外，从图２８Ｄ可以看出，ｏｃｃｌｕｄｉｎ除了在ＩＰＥＣＪ２细胞膜上定位呈网状分布外，在胞浆紧挨细胞核也有少量定位，呈零星点状分布２８Ｅ；在图中可以看到，ＬＰＳ引起ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白在细胞膜上的网状结构分布消失的同时，细胞内ｏｃｃｕｄｎ蛋白的颗粒状分布增加（红色实心箭头）２８Ｆ－可以看出，ＧＬＰ２ｌｉ；由图抑制了ＬＰＳ引起的网状结构的消失，细胞内呈颗粒状分布的ｏｃｃｌｕｄｎｉ蛋白也相应减少。ＺＯ－３．１．２．２１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白表达量８９－＜ｘ，ＬＰＳ１ｏｃｃｌｕｄｉｎ０．０５，１１ｍｏ／Ｌ如图２所示显著下调ＺＯ和蛋白的表达（Ｐ）（ＴｌＧＬＰ－２＜０显著抑制了ＬＰＳ导致的ＴＪ蛋白的下调（户．０５），这与免疫荧光染色观察到一－细胞膜上ＺＯ１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的变化规律致。７９ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三ｔ－ＣｏｎｒｏｌＬＰＳＬＰＳ＋ＧＬＰ２０■■■ＤＫＢＢｉｇ＾ＶＢ１ＳＨ—ＭＭ８２８ｘ－－图ｌｌ（Ｔｍｏｌ／ＬＧＬＰ２缓解ＬＰＳ对ＴＪ蛋白ＺＯｌ（ＡＢＣ）和ｏｃｃｌｕｄｉｎ（ＤＥＦ）超微结构及分布，，，，３２〇ｘ－的破坏作用（）。对照组中ＺＯ１和ｏｃｃｌｉｎ呈网状ｌｕｄｉｕｄ，主要以线条形式定位于细胞连接处；ｏｃｃｎ－。ＬＰＳ应激２４ｈ后１也少量以小颗粒状定位于胞浆，Ｚ０荧光信号呈断裂的网状结构分布于细胞边缘，ｏｃｃ－－ｌｕｄｉｎ信号则网状结构消失，主要定位于胞浆中呈颗粒状或环状。ＧＬＰ２处理使Ｚ０１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ的荧光信号与对照组相似，主要定位于细胞边缘呈网状分布。＂８ｍｏ－－Ｆｉｕｒｅ２８１ｘ１０ｌ／ＬＧＬＰ２ａｌｌｅｖｉａｔｅｄｔｈｅｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｉｈｔｕｎｃｔｉｏｎｓＺＯ１ＡＢＣａｎｄｏｃｃｌｕｄｉｎＤＥｇｇ，ｊ（，，）（，ＦｉｂＬＰＳ３２０ｘ－）ｎｄｕｃｅｄ（）．ＩｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌＺＯ１ＡａｎｄｏｃｃｌｕｄｉｎＤａｅａｒｅｄｔｏｂｅｏｒａｎｉｚｅｄｉｎｔｏａｙ，（）（）ｐｐｇ－ｕｎｃｔｎｅｔｗｏｒｋｂｏｔｈＺＯ１ａｎｄｏｃｃｌｕｄｉｎｗｅｒｅｒｉｍａｒｉｌｙｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎａｌｉｎｅａｒｆａｓｈｉｏｎａｔｉｏｎａｌｒｅｉｏｎｓ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，，ｐｊｇｏｃｃｌｕｄｉｎｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｔｏｂｅｌｏｃａｌｉｚｅｄａｓｔｈｅｓｍａｌｌｒａｎｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｎｃｔｏｌａｓｍｒｅｄａｒｒｏｗｈｅａｄｓ．Ａｆｔｅｒ２４ｇｙｐ（）－－ｈＬＰＳｃｈｌｌＺＯ１ｓｉｎａｌｗａｓｄｔｔｅｄｍａｉｎｌｆｒｏｍｔｕｒｅｄｏｎｅｃｏｍ－ｌａｅｎｇｅｅｅｃｆｒａｃｈｂｉｋｅｓｔｌｌｌｌｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｃｅｃｅ，ｇｙｙ－ｗｈｌｆｒｂｏｒｄｅｒｓｉｔｅａｒｒｏｗｈｅａｄｓ，ａｎｄｏｃｃｕｄｉｎｓｉｎａｌｗａｓｏｍｒａｎｕｌａｒａｎｄｒｉｎｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｉｎｔｌｉｅｃｔｏｌａｓｍ（）ｇｇｇｙｐｗ－－－ｒｅｄａｒｒｏｗｈｅａｄｓｉｔｈｔｈｅｎｅｔｗｏｒｋｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｉｓａｅａｒｅｄ．ＰｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｈＧＬＰ２ｂｏｔｈＺＯ１ａｎｄｔ，（），ｐｐｏｃｃ－ｌｕｄｉｎｍａｉｎｌｌｏｃａｌｉｚｅｄａｔｃｅｌｌｃｅｌｌｂｏｒｄｅｒｓａｓｎｅｔｗｏｒｋｓｔｒｕｃｔｕｒｅｌｉｋｅｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ．ｙ，８０ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三＜ｓ〇！．￡？ＩＪ§｜ＪＺＯ－１－鲁＾麵＿２３０ｋＤ翁＿Ｏ－？〇＿？柳＾塌＿ｃｃｌｕｄｉｎ鴨５９ｋＤＧＡＰＤＨ－ｍｍｍｍｍｍｍｍｋＤ３６＂１，５１５〇－ＺＯ１．２１Ｏｃｃｌｕｄｉｎ｜１｜￣１：１．ｉ．－ｃｏｎ＋－ｃｏｎｔｒｏｌＬＰＳＬＰＳ＋ＧＬＰ２ｔｒｏｌＬＰＳＬＰＳＧＬＰ２８ｍｏ－－－＝图２９ＨＴｌ／ＬＧＬＰ２ＰＥＣＪ２细胞ＺＯｏｃｃｌｕｄｉｎｎ对Ｉ１和蛋白表达的影响（重复数３）＇８＊Ｆ－＜ｉｕｒｅ２９ＴＪｒｏｔｅｉｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｉｍｒｏｖｅｄｂＧＬＰ２ａｔｄｏｓｅｏｆ１０ｍｏｌ／Ｌ．：Ｐ０．０５ｖｓ．ＬＰＳ．Ｖａｌｕｅｓｇｐｐｐｙａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｈｒｅｅｒｅｌｉｃａｔｅｓ．ｐ－３－２ＬＰＳＰＥＣＭＬＣ．１．２．３ＧＬＰ对应激的ＩＪ２细胞ＭＬＣＫ／ｐ的影响ａ．￡？ＣｊＪ－—ｍｍｍｍｍｍＭＬＣＫ２１１ｋＤ＾ＴｈｒｌＳ／Ｓｅｒ＾ｎ／ＩＶｙｆｌ－ｐｉＶｌＬＬｍｍｍｍ？ｍ－—？１９ｋＤＧＡ－ｍｍｍｍｍｍｍ６ｋＤＰＤＨ３４２５Ｉ１ＭＬＣＫＩｐＭＬＣ１－ｌ３－＾ｌ▲￡ｉ＊．１５ＵＪ！＊ｉｉ：Ｉ：．ｃｏｎｔ－－ｒｏｌＬＰＳＬＰＳ＋ＧＬＰ２ｃｏｎＬＰＳ＋ＧＬＰ２ｔｒｏｌＬＰＳ－２Ｓ－２ＭＬＣ信号＝图３０ＧＬＰ抑制ＬＰ刺激的ＩＰＥＣＪ细胞ＭＬＣＫ／（重复数ｎ３）ｐ＊Ｆ－＜ｉｇｕｒｅ３０ＧＬＰ２ｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅＭＬＣＫ／ｐＭＬＣｓｉｇｎａｌｉｎｇｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂＬＰＳ．：Ｐ０．０５ｖｓ．ＬＰＳ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｙｍｅａｎｓｏｆｔｈｒｅｅｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．８１ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三３０４ｈ－ＭＬＣＫ如图所示，ＬＰＳＪ２，与对照组相比处理２后显著提高了ＩＰＥＣ细胞蛋白的表达量（Ｐ＜０．０５）和ＭＬＣ的磷酸化水平（尸＜０．０５）；然而，相对于ＬＰＳ组，８ｘｍｏ－＜ｌｌ（Ｔｌ／ＬＧＬＰ２显著降低了ＭＬＣＫ蛋白的表达量（尸０．０５）和ＭＬＣ的磷酸化水平（尸＜０．０５）。３．２ＭＬＣＫ对细胞单层通透性的影响一为了进步确定ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ信号是否参与介导ＧＬＰ－２对ＬＰＳ应激的细胞单层ＭＬＣＫ抑制ＭＬ－通透性的缓解作用，本试验考察了添加剂９后细胞单层通透性和ＴＪ蛋白的变化。３．２．１ＭＬＣ的磷酸化水平ｐＴｈｄ８／Ｓｗ１９如图３１所示，与对照组相比，ＬＰＳ引起ｐＭＬＣ磷酸化水平显著提高了＜－－６４（．０，．２％Ｐ０５）与ＬＰＳ组相比无论是单独添加ＧＬＰ２和ＭＬ９还；而是同时添加？８＾１９Ｔｈｆｌ８／ＳｅＨ９－－ＭＬＣ＜ＧＬＰ２和ＭＬ９均显著降低了ｐ的过磷酸化（Ｐ０．０５），使ｐＭＬＣＬＰＳ＋ＧＬＰ－２Ｐ＋ＭＬ－－的磷酸化与对照组水平差异不显著；、ＬＳ９和ＬＰＳ＋ＧＬＰ２＋ＬＰＳ三１＾１＾＾１９组间ｐＭＬＣ磷酸化水平差异不显著。２－．０ＭＬＣ§Ｉｐ－？Ｔ１－ｉ－５－＋＋＋＋ＬＰＳ＊ｃ－１°－＾－＋－＋ＧＬＰ－２ＨＩ＾ＭＬ－－－＋＋＇Ｏ．Ｓ．Ｉ｜＿Ｔｈｒ，８／Ｓｅｒ１９ＭＬＣ－ｒｎｍｍ｜ＵＭｐ々＾只９＞＇ＧＡＰＤＨ－３６ｋＤ〇ｖＯ＾１１１８＾１９１－９－２Ｓ对－Ｊ２ＭＬＣ图３１ＭＬＣＫ抑制剂ＭＬ存在条件下，ＧＬＰ和ＬＰＩＰＥＣ细胞ｐ的磷酸化水平的＝影响（重复数ｎ３）Ｔｈｒ，８／ＳｒＩ９ｅ－ＭＦｉｒｅｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆＧＬＰ２ａｎｄＬＰＳｏｎｔｈｅｈｏｓｈｏｒｉｏｎｏｆｉｎｈｅｅｓｅｎｃｅｏｆｇｕ３１Ｔｐｐｖ＾ａｔｐＬＣｔｐｒ＊－ＭＬＣＫｉｎｈｉｂｉｔｅｒＭＬ９．＜．．．ｌ：Ｐ００５ｖｓＬＰＳＶａｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｈｒｅｅｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．３．２．２细胞单层通透性的变化如图３２所示，与对照组相比，ＬＰＳ显著提高了应激２４ｈ后细胞单层对大分子物＜０－＜质ＨＲＰ的漏过率（尸．０５）ＧＬＰ２．；的处理显著抑制了ＬＰＳ的作用（尸００５）；此－＜，与ＬＰＳ组相比（夕卜，ＭＬＣＫ抑制剂ＭＬ９显著降低了ＬＰＳ提高的ＨＲＰ漏过率Ｐ０．０５）；ＬＰＳ＋ＭＬ－－－－－然而９组相比，ＬＰＳ＋ＧＬＰ２ＬＰＳ＋ＭＬ９＋ＧＬＰ２组的ＩＰＥＣＪ２，与和两细胞８２ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三＜＞＞单层对ＨＲＰ的漏过率均显著降低（Ｐ０．０５），但两组间ＨＲＰ漏过率差异不显著（／０．０５），ＭＬＣＫＬＰＳ诱。结果表明的激活参与了导的细胞单层通透性的增加；与单独－２ＭＬ－９ＬＰＳＬＰ－２添加ＧＬＰ相比，单独添加部分缓解了的作用；而同时添加Ｇ和－－ＭＬ－９与单独添加ＧＬＰ２的结果无显著差异ＬＰ２，提示Ｇ也部分通过抑制ＭＬＣＫ活性降低ＬＰＳ诱导的细胞单层通透性，但也可能存在其它途径调节细胞单层的通透性。！ＪＬ〇８００－ｈｉｉｌｉｌｉ３２＾１ＬＣＫ抑制（ＭＬ－９）存在条件－２图剂下，ＧＬＰ对ＬＰＳ诱导的细胞单层通透性的作用（重复数ｎ＝３）Ｆ－－ｉｕｒｅ３２ＧＬＰ２ｒｅｖｅｎｔｅｄＬＰＳｉｎｄｕｃｅｄｉｎｃｒｅａｓｅｓｉｎｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｉｈｉｉｔｏｆｇｔｕｎｃｔｏｎｎｔｈｅｒｅｓｅｎｃｅｏｆｇｐｐｙｊｐ＊ｈ－＜＋－ｉｂｉｔｅｒＭＬ９．：Ｐ０．０５ｖｓ．ＬＰＳＵ＼Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＬＰＳＭＬ９．ＶａｌｕｅｓｆｈＭＬＣＫｉｎ（）；ａｒｅｍｅａｎｓｏｔｒｅｅｒｅｌｉｃａｔｅｓ．ｐ３．２．３ＴＪ蛋白的分布及超微结构－２和ＬＰＳ对ＺＯ－采用免疫荧光染色技术对ＭＬＣＫ存在条件下ＧＬＰ１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的超微结构分布的影响进行定位分析，结果见图３３。如图所示，正常对照组细ＺＯ－１－－ｃｃ丨ｕｄｉｎ蛋白在细胞ＬＰＳＺＯ１胞的和ｏ细胞接触面呈网状分布；处理，的网状结构线条断裂、消失，ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的网状结构也消失（图３３Ｂ、Ｇ：白色箭头），胞ｏｃｃｉ－浆中出现了点状分布的ｌｕｄｎ蛋白荧光染色（图３３Ｇ：红色箭头）２；ＧＬＰ处理恢ＺＯ－－－复了１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白在细胞膜的正常分布；ＭＬ９单独处理，可见ＺＯ１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白在细胞膜上的荧光染色均较ＬＰＳ组有所增加，局部呈网状分布，但是线条断裂不完整（图３３Ｄ、Ｉ：白色箭头），ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白在胞内的定位较ＬＰＳ组有所降低（图３３Ｌ－ＬＰ－２－１：红色箭头）；同时添加Ｍ９和Ｇ，细胞间ＺＯ１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的定位和分布恢复至正常状态。８３ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三ＺＯ－１Ｏｃｃｌｕｄｉｎ■■■ＩＨＨＩ－－－？３３ＭＬ２ＬＰＳ应ＰＥＣＪ２（ＡＥ）ｏｃｃ？９对激的ｌｕｄｉｎ（ＦＪ）图和ＧＵＶＩ细胞ＴＪ蛋白ＺＯｌ和蛋白超微结构及分布的影响（３２〇ｘ＞。白色箭头：荧光染色线条断裂和消失红色箭头：ｏｃｃｌｕｄｉｎ的定位集中于胞浆；－￣ｒ－－Ｆｔｈｅｒｔｔｎｔｔｉｕｅ３３ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＭＬ９ａｎｄＧＬＰ２ｏｎｕｌｔａｓｔｒｕｃｕｒｅａｎｄｌｏｃａｌｉｚａｉｏｏｆｉｈｕｎｃｔｉｏｎｓＺＯ１ＡＥａｎｄｇｇ（）ｊ？ｘｏｃｃ．ｒｒｅｎｅｆｒａｃｒｒｒｌｕｄｉｎＦＪ３２０Ｗｈｉｔｅａｒｏｗｈｅａｄ：ｆｌｕｏｓｃｅｎｃｅｌｉｔｕｅｄａｎｄｄｉｓａｅａｅｄｒｅｄａｒｏｗｈｅａｄ：ｏｃｃｌｕｄｉｎｍａｉｎｌ（）（）ｐｐ；ｙｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎｃｙｔｏｐｌａｓｍ．３．２．４ＴＪ蛋白表达量使用ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＴＪ蛋白表达量的变化，结果如图３４所示：ＬＰＳ显著降低－－了ＺＯ１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的表达量（Ｐ＜０．０５）ＬＰＳ组ＧＬＰ２提高；与相比，单独添加８４ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三－Ｚ０－１ｃｃ＜５ＬＰＳＴＪ了和ｏｌｕｄｉｎ蛋白的表达（Ｐ０．０）ＭＬ９；单独添加，对下调的蛋白－ＺＯ－１ｃｃ－和ｏｌｕｄｉｎ的表达量均没有显著性作用效果９２促；在ＭＬ存在条件下，ＧＬＰ＜进了ＴＪ蛋白的表达０．０５），抑制了ＬＰＳ对ＴＪ蛋白表达的负向调节作用；ＬＰＳ＋ＧＬＰ－２Ｓ＋ＧＬＰ－２＋ＭＬ－９ＴＪ与ＬＰ蛋白表达量差异不显著：组的；以上结果表明抑制ＭＬＣＫ酶活不参与ＧＬＰ－２对ＴＪ蛋白表达的调节。ＬＰ—＋＋＋＋Ｓ—一—ＧＬＰ－＋＋———＋＋２＾ＺＯ－１－ＳＭＢ２３０ｋＤＯｃｃ－ｍｍｍ雜病ｍｍｌｕｄｉｎｍｍ５９ｋＤＧＡＰＤＨ－ｏｃｃｌｕｄｉｎ２〇０ＺＯ－１ｃｉ５ｉｉｊ３幽通Ａ％〇＞ＡＩＶｂ〇＞＾Ｊ，Ｖ，ｖ々Ｖ／－＝３４－ＧＬＰ２Ｓ－－图９和对ＬＰ应激的丨ＰＥＣＪ２细胞ＺＯｌｉ（３ＭＬ１和ｏｃｃｕｄｎ蛋白表达的影响重复数ｎ）－－－－Ｆｉｉｕｒｅ３４ｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆＭＬ９ａｎｄＧＬＰ２ｏｎｒｏｔｅｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆＺＯ１ａｎｄｏｃｃｌｕｄｉｎｉｎＬＰＳｃｈａｌｌｅｎｅｄｇｐｐｇ＊－＜－１ＰＥＣＪ２ｃｅｌｌ．：Ｐ０．０５ｖｓ．ＬＰＳ＃：Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＬＰＳ＋ＭＬ９ｎｓ：Ｐ＞０．０５ｖｓＬＰＳ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆ．；；ｔｈｒｅｅｒｅｌｉｃａ．ｐｔｅｓ４讨论－４－．１ＧＬＰ２对ＬＰＳ应激的ＰＥＣＪ２细胞系ＴＪ蛋白的影响Ｉ４－．１．１ＧＬＰ２对ＴＪ蛋白表达的影响关于ＧＬＰ－２在不同体内外研宄模型上调节肠上皮ＴＪ蛋白表达量的研宄已有零星６］［ｏｒａｎ２０－－报道。最早的研宄是Ｍ等（１２）在Ｃａｃｏ２细胞系上研究发现ＧＬＰ２能促进－１ｏｃｃ肠上皮屏障的形成及ＺＯ及ｌｕｄｉｎ蛋白的表达。在离体培养的断奶仔猪空肠肠段１４２１４３［１［］－－显著促进Ｔ以及ＬＰＳ应激的的丨ＰＥＣＪ２细胞上研究发现２能Ｊ蛋白，添加ＧＬＰ－的表达，，增强肠上皮屏障功能。在体内试验的相关研究发现ＧＬＰ２不仅促进未感染８５ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三Ｄｏｖｈ的奶牛ＴＪ相关蛋白的表达’也能抑制引起的肠组织ＴＪ蛋白的下调；１５４一［］－２对ＴＪ蛋白表达的促进作用（１也有些间接的证据证明ＧＬＰ，Ｓｈａｎ等２０３）在－－２２型糖尿病大鼠上研宄发现双黄连通过促进ＧＬＰ的分泌，提高糖尿病下调的小肠－－ＺＯ－１的表达，修复肠粘膜损伤２１，ＧＬＰ水平与ＺＯ的表达呈显著正相关关系。在本－－，在ＬＰＳ应激条件下添加ＧＬＰ２能有效缓解ＬＰＳ下调的ＺＯ１和ｏｃｃｕｄｉｎ研究中ｌ蛋一－白的表达，２，这与我们的体内动物试验获得的研宄结果致也再次证明了ＧＬＰ对仔猪肠上皮细胞ＴＪ屏障功能调节的积极作用－２。由此，在应激条件下，ＧＬＰ可通过刺激ＴＪ相关蛋白的表达实现对ＴＪ结构稳定的关键调节作用。４－．１．２ＧＬＰ２对ＴＪ蛋白超微结构及分布的影响ＧＬＰ－２调节ＴＪ蛋白超微结构及分布的研究尚未见相关报道。本试验通过免疫荧－ＬＰＳ应激的－光染色技术考察ＧＬＰ２对ＩＰＥＣＪ２细胞ＴＪ蛋白定位和分布的影响，研宄－ｏｃｃ结果显示，在保证细胞单层结构完整的条件下，ＬＰＳ处理引起ＺＯ１和ｌｕｄｉｎ蛋白一的网状结构消失不见ｅｓｔｅｒｎｂｂｔ，线条断裂，这与ｗ测得的表达量下调的结果致；ｏｃｃｎ蛋白的定位由主要位于细胞膜上（对照组至胞浆中（ＬＰＳ组）。并且ｌｕｄｉ）转移关于ｏｃｃｌｕｄｉｎ亚细胞定位的改变，研宄报道ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白分为非憐酸化和磷酸化两种形式。非磷酸化的ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白位于基底外侧膜和细胞质囊泡上，而憐酸化的４９［］ｏｃｃｕｄｎ仅－Ｊ上，可ｌｉ限于ＮＰ４０不溶部分的Ｔ以推测本研宄中ＬＰＳ应激可能通过调ｃｃ－节了ｏｌｕｄｉｎ的磷酸化状态进而改变了ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白在细胞内的定位；而ＧＬＰ２处理可能抑制或缓解了ｏｃｃｌｕｄｉｎ鱗酸化状态的这种改变。那么，在这个过程中ｏｃｃｌｕｄｉｎ憐＋２＋２酸化究竟如何影响它在ＴＪ的定位呢？研宄发现饥饿或移除Ｃａ，在Ｃａ的培养基后１５５［］ＭＤＣＫ细胞单层ＴＪ结构开放，伴随着ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的去憐酸化，提示ｏｃｃｌｕｄｉｎＪ－的磷酸化有利于Ｔ结构的装配。然而也有不同的研究结果，如氧化应激引起Ｃａｃｏ２ｏｃｃｉｎｒｏｃｃｌｕｄｉｎ，细胞ｌｕｄ的Ｔｙ残基快速憐酸化导致在细胞的定位发生重分布细胞单１５６［］层通透性增强Ｓｒｃ活性降低了ｏｃｃｌｕｄｉｎＴｒ残基磷酸，缓解了短暂局；抑制ｙ化水平１５７［］灶性脑缺血增强的血脑屏障通透性。那么，ｏｃｃｌｕｄｉｎ残基的磷酸化究竟对上皮ＴＪ“”的屏障功能有的影响是如何的呢？为什么产生这种看似矛盾的差异呢？分析其原Ｔ－ｃｃ，因，ｏｌｕｄｉｎ胞外环的同型相互作用决定Ｊ的屏障功能而胞内的Ｃ尾端ｏｃｃｌｕｄｉｎｉ５８－－－［］？３ａｃ与ＴＪ其它蛋白如ＺＯ１ＺＯ以及骨架蛋白丝Ｆｔｉｎ相互作用。Ｋａｌｅ等（２００３）－－用ＧＳＴ融合技术将ｃＳｒｃ结合在ｏｃｃｌｕｄｉｎ上隣酸化它的Ｔｙｒ残基，考察Ｃｏｃｃｌｕｄｉｎ的８６ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宂：试验三￣－－－Ｚ０－ａｃｔＴｒ隣酸化对其结合ｌＺ０３以及Ｆｉｎ的能力，结果表明Ｃｏｃｃｌｕｄｉｎ的Ｔｒ憐ｙｙ－－？ＺＯ－Ｆａｃ－酸化减弱了它结合ＺＯ１３的能力，但对ｔｉｎ的结合没有响，提示ｃＳｒｃ介一１５９Ｔｏ［］导的Ｊ损伤可能涉及ｃｃｌｕｄｉｎ的Ｔｙｒ磷酸化。进步的，Ｒａｏ等（２００９）以ｏｃｃｌｕｄｉｎ敲除小鼠为研究对象证实了ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白在上皮ＴＪ调节中的作用是必不可少的。该研究详细描述了ｏｃｃｌｕｄｉｎ磷酸化对于调节它自身进入ＴＪ复合物进行装配的作用。Ｏｃｃｌｕｄｉｎ在完整的上皮上具有高度磷酸化的Ｓｅｒ和Ｔｈｒ残基，而Ｔｙｒ磷酸化保持在最ＴＪｏｃｃｕｄｎ受ｃ－ＳｒｃＰＫＣ低水平，ｌｉ、；当受到各种因素破坏时到多种蛋白激酶如ｇ和ＰＫＣＡＡ以及蛋白磷酸化酶如ＰＰ２Ａ、ＰＰ１和ＰＴＰ１Ｂ的调节经历了Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基的去磷一酸化以及Ｔｙｒ残基磷酸化提高的过程；进步在体外试验的研究结果也表明ｏｃｃｌｕｄｉｎ－－Ｃ端Ｔｙｒ磷酸化减弱了它与Ｚ０１间的相互作用，而这可能就是ｏｃｃｌｕｄｉｎ从ＴＪ复合物－－１中分离出来的原因，ＧＬＰ２处理恢复了Ｚ０ｃｃｌｕｄｉｎ。本试验中和ｏ蛋白在细胞膜上的正常分布和定位，维持了ＬＰＳ应激条件下ＴＪ蛋白网状结构的完整性。由此推测，－经由某些激酶或磷酸酶影响ｏｃｃＧＬＰ２可能通过信号途径ｌｕｄｉｎ蛋白的磷酸化，从而影“”“”响ＴＪ复合物装配过程中ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白从胞浆到膜的招募。此外，ＭＬＣ磷酸６１［］化水平升高被认为是肠上皮屏障通透性增加的重要分子基础。当ＭＬＣ的第１８位１９，ＡＴＰ苏氨酸和第位丝氨酸残基发生磷酸化后活化肌球蛋白头部的酶，产生的能Ｆ－ａｃＰＡＭＲ收缩量使肌动蛋白微丝ｔｉｎ滑动，周边肌动球蛋白环引起细胞发生向心性收缩而致ＴＪ分子结构发生重排，因此推测本试验中ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的重新定位还可能是由ＭＬＣ过磷酸化引起ＴＪ结构重排的调控结果。－４．１．３ＧＬＰ２对ＬＰＳ应激早期ｐＭＬＣ磷酸化的作用－２－为了研究ＧＬＰ对细胞ＴＪ结构稳定性的作用机制，本试验还考察了ＧＬＰ２对ＬＰＳ应激早期ｐＭＬＣ磷酸化水平的影响。结果显示，ＬＰＳ应激４５ｍｉｎ后，ｐＭＬＣ磷－酸化水平显著提高，而ＧＬＰ２处理缓解了ＬＰＳ引起的ｐＭＬＣ磷酸化水平的变化。同时，研宄观察到ｐＭＬＣ磷酸化水平降低的同时，ＭＬＣＫ蛋白的表达量也显著降低，－由此推测，ＧＬＰ２可能调节ＭＬＣＫ的表达影响ＬＰＳ应激下ｐＭＬＣ的磷酸化水平，进“”而维持ＴＪ结构的稳定，防止上皮细胞间旁路对大分子物质的开放。这与试验二动一物试验中得到的研宄结果致－２，即ＧＬＰ对应激条件下的ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ信号具有直－接的调节作用。由此，在仔猪生产中２有助，断奶后应用ＧＬＰ于缓解由应激导致的肠道Ｔ，维持肠道物理屏障的功能。Ｊ超微结构的早期适应性变化８７ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三４－２缓．２ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ信号在ＧＬＰ解应激的细胞单层通透性作用中的地位－／ＭＬＣ的水由４．１结果可知，ＧＬＰ２具有促进ＴＪ表达的作用，亦可下调ＭＬＣＫｐ“”平。目前许多研宄均己肯定ＭＬＣＫ在造成肠屏障功能障碍机理中的中心地位，Ｉ６ｅ］ＣＫ［如ＭＬ抑制剂的使用可以缓解小鼠肠道炎症导致的肠屏障通透性的增加，可保Ｚ０－持烧伤小鼠肠上皮ＴＪ蛋白１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ的正常分布以缓解肠屏障的破坏但是，我们认为，如果ＭＬＣＫ所介导的ｐＭＬＣ鱗酸化对于１７蛋白的表达并无影响，那么单独以ＭＬＣＫ作为肠屏障损伤的治疗靶标也不能有效改善由ＴＪ蛋白表达下降所引发的肠屏障通透性的增强。遗憾的是，几乎没有文献报道ＭＬＣＫ的抑制对ＴＪ蛋白表达的影响。正如３．１的研究所观察到的，ＬＰＳ应澂４５ｍｉｎ后ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ水平快速ＧＬＰ－２处理缓解提高，，而，２４ｈ后ＴＪ蛋白的表达量下降分布及超微结构发生改变ＰＳＧＬＰ－２调节的ＭＬＣＫ／ＭＬＣ信号与ＴＪ蛋白的了Ｌ的作用，那么，ｐ表达之间又是否一－９对Ｔ存在上下游的调节关系呢？因此，我们进步考察了添加ＭＬＣＫ抑制剂ＭＬＪ－蛋白表达以及对ＧＬＰ２作用效果的影响。－９－本试验３．２的结果显示，ＬＰＳ应激早期引起了ＭＬＣ的快速磷酸化，ＭＬ、ＧＬＰ２、－－ＭＬ９＋ＧＬＰ２均显ＭＬＣ磷酸化水平对于通透性的作用，ＬＰＳ引起细胞单著降低了ｐ；Ｌ－９和ＧＬＰ－２，但单独层通透性增强，Ｍ单独处理均缓解ＬＰＳ增强的细胞单层通透性－－－９对改善细胞单层通透性的作用效果较单独添加ＧＬＰ２的效果差９添加ＭＬ；若ＭＬ－－２同时添加－。和ＧＬＰ，则ＭＬ９对ＧＬＰ２的作用没有影响分析其原因，通过考察应－２４ｈ）ＴＪ，ｈ后Ｚ０激后期结果发现：ＬＰＳ应激显著下调了２４１（后蛋白的表达量ｏｃｄｕｄ－ｉｎ蛋白ＭＬ９对ＬＰＳ下调的ＴＪ蛋白没有显著作用效果和的表达；单独添加；－－－２Ｌ９和ＧＬＰ２ＬＰＳ下调的ＴＪ而单独添加ＧＬＰ或同时添加Ｍ均显著提高蛋白的表达，两组间差异不显著。以上研究表明ＭＬＣＫ并没有对ＴＪ蛋白表达的调节作用，也不介－－ｕｄ导ＧＬＰ２对ＴＪ蛋白表达的调节。另外，Ｚ０１和ｏｃｄｉｎ蛋白的免疫荧光染色结果显ｈ后－示，Ｚ０１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的网状结构消失，细胞边缘的荧光染色，ＬＰＳ应激２４ｏｃｃ＋ＧＬＰ－ｌｕｄｉｎ２线条断裂，并且蛋白的定位主要位于胞浆呈颗粒状或指环状；ＬＰＳ＋ＧＬＰ－２＋ＭＬ－９组与对照组相比组、ＬＰＳ，尽管荧光染色较浅，但与ＬＰＳ组相比，细ＴＪＭＬ－９２４ｈ胞的蛋白在细胞间的网状结构分布完整，线条清晰；单独添加，应激后ＴＪ蛋白的网状结构分布较ＬＰＳ组有所改善，ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白在胞浆中的定位也有所８８ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三ＬＣＦ－ａｃｔ降低，这与前人报道的Ｍ磷酸化引起细胞骨架微丝ｉｎ滑动，牵拉细胞发生向“”一６１Ｔ［］ＭＬＣ的Ｊ蛋白内在化的研宂结果致，心性收缩导致，抑制磷酸化可以缓“”解ＴＪ蛋白的内在化及分子结构重排，使其存在于细胞膜上以维持ＴＪ结构；然而，“”－９－ｏｃｃｎ单独添加ＭＬ，Ｚ０１和ｌｕｄｉ蛋白结构则存在细胞边缘线条断裂和不完整的现象，这可能与ＭＬＣＫ抑制剂不能缓解ＬＰＳ下调的ＴＪ蛋白表达有关。由此，ＭＬＣＫ介导的ｐＭＬＣ磺酸化并不参与紧密连接蛋白表达量的调节。结合前人对ＭＬＣ信号的“”地位可能更应该是存在于造成肠屏障通透性改变研宄结果推测，ＭＬＣＫ的中心的早期阶段，当应激后期（２４ｈ后）紧密连接蛋白的表达总量降低，抑制ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ－对改善通透性的作用效果将非常有限。由于本试验中ＧＬＰ２对ｐＭＬＣ磷酸化的抑制“”作用－９模拟，加之它对细胞单层通透性的缓解作用能部分被ＭＬ，由此认定ＭＬＣＫ７ＭＬＣ部分介导了ＧＬＰ－２对Ｔ－２ｐＪ结构稳定的保护作用。ＧＬＰ对应激条件下细胞ＴＪ蛋白表达的调节独立于ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ信号。５小结综合以上结果，可以得出结论：８－ｘ－２（１）在ＩＰＥＣＪ２细胞系上，ｌｌ（Ｔｍ〇ｌ／ＬＧＬＰ改善应激的肠上皮单层细胞间通透性的作用机制与Ｔ。Ｊ结构的稳定密切相关－（２）ＬＰＳ应激条件下，ＧＬＰ２对ＴＪ的调节涉及：１）促进细胞膜上ＴＪ蛋白的表达２），调节ＴＪ关键蛋白的细胞定位和胞间重；下调应激初始ＭＬＣ的过磷酸化水平分布。（３）ＭＬＣＫ介导的ｐＭＬＣ磷酸化并不参与应激状态下对ＴＪ蛋白表达量的调节，当应激后期ＴＪ蛋白的表达量降低，抑制ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ对改善通透性的作用效果有限。８９ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宂：试验三（三）ＧＬＰ－２影响ＴＪ屏障功能的信号途径研究１．前言ＬＰ－Ｚ０－试验三（二）的结果显示Ｇ２能作用于ＴＪ关键蛋白１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ的表达和分布，缓解ＬＰＳ增强的细胞单层通透性；ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ信号主要通过影响ＴＪ蛋白－ＭＬＣ途径的分布和定位在应激期间参与介导了了ＧＬＰ２的保护作用。由于ＭＬＣＫ／ｐＴＪ－并不参与介导蛋白的表达，可以推测ＧＬＰ２通过不同的信号途径影响了ＴＪ的稳ＴＪ正，哪些定，从而维持了细胞间常的屏障功能。那么信号途径或蛋白激酶可能参７一？一［］方面，关于ＴＪ蛋白表达的调节与了这过程的调节呢，蒋义等（２０１２）发现－－ＧＬＰ２可以促进离体培养的断奶仔猪空肠ＴＪ蛋白ｏｃｃｌｕｄｉｎ、ＺＯ１和ｃｌａｕｄｉｎ的表达，ＭＥＫＬＰ－２Ｊ／ＥＲＫ１／２介导的ｐ９０ＲＳＫ的磷酸化可能是Ｇ调控肠道Ｔ蛋白表达的重要信一－２也可能通过激活Ｐ－Ａｋｔ号通路之ＧＬＰＩ３Ｋ／／ｍＴＯＲ信号转导途径对ＬＰＳ应激的；１４３［］－ＰＥＣ应，。ＩＪ２细胞产生保护效，促进ＴＪ关键蛋白的表达降低肠上皮细胞间的通透性ＧＬＰ－２调节Ｔ以上研宄仅考察了Ｊ蛋白表达的信号途径，但对ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ信号的调节尚未见相关研究报道，我们知道通常ＭＬＣ的磷酸化受到。通过综述部分的总结－ＮＦ－ｋＢ、ＲＯＣＫ等信号分子的调节，抑制ＮＦｋＢ及ＲＯＣＫ的活化可以缓解由ＭＬＣ过－度磷酸化造成的ＴＪ结构的重排。那么，ＧＬＰ２是否作用于这两条路径上关键信号分子实现对ｐＭＬＣ磷酸化的调节呢？此外，对于ＴＪ蛋白表达的调节是否还存在其它信号途径参与ＧＬＰ－２的促进作用呢？各条路径之间的关系是怎样的？这些均未见相关，报道。因此，本试验将结合使用各信号途径的特异性抑制剂或激动剂在ＬＰＳ应激条件下考察ＧＬＰ－２对以上可能的信号途径的调节作用及其相互之间的上下游关系。２材料与方法２－－１ｋＢＧＬＰ．ＮＦ信号途径在２调控ＴＪ中的作用２．１．１试验设计－－将含最适ＧＬＰ２剂量的培养基预先于ＬＰＳ处理添加，结合使用ＮＦｋＢ抑制剂１６２［］ＰＤＴＣＬＰ－（剂量参考Ａｌｅｘａｎｄｅｒ等（１９９５））考察Ｇ２对ＬＰＳ造成ＴＪ屏障损伤的－：，ＬＰＳ组２＋ＬＰＳ，Ｐ保护作用，ＧＬＰ组ＤＴＣ＋ＬＰＳ组和。试验分５组对照组９０ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三－２＋ＬＰＳＰＤＴＣ＋ＧＬＰ组（见表１７）。表１７试验设计Ｔａｂｌｅ１７ｔｅｓｔｄｅｓｉｇｎ－ｍｏＰＤＴＣｍｏＧＬＰ２ｌ／ＬＬＰＳ／ｍＬＮ组别（ｎｌ／Ｌ（）（ｎ）ｇ）对照组〇００３一００处理１００３—＊处理二０１０１００３处理三５００１００３－？处理四５０１〇１００３２．１．２试验材料—６５ＮＦ－ｘｆｉ激活核转运检测试剂盒购自中国碧云天胞浆蛋白提取试剂盒、ｐ，１＾２３Ｓｗ３３／３６生物技术有限公司；ｐＩＫＫａ、ＩＫＫａ、ｐｌＫＢａ，购自中国生工生物工程有限公？８／Ｓｗ１９司；兔抗ｐＭＬＣ多克隆抗体，购自美国ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司。２．１．３试验方法２．１．３．１细胞培养按照具体指标自行选择６孔或１２孔细胞培养板中进行细胞培养，细胞培养及处理的方法同试验三（二）２．２．３．１。２．１．３．２胞浆蛋白的提取使用胞浆蛋白提取试剂盒进行提取，具体操作方法如下：１）每孔滴加少量胰酶将细胞从６孔培养板上消化下来，每孔加入１ｍＬ培养基°｜１０条件５００＞１１１终止消化，将细胞用移液枪吸入１．５＾￡？管，４下，＾离心３１丨１收集细■，弃去培养液，用预冷的ＰＢＳ溶液洗２次胞；２）用移液枪尽可能吸去上清２０Ｌ细胞压积（离心后的），按ｐ紧实细胞体积加入２００此预冷的ＢｕｆｅｒＡ（每ｍＬＢｕｆｅｒＡ预先加入１ｐＬＤＴＴ、５此１００ｍｍｏｌ／ＬＰＭＳＦ？和５ｈＬ蛋白酶抑制剂），剧烈涡旋振荡１５ｓｅｃ，于冰上静置１０１５ｍｉｎ；３）加入１１｜ａＬ冷ＢｕｆｅｒＢ，剧烈润旋振荡５ｓｅｃ，放置冰上１ｍｉｎ；°Ｃｘ４）再次剧烈润旋振荡５ｓｅｃ后，４条件下，１６００〇离心５ｍｉｎｇ；一５）尽快将上清转入另预冷的无菌微量离心管，即得胞浆蛋白；９１ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三°）－６将提取的胞衆蛋白进行蛋白定量（ＢＣＡ法），分装并保存于８０Ｃ，避免反复冻融。２１．４．检测指标２－．１．４．１胞衆ＩｋＢ蛋白含量－ｋＢ蛋白的含量考察ＬＰＳ添加４５ｍｉｎ后胞浆Ｉ，样品采用胞浆蛋白提取试剂盒提－取的胞浆蛋白。试验采用ＩｋＢＥＬＩＳＡ检测试剂盒进行测定，操作方法严格按试剂盒－ｋＢ蛋白含量使用该样品相应的蛋白浓度进行校正说明书进行。样品的Ｉ，结果用“”ｎｇ／ｍｇ蛋白表示。２－．１．４．２６５ＮＦｋＢ核转位ｐ－６５ＮＦ－１２ＮＦ用于ｐｔｃＢ核转位测定的细胞接种于孔细胞培养板上。采用Ｐ６５ｋＢ激活—核转运检测试剂盒进行检测，按试剂盒说明书进行操作，方法采用免疫荧光染－ＫＢ多克隆抗体色技术。兔抗Ｐ６５ＮＦ，稀释比例为１用免疫染色稀释液进行稀释：３０。试验具体操作如下：１）ＢＳ１，用Ｐ洗３次。加入５００吣免疫染色固定液，固定５ｍｉｎ吸除培养液；２）吸除固定液，用ＰＢＳ液洗３次ｘ３ｍｉｎ。洗完时吸尽ＰＢＳ液，加入５００吣０．５％＇１－１４１：〇１１１００＼１１１１１１，通透２〇；Ｔｒ－３）吸除ｉｔｏｎｌＯＯＸ，用ＰＢＳ洗３次ｘ３ｍｉｎ，吸尽ＰＢＳ液。加入５００ｉＬ免疫染［色封闭液，室温封闭２ｈ；°４）６５ＮＦ－６５ＮＦ－吸除免疫染色封闭液，加入ｐＫＢ抗体，４Ｃ孵育过夜。回收ＰｋＢ°抗体，４Ｃ保存；ｘ－二抗５）ＰＢＳ洗涤３次６ｍｉｎ。洗完时吸尽洗涤液。加入羊抗兔ＦＩＴＣＩｇＧ（稀释比例为１：２００），室温孵育１．５ｈ；６）吸除二抗，用ＰＢＳ溶洗３次ｘ６ｍｉｎ。加入３００叫细胞核染色液（ＤＡＰＩ），室３０ｍｎ温染色ｉ；７）吸除ＤＡＰＩ，用ＰＢＳ洗３次ｘ３ｍｉｎ。滴加适量抗荧光淬灭封片液，使用荧光显微镜观察并拍照６５ＮＦ－。本试验中细胞核的ＤＡＰＩ染色为蓝色荧光，ＰｋＢ的染色为绿色荧光。９２ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三２．１．４．３ＭＬＣＫ转录水平一ＲＴ－ＰＣＲ试验方法同试验ｍＲＮＡ提取、反转录和ｑ。Ｔｈｒ２３Ｓｅｒ３３／３６Ｔｂｒｌ８／Ｓｅｒ１９２．１．４．４细胞ＩＫＫａ、ＩＫＫａ、ｌＫＢａ、ＭＬＣ蛋白表达量ｐｐｐ采用ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术进行测定。试验方法同试验二。２２ＲＯＣＫＰＭＬＣＬＰ－．／ＭＬＣ／ｐ信号途径在Ｇ２调节ＭＬＣ磷酸化中的作用２．２．１试验设计－２ａ分别同时与ＧＬＰ添加ＭＬＣＰ的抑制剂ＣｌｙｃｕｌｉｎＡ（剂量根据产品的ＩＣ５〇值和１６３Ｄａｍ［］ｒｏｎ等（１９９５）进行确定）和ＲＯＣＫ的特异性抑制剂Ｙ２７６３２（剂量参考产品１６４［］的ＩＣ５Ｑ和Ｍｏｓｈｉ等（２０１３）），５：ｉｙ预处理ｌｈ后进行ＬＰＳ处理。试验设组空白ＬＰＳ＋ＧＬＰ－２＋ＧＬＰ－２＋Ｃａ对照组、ＬＰＳ应激对照组、处理组、ＬＰＳｌｙｃｕｌｉｎＡ、－ＬＰＳ＋ＧＬＰ－２＋Ｙ２７６３２８ＭＬＣ磷酸化处理组（见表１）。本试验目的在于探讨ＧＬＰ２对－的调控是否除作用于ＮＦｋＢ信号途径影响ＭＬＣＫ活力外，还经由对ＭＬＣＰ酶活的调节进行补充。表１８试验设计Ｔａｂｌｅ１８ｔｅｓｔｄｅｓｉｎｇ－Ｙ２７６３２ｌ组别ＣａｌｃｕｌｉｎＡ（ｎｍｏｌ／Ｌ）（ｉｍｏ／ＬＧＬＰ２ｍｏｌ／ＬＬＰＳｉ／ｍＬＮｙ［）（）（＼ｇ）对照组〇〇００３一０００处理１００３８处理二００ＵＴ１００３处理三１１００１００３８处理四０１０１（Ｔ１００３２．２．２试验材料Ｔｔｗ６９６猪ＭＬＣＰＥＬＩＳＡ试剂盒，购自北京奇松生物科技有限公司；兔抗ＭＹＰＴｌｐ多克隆抗体，购自美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司。２．２．３检测指标１）ＭＬＣＰ酶活：按ＭＬＣＰＥＬＩＳＡ试剂盒说明书进行检测，试剂盒的最低检测限为１．０ｐｇ／ｍＬ。９３ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三Ｔ＿６ＴｈＨ８／Ｓｅ￣２）ｐＭＹＰＴｌ和ｐＭＬＣ磷酸化水平：ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ进行测定，试验方法Ｔｈｆ６％同试验二。ｐＭＹＰＴｌ多克隆抗体的稀释比例为１：１０００。２Ｐ－２Ｔ２．３ＭＥＫ／ＥＲＫ１／信号途径对ＧＬ调节Ｊ结构的作用２．３．１试验设计６５［１］添加ＭＥＫ的特异抑制剂Ｕ０１２６（剂量参考Ｔｓａｉ等（２００７）），试验共分为５－－２＋ＬＰＳ组、Ｕ０２６＋ＬＰＳ、＋ＬＰ组组：对照组，ＬＰＳ组，ＧＬＰ１组Ｕ０１２６＋ＧＬＰ２Ｓ加；添ＭＥＫ特异性抑制剂Ｕ０２６Ｋ１／ＬＰ－１考察ＭＥＫ／ＥＲ２信号途径是否参与Ｇ２对ＴＪ的调节－ＫＴ（见表１９）。本研宄可以胞内ＧＬＰ２是否经ＭＥ／ＥＲＫ１／２介导促进Ｊ蛋白表达，是ＮＦ－ｋＢ信号Ｊ否调节ＬＰＳ活化的，抑制Ｔ超微结构分布的改变。表１９试验设计Ｔａｂｌｅ１９ｔｅｓｔｄｅｓｉｎｇＵ０１２６ｉ－ｍｏｌ／ＬＧＬＰ２ｍｏｌ／ＬＬＰＳｘ／ｍＬＮ组别（ｆ）（）（＼ｇ）对照组〇００３一０处理０１００３８处理二〇ｕｒｌｏｏ３处理三１００１００３８处理四１０ＨＴ１００３２．３．２检测指标２．３．２．１ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔＴｈｒ２°２即２〇４Ｔｈｒ２３Ｓｅｒ３２／３６考察４５ｍｉｎ后ＥＲＫｌ／２、ＥＲＫｌ／２、ＨＳＰ７０、ｐＩＫＫ、ＩＫＫ、ｐｌＫＢ、ｐＴｈｄ８／ＳｅＨ９Ｔｈｒｔ９６ＭＬＣＭＹＰＴ－ｐ、ｐｌ以及２４ｈ后ＴＪ蛋白ＺＯ１、ｏｃｃｌｕｄｉｎ的蛋白表达量。２２２ＭＬＣＰ．３．．活力采用ＭＬＣＰＥＬＩＳＡ试剂盒进行检测，试剂盒的最低检测限为１．０ｐｇ／ｍＬ。２．４ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号旁路对细胞ＴＪ的影响２．４．１试验设计１６６［ＰＫＡＦｏ］添加的特异激活剂ｒｓｋｏｌｉｎ（剂量参考ＤｕｂＳ等（２００６））和抑制剂１６７［］Ｈ８９（剂量参考Ｓｉｎｃｌａｉｒ等（２００８）），从正反两方面考察Ｇ蛋白偶联介导的信号９４ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三－２对ＭＬＣ－途径是否参与ＧＬＰ磷酸化的调节。试验采用ＥＰＥＣＪ２细胞系，共分为７组：＋ＧＬＰ－－２ｒｓｋｌｉｎ＋、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ＋ＧＬＰ２＋ＬＰＳ、对照组，ＬＰＳ组，ＬＰＳ组，ＦｏｏＬＰＳ组组Ｈ８９＋ＬＰＳ组和８９＋ＧＬＰ－２＋ＬＰＳ组（见表２０）。ＨｃＡＭＰ－本试验可以明确／ＰＫＡ信号途径是否参与了ＧＬＰ２信号从胞外向胞内的传／－递ＰＫＡ的活化是否以ＭＥＫＥＲＫ１／２途径为靶点介导ＧＬＰ２调节ＴＪ蛋白表达；及结构重排的分子机制。表２０试验设计Ｔａｂｌｅ２０ｔｅｓｔｄｅｓｉｇｎｍｏ／Ｌ－２／ＬＰＳ组别Ｈ８９ｍｏｌ／Ｌ）Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（ｎｌＧＬＰ（ｍｏｌＬ）／ｍＬ）（ｎ）（ｎｇ对照组００００一０００处理１００８处理二００１（Ｔ１００处理三０２００１００＇８处理四０２０１０１００处理五１０００１００＇８处理六１００１０１００２．４．２试验材料ｃＡＭＰＥＬＩＳＡ试剂盒，ＰＫＡＥＬＩＳＡ试剂盒，购自北京奇松生物科技有限公司。２．４．３检测指标２．４．４．１ｃＡＭＰ环磷酸腺苷的水平变化ＬＰＳ添加４５ｍｉｎ后ｃＡＭＰ的水平采用ｃＡＭＰＥＬＩＳＡ试剂盒进行测定，具体方法参照试剂盒说明书进行操作。细胞培养结束后，用ＰＢＳ（Ｈ７．４）稀释细胞悬液，细Ｐ４胞浓度达到１．５Ｘｌ〇／ｍＬ左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并释放出细胞内成份；？ｍ离心２０ｍｉｎ（２０００３０００ｒ／ｉｎ），仔细收集上清。２Ａ４２ＰＫＡ．活性ＬＰＳ添加４５ｍｉｎ后ＰＫＡ的活性采用ＰＫＡＥＬＩＳＡ试剂盒进行测定，具体方法参照试剂盒说明书进行操作。样品收集方法同ｃＡＭＰ的检测。９５ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三ＴｈＴｈｒ—Ｔｈｒ６９６ｒ２３２．４Ａ３ＨＳＰ７０、ｌＫＫａ、ＩＫＫａ、ＥＲＫｌ，２、ＥＲＫ１／２、ｐＭＹＰＴｌ、ｐｐＴｈｒｌ８’Ｓｅｒ１９ＺＯ－１ｐＭＬＣ、、ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白表达量Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术进行检测ＬＰＳ添加４５ｍｉｎ后磷酸化蛋白的磷酸化水平以及２４ｈ－ＧＡＰＤＨ。后的Ｚ０１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白表达水平，以为内参蛋白２．４．４．４细胞通透性变化指标一检测方法同试验三（）２．２．４。２．５试验数据处理±ＳＥＭｎｅ－ｗａ试验数据用平均数表示；采用ＳＰＳＳ１７．０软件进行ｏｙＡＮＯＶＡ单因素方，以／０差分析．０５为显著水，不同试验组间平均值采用ＬＳＤ法进行差异显著性检验平。３结果－３．１ＮＦＫＢ／ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ信号途径Ｔｌｗ２３３．１．１ＩＫＫａ、ＩＫＫａ的表达水平ｐ－－－２处理对ａ亚基添加ＮＦｋＢ抑制剂ＰＤＴＣ和ＧＬＰＩＰＥＣＪ２细胞ＩＫＫ磷酸化的影？３３５－响见图。如图所示，ＬＰＳ引起了ＩＫＫａ磷酸化水平升高；与ＬＰＳ组相比，ＧＬＰ２、ｐＴｈ２３ｆＰＤＴＣ和ＧＬＰ－２＋ＰＤＴＣ均下调了ａ。ｐＩＫＫ磷酸化水平结果表明，ＬＰＳ应激条件下，－ＧＬＰ－２ＮＦｋＢ抑制剂ＰＤＴＣ对－具有ＩＫＫ磷酸化相似的作用效果，ＧＬＰ２可下调ＬＰＳ激活的。ＩＫＸ激酶ＬＰ—＋＋＋＋Ｓ———＋ＧＬ－＋Ｐ２ＰＤＴＣ———＋＋一一＿＿＿＿Ｔｈｒ２３８５ｋＤａｐＩＫＫｑ＿ｊ｜＾｜＾－ＧＡＰＤＨ，細＿？？＿，＿＿＿＿１＜？？３６ｋＤ３５ＰＤＴＣ－２图和ＧＬＰ对ＩＫＫ磷酸化的影响－２ｏｎＦｉｇｕｒｅ３５ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＰＤＴＣａｎｄＧＬＰＩＫＫｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｐＳｅｒ３３／３６３．１．２ｌＫＢａ磷酸化水平和胞浆ＩｋＢ蛋白含量ｐ一ｃｅｒ３３进步，本试验对ＩＫＫ激酶的下游靶蛋白ＩｋＢ的亚型ＩｉＢａ在Ｓ和３６位的９６ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三处理Ｓｃｔ３２／３６磷酸化水平，结果如图３６Ａ所示，与对照组比较，ＬＰＳ４５ｍｉｎ引起ＰＩｋＢＳｅｒ３２／３６Ｓ组－发生快速磷酸化，ＧＬＰ２ＬＰＢ；然而，与ＬＰ相比处理显著抑制了Ｓ诱导的ｐＩＫＮＦ－＋ＧＬＰ－２快速磷酸化；同时，ｋＢ抑制剂ＰＤＴＣ以及同时添加ＰＤＴＣ也抑制了ＬＰＳＳｃｔ３２／３６引起的ＩｋＢ磷酸化。ＩｋＢ发生磷酸化后会引起自身降解，因此，本试验考察了Ｐ胞浆中ＩｋＢ蛋白的含量是否发生变化，结果如图３６Ｂ所示，研究发现，在ＬＰＳ处理５＾３／３６４５〇１＾１后，伴随着卩＆８快速磷酸化，胞浆中１１＾的含量显著低于对照组（尸＜Ｓｅｒ３３／３６－－＋ＰＤＴＣ三组〇．〇５）单独添加ＧＬＰ２、ＰＤＴＣ或同时添加ＧＬＰ２与ｌＫＢ；而ｐ的变一，胞浆中ＩｋＢ含量显著高于ＬＰＳ应激组（Ｐ＜０．０５）化结果致，并且与对照组差异＞０－－．０５）。以上不显著（尸研宄结果表明，ＬＰＳ应激条件下，ＧＬＰ２具有ＮＦｋＢ抑制Ｓｃｔ３３／３６－剂ＰＤＴＣ相似的作用效果，ＧＬＰ２可下调ＬＰＳ引起的ＰＩｋＢ的快速磷酸化及胞浆ＩｋＢ的降解。ＡＬＰＳ—＋＋＋＋ＧＬＰ－２——＋—＋ＰＤＴＣ—一一＋＋Ｓ／６ｅｒ３２３？．＾＾ＰＩｋＢ３９ＫｄＣＡＰＤＨ－３６ｋＤ＇＇Ｂ＊．ｃＩ＊＊ｉＴ８＿＾論ｉ１＾１Ｉ４．Ｈｔ！ＭｌＩ／夕ｆ夕夕？：－２＝图３６０丁（和０１＾对胞浆丨化〇（（磷酸化及细胞丨１＾〇１含量的影响重复数１１３）＊＊ｆ－Ｆｌｉｈｏｈｏｉｇｕｒｅ３６ＴｈｅｅｅｃｔｏｆＰＤＴＣａｎｄＧＬＰ２ｏｎｃｙｔｏｐａｓｍｃＩｋＢａｓｒｌａｔｉｏｎａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒＩｋＢｏｃｏｎｔｅｎｔ．：ｐｐｙＰ＜０．０５ｖｓ．ＬＰＳ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｈｒｅｅｒｅｌｉｃａｔｅｓ．ｐ３－１３６５ＮＦ．．ｐＫＢ核转位一－－进步考察ＮＦｋＢ的激活状态，采用免疫荧光染色技术对Ｐ６５ＮＦｋＢ的核转位－，３７３７，ＩＰＥＣＪ２情况进行了测定结果如图所示可知，。由图在正常对照组细胞－６５ＮＦＫＢ完全定位于胞浆中ＬＰＳ处理Ｆ－，几ＩＴＣ６５ＮＦＫＢＰ；后乎所有标记的ｐ都与－ＤＡＰＩ标记的细胞核共同定位。ＧＬＰ２处理组６５ＮＦ－ｋＢ定位于胞浆中，ＰＤＴＣＰ；此外９７ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三ＰＤＴＣ＋ＧＬＰ－６５ＮＦ－ｋＢ２，处理和处理组Ｐ也主要定位于细胞胞浆中；以上结果表明－－－－ｋＢ信号途径关键信号分子的作用效果相似２ＧＬＰ２同ＮＦｋＢ抑制剂对ＮＦ，ＧＬＰ能抑制ＬＰＳ引起的Ｐ６５ＮＦ－ｋＢ核转位。１＇＇１１Ｉ■－尸Ｊ！二：丨＾ＭＢｍｍｍ！■■■图３７ＰＤＴＣ和ＧＬＰ－２对ＬＰＳ应激的－Ｊ２６５ＮＦ－Ｂ核转位的影响（３２〇ｘＩＰＥＣ细胞ｐＫ）－－－ｋＢｎｕｃｉＦｉｇｕｒｅ３７ＴｈｅｅｆｅｃｔｏｆＰＤＴＣａｎｄＧＬＰ２ｏｎ６５ＮＦｌｅａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｎｉｎＩＰＥＣＪ２ｃｅｌｌｃｈａｌｌｅｎｅｄｐｇｘｂｙＬＰＳ３２〇（）３．１．４ＭＬＣＫ蛋白表达及ｐＭＬＣ磷酸化水平－ｋＢ信号途径是否介ＧＬＰ－２为了考察ＮＦ导了对ＭＬＣＫ表达量的调节作用，通过－ＴｍＲＮＡｔＲＴＰＣＲ技术检测了各组ＭＬＣＡｌｔｑ的表达水平；并通过ｗｅｓｅｒｎｂｏ技术对９８ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三ＭＬＣＫ蛋白的表达量进行了测定。结果如图３８Ａ所示，在基因水平上，ＬＰＳ引起的－２显著抑制（尸＜０．０５）ＤＴＣ或同时ＭＺＣ尺ｍＲＮＡ表达上调被ＧＬＰ，并且单独添加ＰＤＴＣ＋ＧＬＰ－Ｌ：＜添加Ｐ２均显著抑制了ＭＯ基因表达的上调（尸０．０５）。图３８Ｂ显示了？＾＾９ＭＬＣＫ蛋白的表达水平和ｐＭＬＣ的磷酸化水平的变化。同Ｍ：Ｃ尺基因表达的？８／Ｓｅｆ１９结果一致ＭＬＣ，ＰＤＴＣ明显抑制了ＬＰＳ上调的ＭＬＣＫ蛋白表达，并抑制了ｐＬＰＳ组相比ＰＤＴＣ存在与否－，ＧＬＰ２均降低ＬＣＫ蛋白的表的磷酸化；与，如论了Ｍ＾＆ｋ１９ＭＬＣＬＰＳ应激条件Ｐ－达量和ｐ的磷酸化水平。以上研宄结果表明，下，ＧＬ２－ｋＢ途径的活化下调ＭＬＣＫ基因和蛋白的表达能通过抑制ＮＦ，抑制ＭＬＣ的过磷酸＿－ｋＢ信号途径关键信号分子很ＧＬＰ２ＭＬＣＫ表达的上游靶点化。；ＮＦ可能是调节Ａ３－，§２－＿Ｌ｜ＵＪ－１１Ｔｆｃ士〇．．Ｕ—ｉ＂／ｙｙＬＰＳ—＋＋＋＋．ＢＧＬＰ－２——＋—ＰＤＴＣ———＋＋ＭＬＣＫ－嫌＃參德２會１１ｋＤｒｌ８／Ｓｅｒｌ９＿Ｔｈｉｎｉｒ＾＼＇修？ｋＤ－＿？卜？ｉ１９ＭＬＣｍｉｆｉｐｒｒ〈、（、Ｉ、）Ｉ－＝图３８？卩丁（：和０１＾２对＼１１＾〇＜１１１１＾八和蛋白表达以及卩＼４［（：磷酸化的影响（重复数！１３）＊Ｆ－ＭＬＣ＜ｉｇｕｒｅ３８ＴｈｅｅｆｅｃｔｏｆＰＤＴＣａｎｄＧＬＰ２ｏｎＭＬＣＫｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎ．：Ｐｐｐｙ０ｌｔ．０５ｖｓ．ＬＰＳ．Ｖａｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｈｒｅｅｒｅｐｌｉｃａｅｓ．３．２ＲＯＣＫ／ＭＬＣＰ／ｐＭＬＣ信号途径除了ＭＬＣＫ磷酸化ＭＬＣ通过调节ＭＬＣ的磷酸化水平影响细胞单层的通透性外，ＭＬＣＰ作为催化磷酸化型ＭＬＣ向非磷酸化型转变的酶，也参与调节ＭＬＣ的磷酸化状态，而ＭＬＣＰ，在ＭＬＣ磷酸化的调控中具有重要作用活性又受ＲＯＣＫ的负性调－控。因此，本试验考察了ＧＬＰ２是否作用于ＭＬＣＰ酶活影响ｐＭＬＣ的去磷酸化水平。９９ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三３．２．１ＭＬＣＰ的磷酸化水平及活性变化ＭＹＰＴ，其６９６位的Ｔｈｒ残基磷酸化后引起ＭＬＣＰ失活，１为ＭＬＣＰ的结合亚基－２与ＲＯＣＫ／ＭＬＣＰ抑制剂Ｙ２７６３２和ＣａＡ对ＬＰＳ应因此，本试验考察了ＧＬＰｌｙｃｕｌｉｎ－ＭＬＣＰ的磷酸化和酶Ｊ２，结果见图３９激状态下ＩＰＥＣ细胞活的影响。如图３９Ａ所示，由ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ免疫印迹图可以看出，与对照组相比，ＬＰＳ应激上调了ＭＬＣＰ的亚基Ｔ＿６Ｔ＿６ＹＰＴＰＳ组ＬＰ－２ｐＭｌ的磷酸化水平；比较Ｌ，Ｇ组ｐＭＹＰＴｌ的憐酸化水平有ＬＰ－ｃ－所下降而当同时添加Ｇ２＋ＭＬＣＰ的特异性抑制剂ＣａｌｙｕｌｉｎＡ时，ＧＬＰ２的作用；ｍ６９６被取消，ｐＭＹＰＴｌ的磷酸化水平与ＬＰＳ组并无变化；由于ＲＯＣＫ激酶可磷酸化ｔ＿６ＭＹＰＴ１使ＭＬＣＰ失活，因此本试验以ＲＯＣＫ的抑制剂Ｙ２７６３２作为ＭＬＣＰ的激Ｔｈｒｔ９６ＧＬＰ－＋Ｙ２７６３２，ＭＹＰＴｌ动剂，结果发现，同时添加２ｐ的磷酸化水平较ＬＰＳ组明显下调一。进步检测各处理对应的ＭＬＣＰ酶活的变化。如图３９Ｂ所示，伴随ＬＰＳ组Ｔ＿６ＭＹＰＴｌ磷酸化水平的升高，ＭＬＣＰ酶活较对照组出现了显著下降（Ｐ＜０．０５）；ｐＴｈｆ６％ＬＰＳ组－ＭＬＣＰ的酶＜，ＧＬＰ２＋ＬＰＳ组在下调ｐＭＹＰＴ（与相比ｌ的同时提高了活Ｐ－＋ＬＰＳ－＜０．０５）ＬＰ２＋ＣａｌｃｕｌｉｎＡ组ＭＬＣＰ酶２＋ＬＰＳ组（＿Ｐ；Ｇｙ活显著低于ＬＰＳ组和ＧＬＰ－Ｙ２７组＜－０．０５）ＧＬＰ２＋６３２＋ＬＰＳ组ＭＬＣＰ酶（Ｐ０．０５），与ＧＬＰ２＋ＬＰＳ；活显著高于ＬＰＳ组差异不显著（户＞０。ＬＰ－２可部分抑制ＬＰＳ刺激ＬＣＰ．０５）以上结果提示Ｇ的Ｍ调节？９６亚基ＭＹＰＴｌ的磷酸化，缓解ＬＰＳ导致的ＭＬＣＰ酶活的降低。３．２．２ＭＬＣ的磷酸化ｐ一为了进步确定ＧＬＰ－２是否经由ＲＯＣＫ／ＭＬＣＰ旁路对ＭＬＣ的磷酸化过程ｈ８／Ｓ一ＴＨＣＴ１９进行调节，本试验进步对ＬＰＳ应激状态下ｐＭＬＣ的磷酸化水平进行了ＴｈＨ８／ＳＣＴｌ９。如图所示－２抑制ＰＳ引测定，ＧＬＰ的磷，结果见图４０了Ｌ起的ｐＭＬＣＴｈＨ８／ＳＭｌ９Ｐ－２下调ｐＭＬＣ的磷酸化的作用效果酸化；；ＭＬＣＰ抑制剂部分取消了ＧＬＲＯＣＫ－２的作用没有明显影响然而，同时添加抑制剂对ＧＬＰ。结合ＧＬＰ－２对ＭＬＣＰ结合亚基磷酸化水平及ＭＬＣＰ酶活的影响，结果表明ＧＬＰ－２通过ＲＯＣＫ／ＭＬＣ的磷酸化水平ＭＬＣＰ依赖的途径部分下调了ｐ，而这将有利于ＧＬＰ－２对ＬＰＳ应激条件下ＴＪ结构稳定及细胞单层通透性的调节。１００ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三＼ＬＰＳ—＋＋＋＋——ＧＬＰ－２＋＋＋———＋Ｃａ一ｌｙｃｕｌｉｎＡＹ２７６３２————＋Ｔｈｒ６９６ＭＹＰＴｉ－Ｐ１１５ｋＤ＿＾以爲輪為＿和ＧＡＰＤＨ－痛＿＾鋼；，？ｋＤ３６ＮＳＤ２００－Ｉ＃＇１５°Ｉ卜．＾：ｌ｜ＩＩＩ。／次Ｓ夕次。，／Ｖ３９－－＝图ＲＯＣＫ／ＭＬＣＰ抑制剂和ＧＬＰ２对ＬＰＳ应激的ＩＰＥＣＪ２细胞ＭＬＣＰ磷酸化及酶活的影响（重复数ｎ３）－Ｆｉｕｒｅ３９ＴｈｅｔｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆＲＯＣＫ／ＭＬＣＰａｎｄＧＬＰ２ｏｎＭＬＣＰｈｏｓｈｏｌａｔｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖｉｔｉｎｅｆｆｅｃｆｇｐｐ＾ｙ＊－＜－＞ｌｌｌｌｂＬＰＳ．：Ｐ０．０５ｖ．ＬＰＳ＃：Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＧＬＰ２＋ＬＰＳＮＳ：Ｐ０．０５．ＶａｌｕｅｓａｒｅＩＰＥＣＪ２ｃｅｃｈａｅｎｅｄｙｓｇ；；ｍｅａｎｓｏｆｔｈｒｅｅｒｅｌｉｃａｔｅｓ．ｐｌｐｓ—＋＋＋＋ＧＬＰ－２一一＋＋＋———＋Ｃａｃａｎ—ｌｙｌｉＡＹ２７６３２———＿＋Ｔｈｒ，８／Ｓｅｒ１９＾ｍｍｍ１９ｋＤＭＬＣ－ｒｎｐ？ＧＡＰＤＨ－４ＨＨＨ＾＿ＨＨＩ？ＨＮ？３６ｋＤＫ？ＧＬ－２Ｓ－图４０ＲＯＣＫ／ＭＬＣＰ抑制剂和Ｐ对ＬＰ应激的ＩＰＥＣＪ２细胞ｐＭＬＣ磷酸化的影响－－Ｆｉｉｂｉｆ／ＭＬＣＰａｎｄＧ２ｏｎＭＬＣｈｏｈｏｌｉｉＩｌｉｇｕｒｅ４０ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｎｈｔｏｒｏＲＯＣＫＬＰｓｒａｔｏｎｎＰＥＣＪ２ｃｅｌｐｐｐｙｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｂｙＬＰＳ．３．３ＥＲＫｌ／２信号途径一／前人研宄发现，ＥＲＫｌ２信号途径参与对通透性的调节，但是作用效果存在不－致的结果，那么２的调节，在ＬＰＳ应激的细胞上ＥＲＫ１／２信号途径是否参与了ＧＬＰ？－ＫＢＭＬＣＫＭＬＣ和ＲＯＣＫＭＬＣＰ上游信号途径介作用呢它是否作为ＮＦ／／ｐ／／ｐＭＬＣ的导了ＧＬＰ－２的作用呢？１０１ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三３－２对ＥＲＫｌ／２憐酸化的影响．３．１ＥＲＫ１／２抑制剂Ｕ０１２６和ＧＬＰＰ（２Ｔ２Ｃ＞４ｍ２Ｊｎ＞－添加ＥＲＫ１／２抑制剂Ｕ０１２６和ＧＬＰ２对ｐＥＲＫｌ／２的磷酸化的影响结果Ｔ＿２／Ｔ＿ｙ见图４１。如图所示，与对照组相比，ＬＰＳ应激引起了ＥＲＫ１／２的快速磷酸Ｔ＿Ｗ２（Ｍ－２处理抑制了ＬＰＳ引起的ＥＲＫ化；ＧＬＰ１／２快速磷酸化；此外，单独添加Ｔ＿２；Ｔｔ２Ｃ）４＞－２Ｕ０６０１２６＋ＧＬＰ２均抑制了ＬＰＳ对ＥＲＫ１／磷酸化的作用。１２和同时添加ＵＰ－２ＬＰＳ应激激活的ＥＲＫ１／２信号途径。由此表明，ＧＬ能抑制ＬＰＳ—＋＋＋＋—ＧＬＰ－２一一＋＋——Ｕ０—＋＋１２６Ｔｈｒｒ２〇２ｒｒ２°４＞ＥＲＫ２－‘：：：ｌ／ｐＵＫＥＲＫ１／２－＾４４ｋＤ赠妙—鑛４７ｇａｐｄｈ－３６ｋＤ０２６和ＧＬＰ－２对ＥＲＫ图４１／２磷酸化的影响１Ｕ１－ｒｅｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆ．ＦＵ０１２６ａｎｄＧＬＰ２ｏｎＥＲＸ１／２ｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｉｇｕ４１Ｔｐｐｙ３－２对ＴＪ蛋白表达的影响．３．２ＥＲＫｌ／２抑制剂Ｕ０１２６和ＧＬＰ－？ＥＲＫ１／２信号途径是否参与ＧＬＰ２对细胞ＴＪ［蛋白表达的调节呢本试验采用－１２ＴＪ［ｔｅｒｎｔ６２对蛋白表达的影响，结果ｗｅｓｂｌｏ技术考察了ＥＲＫ１／２抑制剂Ｕ０和ＧＬＰＺ０－－４２，ＬＰＳ处理下调了１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的表达，ＧＬＰ２处理恢复见图。如图所示－Ｕ１１ｏｃｃｕｄｎ蛋白的表达０２６了ＬＰＳ降低的Ｚ０和ｌｉ；此外，单独添加对ＬＰＳ降低的二Ｚ０－１ｏｃｃｌｕｄｉｎＴＪ蛋白表达量没有作用效果；者同时添加，和蛋白表达量较对照组也出现明显增加；以上结果表明，ＬＰＳ处理在ＥＲＫ１／２信号途径激活的情况下降低了ＴＪ蛋白的表达量；但仅抑制ＥＲＫ１／２信号途径并不能缓解ＬＰＳ降低的ＴＪ蛋白表达，－－１无论Ｕ０１２６存在与否ＬＰ２均能实现在ＬＰＳ应激条件下对Ｚ０和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白表，ＧＬＰ－／Ｊ达的上调：Ｇ２独立于ＥＲＫ１２信号途径实现对ＬＰＳ应激状态下Ｔ蛋，结果提示白表达的调节。ＬＰＳ一＋＋＋＋—一—＋ＧＬＰ－２＋Ｕ０———＋＋１２６ＺＯ－－ｍｒｎｍｍ２３０ｋＤ１ｉｃｃ－咖＿§ｍｍｍｍ５９ｋＤＯｌｕｄｎｉｇａｐｄｈ－ｍ？ｍｍｍｍｍｍｓｍｍｒｎｍ？ｅ？ｅＳ３６ｋ〇０２６和ＧＬＰ－２对ＺＯ－图４２ｌ和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白表达的影响Ｕ１－－Ｆ１ｌｉｎｒｏｔｅｉｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎ．ｉｕｒｅ４２ＴｈｅｅｆｅｃｔｏｆＵ０１２６ａｎｄＧＬＰ２ｏｎＺＯａｎｄｏｃｃｕｄｇｐｐ１０２ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三３．３．３ＥＲＫ１／２信号途径对ＭＬＣＫ表达及ｐＭＬＣ磷酸化水平的影响ＥＲＫ－１／２信号途径是否参与ＧＬＰ２对细胞ＴＪ蛋白结构稳定的调节呢？本试验采－用ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术考察了ＥＲＫ１／２抑制剂Ｕ０２６ＬＰ２对ＭＬＣＫ蛋白表达以及１和ＧＭＬＣ憐酸化的影响，结果见图４３。如图所示，ＬＰＳ应激上调的ＭＬＣＫ蛋白表达的作用被ＧＬＰ－２所取消１２６，而单独添加Ｕ０也取消了ＬＰＳ导致的ＭＬＣＫ蛋白表达量的Ｐ－－提高２和Ｕ０１２６，并不影响ＧＬＰ２对ＭＬＣＫ表达的；同时添加ＧＬ抑制作用。结果ＰＳＥＲＫ１ＬＰ－ＥＲＫ１表明，Ｌ能激活／２信号途径上调ＭＬＣＫ的表达，Ｇ２／２；然而通过抑制信号途径的激活下调ＭＬＣＫ的蛋白表达。？８／ＳｅＭ９４３考察其下游靶蛋白ＭＬＣ的磷酸化水平，结果如图所示，ｐＭＬＣ磷酸一—＾＾１９－化的结果与ＭＬＣＫ蛋白表达结果致，ＧＬＰ２下调了由ＬＰＳ引起的ｐＭＬＣ２６ＬＰ－２＋Ｕ０快速磷酸化，并且单独添加Ｕ０１以及同时添加Ｇ１２６均明显抑制了ＬＰＳ刺ＴｈＭ８／ＳｅＨ９激的ｐＭＬＣ过磷酸化；由此可知，ＬＰＳ能激活ＥＲＫ１／２信号途径上调ＭＬＣＫＬＰ－２通过抑制ＥＲＫ的表达引起ＭＬＣ过磷酸化１／２信号途径ＬＰＳ引起的ＭＬＣ；Ｇ取消过磷酸化，使其保持在正常水平。ＬＰＳ一＋＋＋＋ＧＬＰ－２——＋—Ｕ０——一＋＋１２６ｍ－＿＿＿？ｌｃｋ２１１ｋＤＴｈｒｌ８／Ｓｔｒ，９ＭＬＣ－ｐ１９ｋＤｇａｐｄｈ－ｔｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍ３６ｋＤ４３Ｕ０－图１２６和ＧＬＰ２对ＭＬＣＫ表达和ｐＭＬＣ磷酸化的影响－ｉｅｆｅｃｔｏｆＵ０２６ａｎｄＧＬＰ２ｏｎＭＬＣＫｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＭＬＣｈｏｓｈｏｒｌａｉｏｎ．Ｆｇｕｒｅ４３Ｔｈｅ１ｐｐｐｐｙｔ３．３．４ＥＲＫｌ／２信号途径对ＭＬＣＰ酶活的影响－？那么，抑制ＥＲＫ１／２信号途径是否参与ＧＬＰ２对ＭＬＣＰ的调节呢结果如图４４？９６－所示亚基的磷酸化，，ＧＬＰ２取消了ＬＰＳ对ＭＹＰＴｌ并显著提高了ＬＰＳ钝化的Ｔｈ＿．０５而ＭＬＣＰ酶活（尸＜０），Ｕ０１２６＋ＬＰＳ组中ＭＹＰＴｌ；然的磷酸化水平与ＬＰＳ？＞组相比没有明显变化，ＭＬＣＰ酶活与ＬＰＳ组差异不显著（／０．０５）与ＬＰＳ组和单；ｔ＿６－０，１１独添加Ｕ１２６相比同时添加Ｕ０２６＋ＧＬＰ２组ＭＹＰＴ的磷酸化水平出现明显＾下降，相应的，ＭＬＣＰ酶活显著高于ＬＰＳ组和Ｕ０１２６＋ＬＰＳ组（／〈Ｏ．ＯＳ）。以上结果Ｔｈｆ６％表明－立于ＥＲＫ１／ＹＰＴｌ，ＧＬＰ２独２信号途径提高Ｍ磷酸化介导的ＭＬＣＰ酶活。１０３ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三ＡＬｐｓ—＋＋＋＋—？—＋—ＧＬＰ－２Ｕ０———＋＋１２６Ｔ９ｈｒ６６＿ＰＭＹＰＴｉ１１５ｋＤＧＡＰＤＨ－、３６ｋＤ＿Ｍｌ截銳鱗－如读｜維林Ｂ２００－１＾＇＇：＾ｉｉＬ＾—＿ｍ〇Ｈ，ｆＬ／夕ｆｆｆ。。＝４４Ｕ０－图１２６和ＧＬＰ２对ＭＬＣＰ酶活的影响（重复数ｎ３）＊Ｆ－＜ｉｕｒｅ４４ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＵ０２６ａｎｄＧＬＰ２ｏｎＭＬＣＰａｃｔｉｖｉｔ．：Ｐ０．０５ｖｓ．ＬＰＳｎｓ：Ｐ＞０．０５ｖｓ．ｇｙ；ＬＰＳＵ＼Ｐ＜０．０５ｖｓ．Ｕ０１２６＋ＬＰＳ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｈｒｅｅｒｅｌｉｃａｔｅｓ．；ｐ３．３．５ＥＲＫｌ／２信号途径对其它信号途径关键激酶或蛋白的影响ＮＦ－ｋＢ上调ＭＬＣＫ蛋白的表达从前面的研究结果可知，那么，，ＬＰＳ通过激活＇ＲＫ－－ＭＬＣ被抑制的Ｅ１／２信号途径是否作为ＧＬＰ２调控ＮＦＫＢ／ＭＬＣＫ／ｐ信号的的上游？ｔｔ靶点参与介导呢因此，本试验针对性地采用ｗｅｓｅｒｎｂｌｏ技术考察了ＥＲＫ１／２抑制－剂Ｕ０２６－ｋＢ信号途径关键激酶及蛋白表达的影响４。１和ＧＬＰ２对ＮＦ，结果见图５ｍ２３Ｓｗ３２／３６ＬＰ－ＬＰＳ引起的ＫａＩｋＢ如图所示，Ｇ２处理取消了ｐＩＫ和Ｐ的快速磷酸化，Ｐ－２Ｕ－－Ｕ０１２６具有与ＧＬ相似的作用效果０１２６＋ＧＬＰ２也不能取消ＧＬＰ２，同时添加的Ｓ－ＫＢＭＬＣ信号途作用由此提示，ＬＰ可能通过ＥＲＫ１／２信号途径激活ＮＦ／ＭＬＣＫ／；ｐＬＰ－ＲＫ－径２则１／２信号途径抑制ＮＦｋＢ信号途径的激活，ＥＲＫ１／２，而Ｇ是通过抑制Ｅ信号途径作为ＮＦ－ｋＢ的上游发挥作用。本试验还对处理４５ｍｉｎ后ＨＳＰ７０蛋白的表达进行了检测，结果如图４５所不：ＬＰＳ５ｍｎ－２的处理４ｉ后，ＨＳＰ７０的蛋白表达有所降低ＳＰ７０的表；ＧＬＰ处理提高了ＨＬＰＳＬＰ－Ｕ单独添加Ｕ０１２６对降低的ＨＳＰ７０作用效果不明显２０１２６，达，同时添加Ｇ和；－ＨＳＰ７０蛋白表达量有所提高，以上结果提示在ＬＰＳ应激状态下，ＧＬＰ２独立于ＥＲＫ１／２信号途径刺激ＨＳＰ７０蛋白的表达。１０４ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三ＬＰＳ—＋＋＋＋——＋—＋ＧＬＰ－２Ｕ０———＋＋１２６ＨＳＰ７０－７０ｋＤ？ｉＩＣＫ＾ｏｔ－８５ｋＤ＞＾ＮｐＵＭＭｉｉｔｉｆｌｌｌＫ＇■ａｆ．ａ．ｐＩＨｎ＾１ｉｆｒｌｉｌｏｔｊＭｆｃＯｆ１ｗｙＨ１ｌｘｋＩＪＳｃｒ３２／３６－＾轉，ｐｌＫＢ＾ｍｍ？？—３９ｒｄＧＡＰＤＨ－３６ｋｌ）４５Ｕ０－图１２６和ＧＬＰ２对其它信号途径的关键蛋白表达或磷酸化的影响Ｆ－ｘｉｕｒｅ４５ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＵ０１２６ａｎｄＧＬＰ２ｏｎｅｒｅｓｓｉｏｎｏｒｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｋｅｙｒｇｐｐｐｙｔａｅｔｇｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｏｔｈｅｒｓｉｇｎａｌｉｎｇａｔｈｗａｙ．ｐ３．４ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径一－－－ＧＬＰ２Ｒ属于Ｇ蛋白受体超家族成员之么ＩＰＥＣＪ２２，那，在细胞上，ＧＬＰ作为配体与其结合后能否激活ｃＡＭＰ／ＰＫＡ经典信号途径，缓解ＬＰＳ应激增强的细胞间？本试验针对此问题开展了以下研宄通透性呢。３Ｉ．４．１ＰＫＡ特异性激动剂Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ和抑芾Ｊ剂Ｈ８９对ｃＡＭＰ的水平和ＰＫＡ的活性的影响－ＧＬＰ２处理对ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径的影响见图４６。如图４６Ａ所示，ＬＰＳ应激ＡＭＰ的ＰＳ组相比－对ｃ水平没有显著性作用，ＧＬＰ２＋ＬＰＳ组胞内ｃＡＭＰ水平显；与ＬＡＭＰＦ＋ＧＬＰ－著提高ｌｉｎ显ｃ，ｏｒｓｋｏｌｉｎ２；单独添加Ｆｏｒｓｋｏ著提高了的产生水平同时添加－２＋ＬＰＳ组显８９＋ＬＰＳｃＡＭＰ后ｃＡＭＰ水平较ＬＰＳ组和ＧＬＰ著提高，；Ｈ下调了水平－２＋Ｈ８９＋ＬＰＳ组的ｃＡＭＰ水平与ＬＰＳ组差异不显著，较Ｈ８９＋ＬＰＳ组显著提高ＧＬＰ。Ｐ－２ｃＡｃＡＭ以上研究结果表明，ＧＬ能刺激ＭＰ的产生，而ＬＰＳ的作用独立于Ｐ的产生。４６Ｂ所ＰＳ应激对ＰＫＡ的活化没有显著作用效果ＧＬＰ－２＋如图示，ＬＬＰＳ组ＰＫＡ；ＫＡ＋－ｋｏ，Ｆｏ活性显著提高ｌｉｎ显ｒｓｋｏｌｉｎＧＬＰ２；单独添加Ｆｏｒｓ著提高了Ｐ的活性同时添加ＰＫＡＬＰＳ组和ＧＬＰ－２＋ＬＰＳ组显著提高，后活性较；Ｈ８９＋ＬＰＳ显著下调了ＰＫＡ活性－组显著提高Ｈ８９＋ＧＬＰ２＋ＬＰＳ组ＰＫＡ活性与ＬＰＳ组差异不显著，较Ｈ８９＋ＬＰＳ。以上ＬＰ－２ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路结果表明，Ｇ在ＬＰＳ应激条件下激活了。１０５ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三Ｊ＆Ｂ＆—＾二＾１Ｓ２５」ｌ１＾丁２０－＊｜；：ｉｉｉ？ｉ８ｉａ１：１ｉＭ。／＾夕夕夕夕ｆ。／夕夕次夕夕次°°ＺＺｗｗ＝４６－图ＧＬＰ２对ｃＡＭＰ水平和ＰＫＡ活性的影响（重复数ｎ３）＊Ｆｉｕｒｅ４６ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＧＬＰ－２ｏｎｔｈｅｃＡＭＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＰＫＡａｃｔｉｖｉｔｙ．：Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＬＰＳｎｓ：ｇ；ｐ－－Ｐ＞．＋＋ＬＰＳｖ．０．０５ｖｓ．ＬＰＳ＃：Ｐ＜０．０５Ｆｏｒｓ＋ＬＰＳｖｓＦｏｒｓＧＬＰ２＋ＬＰＳａｎｄＨ８９ｓＧＬＰ２＋Ｈ８９＋ＬＰＳ，；，；－Ｓｃ：Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＧＬＰ２＋ＬＰＳ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｈｒｅｅｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．３．４．２ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径对细胞通透性的影响为了确定ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径的活化对于ＬＰＳ引起的细胞间通透性的增加有何影响，本试验测定了ＬＰＳ处理２４ｈ后ＨＲＰ在２ｈ内的漏过率，结果见图４７。如图所示，与对照组相比，ＬＰＳ显著提高了ＨＲＰ的漏过率（Ｐ＜０．０５）；与ＬＰＳ组相比，－２＋ＬＰＳＬＰ－＜ＧＬＰ组、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ＋ＬＰＳ组、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ＋Ｇ２＋ＬＰＳ组ＨＲＰ均显著降低（Ｐ０．０５）；－＞然而，Ｈ８９＋ＬＰＳ组和Ｈ８９＋ＧＬＰ２＋ＬＰＳ组的ＨＲＰ漏过率与ＬＰＳ组差异不显著（Ｐ－２＋ｒｓ－＞０．０５）ＧＬＰＬＰＳ组相比，Ｆｏｋｏｌｉｎ＋ＧＬＰ２＋ＬＰＳ组与之差异（尸０．０５），；与不显著－２＋ＬＰＳ组中Ｈ８９的添加取消了ＧＬＰ－２ＨＲＰ而Ｈ８９＋ＧＬＰ的作用效果，显著提高了的＜－漏过率（Ｐ０．０５）以上结果表明ＧＬＰ２通过激活Ｇ蛋白偶联的ｃＡＭＰ／ＰＫＡ经典信；号途径缓解ＬＰＳ引起的细胞间通透性的增加。＃１５００Ｉ！Ｔ｜ｉ．＿．１０００！１圓ｎｓ４７Ｐ－２ＰＳ２４ｈＰＥＣ－Ｊ２图ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径介导ＧＬ对Ｌ处理后Ｉ细胞单层通透性的影响＝ｎ３（重复数）１０６ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三ｍｅｄ－－Ｆｉｇｕｒｅ４７ｃＡＭＰ／ＰＫＡａｔｈｗａｉａｔｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＧＬＰ２ｏｎｔｈｅｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｏｆＩＰＥＣＪ２ｃｅｌｌｐｙｐｙ＊ｍｏｎｏ＜－ｌａｙｅｒｓ２４ｈａｆｔｅｒＬＰＳｃｈａｌｌｅｎｇｅ．：Ｐ０．０５ｖｓ．ＬＰＳ＃：Ｐ＜０．０５Ｈ８９＋ＧＬＰ２＋ＬＰＳ．ｖｓ．；，ＧＬＰ－２＋ＬＰＳｎｓ：Ｐ＞０．０５．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆｔｈｒｅｅｒｅｌｉｃａｔｅｓ．；ｐ３．４．３ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径对ＴＪ蛋白表达的影响一一一Ｔ进步分析影响细胞间通透性的关键因素Ｊ蛋白的表达，３．３研究结果－２对ＴＪ蛋白表达的调节显示ＥＲＫ，那么ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信１／２信号通路独立于ＧＬＰ？８－如图４所示，与对照组相比号途径的作用又如何呢，ＬＰＳ明显下调了Ｚ０１ＬＰＳ组相比ＧＬＰ－２＋ＬＰＳｃｃ组、Ｆｏｒｓｋｏｌ＋ＬＰＳ组、和ｏｌｕｄｉｎ蛋白的表达，ｉｎ；与ｒｓｋｏ－Ｈ＋ＧＬＰ－Ｆｏｌｉｎ＋ＧＬＰ２＋ＬＰＳ组ＴＪ蛋白的表达均有所提高，８９２；然而或Ｈ８９－上研究表明１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白表达没有明显影响，处理对ＬＰＳ下调的ＺＯ；以－ｃＡＭＰ／ＰＫＡＧＬＰ２通过依赖的信号途径刺激ＬＰＳ降低的ＴＪ蛋白的表达，维持肠上皮屏障的功能。ＬＰＳ—＋＋＋＋＋＋——ＧＬＰ－２一一＋＋＋———Ｆｏｒｓｋｏ——＋＋ｌｉｎ———Ｈ８９——＋＋＃細鳴—―＿？ｚｏ丨謂ｋＤＯｃｃ－＾ＲｍｉｐｐｉｗｌｕｄｉｎＳ９ｋＯ广▲ｎｒ１１＊％＊＊ｗｉ＃１１＾＾４８－图ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径参与介导ＧＬＰ２对ＴＪ蛋白表达的调节－－Ｆｍｅｄｉｈｅｆｆｉｆｉｇｕｒｅ４８ｃＡＭＰ／ＰＫＡａｔｈｗａａｔｅｄｔｅｅｃｔｏｆＧＬＰ２ｏｎｔｈｅｅｘｒｅｓｓｏｎｏＺＯ１ａｎｄｏｃｃｌｕｄｉｎｐｙｐ３．４．４ＰＫＡ信号途径对ＭＬＣＫ表达及ＭＬＣ磷酸化水平的影响一进一影响Ｔ步分析另Ｊ结构稳定的蛋白ＭＬＣＫ的表达及其下游ＭＬＣ的磷酸化水平，结果见图４９。如图所示，与对照组相比，ＬＰＳ明显上调了ＭＬＣＫ的蛋白表达；－２＋ＬＰＳ＋ＬＰＳ＋ＧＬＰ－ＭＬＣＫ与ＬＰＳ组相比，ＧＬＰ组、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ组、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ２＋ＬＰＳ组ＴｈＨ８／Ｓｅｄ９－蛋白的表达以及ｐＭＬＣ的磷酸化均降至正常水平然而，Ｈ８９组和Ｈ８９＋ＧＬＰ２；ＴｈＨ８／ＳｅＭ９处理对ＬＰＳ提高的ＭＬＣＫ蛋白表达和下游ｐＭＬＣ的磷酸化没有明显影响。以上研宄表明－ＰＫＡ，ＧＬＰ２通过ｃＡＭ／Ｐ依赖的信号途径抑制ＬＰＳ刺激的ＭＬＣＫ的蛋白ＴｈＨ８／ＳｅＨ９表达和ＰＭＬＣ的过磷酸化，维持ＴＪ蛋白在细胞膜的正常结构分布，从而维持肠上皮屏障的功能。１０７ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三ＬＰＳ一＋＋十＋＋＋—ＧＬＰ－２＋＋—＋———＋＋—ＦｏｒｓｋｏＨｎ——Ｈ８９——￣－－ＭＬＣＫ？鑛嶋＾ｍｍｍ＿ｉＭＰｍｍｍｒｎｍ２１１ｋＤＴｈｒ８，Ｓｅ１９ｌｒ麟＿＿祕＇＇德鲁ｍｍｍｍｍｍｍｍＭＬＣ－９ｐ｜ａ〇ｉ广ｐｕ－＼ｊＡ＊Ｌ／ｊｌＩ４９－ＭＬＣＫ表达和图ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径参与介导ＧＬＰ２对ＭＬＣ磷酸化的调节ｐｍｅｄ－Ｆｉｕｒｅ４９ｃＡＭＰ／ＰＫＡａｔｈｗａｙｉａｔｅｄｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆＬＰ２ＭＬＣＫｒｅｓｓｏｎａＭＬＣｇＧｏｎｅｘｉｎｄｐｐｐｈｏｓｈｏｒｔｏｎｐｐｙｌａｉ３．４．５ＰＫＡ信号途径对ＭＬＣＰ酶活的影响－３，本试验．３研究结果显示ＥＲＫ１／２信号通路并不参与ＬＰＳ应激状态下ＧＬＰ２对ｃＡＭＰ－ＭＬＣＰ细胞ＭＬＣＰ酶活的调节，那么／ＰＫＡ信号途径是否介导ＧＬＰ２对酶活的调节，检测结果见图５０。如图Ａ所示，与对照组相比，ＬＰＳ明显上调了ＭＬＣＰ蛋白ｍ６％＜亚基的磷酸化水平，ＭＬＣＰ酶活显著降低（Ｐ０ＭＹＰＴｌ．０５）ＬＰＳ组ｐ；与相比，ｍ６９６－－ＭＹＰＴＧＬＰ２＋ＬＰＳ组、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ＋ＬＰＳ组、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ＋ＧＬＰ２＋ＬＰＳ组ｌ的磷酸化ｐ水平出现了明显地下降，ＭＬＣＰ酶活较ＬＰＳ组显著增高（尸＜０．０５）；然而，Ｈ８９＋ＬＰＳＴｈｆ６９６－ＭＹＰＴ组和Ｈ８９＋ＧＬＰ２＋ＬＰＳ组ｐｌ的磷酸化水平与ＬＰＳ组相当，并且ＭＬＣＰ的＞０－－酶活也与ＬＰＳ组差异不显著（尸．０５）ＧＬＰ２＋ＬＰＳ组相比８９＋；与，ＨＧＬＰ２＋ＬＰＳ＜０。－组ＭＬＣＰ酶活显著降低（尸．０５）以上研究表明，ＧＬＰ２通过ｃＡＭＰ／ＰＫＡ依赖的ｔ１ｗ６％信号途径抑制ＬＰＳ对ＭＹＰＴ１亚基的快速磷酸化，维持了ＭＬＣＰ酶的正常活性，这也将有利于维持ＴＪ蛋白的结构稳定。Ａ＾ＰＳ—＋＋＋＋＋＋一一十一＋—ＧＬＰ－２＋Ｆｏｒｓｋｏ—一一＋＋一一ｌｉｎ＇—￣￣￣Ｈ８９ＩＩＴｈｒ６９６，广－ｍｍＭＹＰＴｉ１５ｋＤｐｌｍ＇、．＇猶．＇ｒ＇－－－．ｉｉ１ｔ广４Ｐｒ＾Ｈｒｒｉｒｉｔ，ＭｉｉｒｎｉＶｉｉｒｎｒｉｍｆｒ＾ｉ｜｜＾｜ｉｐ｜ＲＲ｜ＰＲｎＰＩｉｉＲｉｌＰ３６ｋＯ＃２００＊Ｂｉ＊．＿ｆｉｔｌｌｌ＝图ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径参与介导ＧＬＰ－２对ＭＬＣＰ磷酸化及其酶活的调节）５０（重复数ｎ３１０８ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三＊－Ｆｉｇｕｒｅ５０ｃＡＭＰ／ＰＫＡａｔｈｗａｍｅｄｉａｔｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＧＬＰ２ｏｎＭＬＣＰｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎａｎｄｉｔｓａｃｔｉｖｉｔ．：Ｐｐｙｐｐｙｙ＜＜＋－－＋０．＃．ＧＬＰ．ｓ．．ａｌｕｅ．０５ｖｓ．ＬＰＳｎｓ：Ｐ＞０．０５ｖｓＬＰＳ：Ｐ００５Ｈ８９２＋ＬＰＳｖＧＬＰ２ＬＰＳＶｓａｒｅｍｅａｎｓｏｆ，；；ｔｈｒｅｅｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．３．４．６ＰＫＡ信号途径对其它信号途径关键激酶或蛋白的影响本试验３．３研宂结果显示：ＬＰＳ应激条件下，被抑制的ＥＲＫ１／２信号途径作为上ＬＰ－２－ＭＬＣ途径的调节作用游靶点介导Ｇ对ＮＦＫＢ／ＭＬＣＫ／ｐ，那么，Ｇ蛋白偶联受体激活的ｃＡＭＰ２和ＮＦ－ｋＢ信号／ＰＫＡ信号途径是否作为信号传递的上游影响了ＥＲＫ１／－途径的活化５１。，ＧＬＰ２处理部分取消了ＬＰＳ引起的，结果见图如图所示１１＾２＃２ＴＭ３Ｓｃｔ３２／３６ｐＥＲＫｌＯ＇ｐＩＫＫａ和ｐＩｋＢ的快速磷酸化，单独添加ＰＫＡ激动剂Ｆｏｒｓｋｏ－Ａｌｉｎ或同时添加Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ＋ＧＬＰ２取得了相似的结果；然而，单独添加ＰＫ抑ＥＲＫ－制剂Ｈ８９对ＬＰＳ激活的１／２和ＮＦｋＢ信号途径没有明显作用；同时添加１１＾２—２０４Ｔｈｆ２３Ｓｃｔ３２／３６－－ＥＲＫＨ８９＋ＧＬＰ２取消了ＧＬＰ２对ｌ／＾、ＩＩＣＫａＩｋＢｐｐ和ｐ的快速磷酸－化的抑制作用。由此，ＬＰＳ可能通过ＥＲＫ／２ｉｃ／／１信号途径激活ＮＦＢＭＬＣＫｐＭＬＣ信ＬＰ－ＡＭＰ号途径２ｃ／ＰＫＡ信ＬＰＳ，而Ｇ则是通过Ｇ蛋白偶联的号途径介导抑制激活的ＥＲＫｌ／２／ＮＦ－ＫＢ／ＭＬＣＫ／ＭＬＣ信号途径。ｐＨＳＰ７０的蛋白表达量在ＬＰＳ应激４５ｍＧＬＰ－２＋ＬＰＳｉｎ后较对照组明显降低，组、ｓ－ＨＳＰ７０，＋ＬＰＳＦｏｒｓｋｏｌｉｎ＋ＬＰＳ组、Ｆｏｒｋｏｌｉｎ＋ＧＬＰ２＋ＬＰＳ组均明显增加而Ｈ８９组、Ｈ＋ＧＬＰ－２＋ＬＰＳ组ＨＳＰ７０ＬＰＳ组８９蛋白表达较无明显变化，而较对照组低。以上结果＇ＬＰ－ＰＳ应激状态ＨＳＰ提示：Ｇ２以ＰＫＡ依赖的方式促进Ｌ下７０蛋白的表达。ＬＰＳ—＋＋＋＋＋＋＋—＋—＋ＧＬＰ－２——一＋＋——Ｆｏｒｓｋｏ一—ｌｉｎ———Ｈ８９＿—＋＋■一＿一一＿■丨丨＿■１１＊＿＂＿＿？ＨＳＰ７０－一７０ｋＤＴｈｒ２３１ｒｎ１ｍｍｍ８５－ＩＫＫａｋＤｐ－ＩＫ．Ｋａ８５ｋＤＳｅｒ３２／３６ｋ－，狀一一—？ｋｐｌＢ３９ＤＴｈｒ２０２＾ｒ２０４－？￣ＥＲＫ－＞—ｐｌ／２４２ｋＤ－ＥＲＫ１４４ｋＤ／２＾＊＿＿＿＿＿＿ｍ．丨＿？丨＿？４２ｋＤＣＡＰＯＨＪｍｍａｍ３６ｋＤ＾ｉｎｉｉｍｍｕｒｎｍｍｍｍｍｍｒｎ５Ｐ－２图１ｃＡＭＰ／ＰＫＡ介导ＧＬ对其它信号途径的关键蛋白表达或磷酸化的影响－ＦｉｈｅｆｆＧ２ｏｎｘｒｅｓｓｎｈｏｈｏｌｉｆｋｉｇｕｒｅ５１ｃＡＭＰ／ＰＫＡｍｅｄａｔｅｄｔｅｅｃｔｏｆＬＰｅｐｉｏｏｒｓｒａｔｏｎｏｔｈｅｅｔａｒｅｔｐｐｙｙｇｒｏｉｓｅｉｌｉｐｔｅｎｏｆｏｔｈｒｓｇｎａｎｇｐａｔｈｗａｙ．１０９ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三４讨论４－．１ＧＬＰ２调节ＴＪ结构分布的信号途径４．ＭＬＣＫ／ＭＬＣ介导的调节机制．１１ｐ４－．１．１．１ＮＦｋＢ信号途径－通过试验三（二）我们己经确定了ＧＬＰ２部分通过ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ信号实现对肠－上皮细胞间通透性的调节作用，ＧＬＰ２作为胞外信号是如何对ＭＬＣＫＬＣ进行调／ｐＭ节的呢？６３［］ＹｅＭａ－ａ－ＫＢ二聚体与启首先，和（２００８）证实ＴＮＦ引起ＮＦｐ５０／ｐ６５动子下游ＭＬＣＫ转录启动子一ｋＢ结合区域结合，ＭＬＣＫ活化后进，激活步引起肌球蛋白轻链－Ａ－ｌ，细胞骨架收缩导致ＴＪ蛋白结构开放以及ＺＯ１蛋白移位Ｓａｄｉ等（２０１０）ＭＬＣ鱗酸化。６４［］－－－在体外Ｃａｃｏ２肠上皮模型系统发现ＩＬｉＴＪｋＢ，ｐ诱导其通透性的增加也是由ＮＦ旁路依赖的ＭＬＣＫ基因转录的增加所介导的。由此可见，肠道炎症发生发展过程中，ＮＦ－ｋＢ的活化及入核所介导的ＭＬＣＫ转录的增加及活化对肠上皮细胞通透性的增加都。－起到了关键的作用由此，抑制ＮＦｋＢ可能缓解由ＭＬＣ过度磷酸化对ＴＪ的结构重排一ＮＦ－ｋＢ是种重要的核转录因子－ｋＢ影响，其通常在胞浆中与抑制单位Ｉ。形成无活性’一ＮＦ－ｋＢ的活化涉的复合体。因此，及个关键的步骤，便是ＩｋＢ激酶（ＩＫＫ）复合物－ｋＢ抑制单位ＩＫＫＩＫＫ３对ＮＦＩｋＢ的磷酸化；复合物由两种紧密相关的激酶ＩＫＫａ和（１６８［］－ＩｋＢｅｒ，ｋＢ。构成，通过对的关键Ｓ残基进行磷酸化使其降解从而活化ＮＦ本试验－ｋＢ信号旁路中关键蛋白及激酶的表达进行了测定对ＮＦ，结果发现：ＬＰＳ应激引起了－ＩＫＫａ及其下游ｋＢａ的快速磷酸化ＩｋＢ的降解活化了ＮＦｋＢ，胞浆中；通过免疫荧光－染色技术发现ＬＰＳ应激激活了ＮＦ－ｋＢ信号途径６５ＮＦｋＢ的核转位ＮＦ－ｋＢ的，引起Ｐ；ＭＬＣＫ表达量的增加－活化引起了，并最终使ＭＬＣ发生了磷酸化。然，单独添加ＮＦｋＢ而ＴＣ抑制了－信号途径的抑制剂ＰＤＩＫＫａ及ＩｋＢｏｉ的磷酸化，抑制了ＮＦｋＢ的核转位，以及ＬＰＳ引起的ＭＬＣＫ表达量的提高，将ｐＭＬＣ的磷酸化水平维持在正常水平。不管－－－ＮＦｋＢ存在与否ＧＬＰ２均抑制了ＩＫＫａ及ＩｉｃＢａ的磷酸化、ＮＦｋＢ的核转位，以，添加及ＬＰＳ引起的ＭＬＣＫ表达量的提高和ＭＬＣ的磷酸化－２可通过ｐ；以上结果表明ＧＬＰ抑制ＬＰＳ激活的ＮＦ－ｋＢ信号途径实现对ＭＬＣＫ／ＭＬＣ的调节ｐ。１１０ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三４．１．１．２ＥＲＫ１／２信号途径一－－ｋＢ的上游信号进步分析ＧＬＰ２抑制ＮＦ，前人研究发现ＭＥＫＫ１的过表达能提１６８［］高ＩＫＫａ的磷酸化，使ＩｋＢ在Ｓｅｒ３２和Ｓｅｒ３６位发生位点特异性的磷酸化，那么，ＭＥＫＫ－ｋＢ的上游信号呢？ＧＬＰ－２对１的下游靶蛋白ＥＲＫ１／２是否是ＬＰＳ诱导活化ＮＦＥＲＫ１／２的调节又是怎样的？本试验结果发现，ＬＰＳ应激提高了ＥＲＫ１／２的磷酸化水平，１６９ｍ［］［］这与前人研究报道的ＬＰＳ在小鼠巨噬细胞、人类单核细胞以及ＬＰＳ应激的丨７丨一［】Ｃａｃｏ－２细胞系上的结果致－２。本试验中ＧＬＰ能抑制ＬＰＳ激活的ＥＲＫ１／２信号旁路Ｆ－ｋＢ信号途径之间是否存在上。而为了回答ＬＰＳ应激条件下ＥＲＫ１／２信号途径与ＮＮＦ－下游关系的这个问题，ｋＢ，本试验考察添加抑制剂后途径的活化情况结果发现：－－ＧＬＰ２和Ｕ０１２６均能通过抑制ＥＲＫ２ｋＢ途径中关键激酶１／信号途径的激活抑制了ＮＦ？３Ｓｃｔ３２／３６－ＩＫＫａ和ＩｋＢ的快速磷酸化，从而抑制了ＬＰＳ引起的胞浆ＩｋＢ的降解，激活ＮＦ－ｋＢＭＬＣ，以降低ＭＬＣＫ的表达量和磷酸化水平ｐ，结果表明ＬＰＳ通过激活－ＥＲＫ／ＮＦｋＢ信号途径调节了ＭＬＣＫ的表达，并且ＥＲＫ１／２作为信号途径的上游参与ＧＬＰ－２－对ＮＦｉｃＢ／ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ的调节。关于ＥＲＫ１／２信号途径调节ＭＬＣＫ活性的研究１７２ａｎ［］（报道较少，Ｔ等２０１４）研宄发现褪黑激素通过抑制ＥＲＫ１／２信号转导抑制ＭＬＣＫ［８４］Ａ＿－的转录ｌＳａｄｉ等（２０１３）ａ、翻译和活性保护食道上皮屏障功能。研究发现ＴＮＦ２－－信号旁路，激活转录因子Ｅ１，１激活ＥＲＫ１／ｌｋＥｌｋ的核转位发生后与ＭＬＣＫ启动子结合基序结合，激活ＭＬＣＫ启动子的活性及基因转录。这与本试验ＥＲＫ１／２参与ＬＰＳ一致引起的ＭＬＣＫ蛋白表达的结果，同时本研究还确定了ＥＲＫ１／２影响ＭＬＣＫ表达的／ＮＦ－ＥＲＫ下游信号是由ＩＫＫｋＢ所介导。此外，抑制１／２的磷酸化抑制了ａｃｔｉｎ骨架系统１７３一［］ＭＬＣ的作用提供了证据的重排也定程度上为ＥＲＫ１／２介导ｐ。４．１．１．３ＰＫＡ信号途径一－然而，本试验中ＧＬＰ２的处理抑制了ｐＥＲＫ的磷酸化，这结果与大多数前人４４２一［ｈ］Ｊａｓ证实ＧＬＰ－２通过激活ＭＡＰＫ信号的研究结果不致。ｌｅｅｎ等（２０００＆２００２）１９［］－传导通路，诱导Ｃａｃｏ２肠上皮细胞增生。Ｂｕｒｒｉｎ等（２００７）在新生仔猪体内试验中证实了用ＧＬＰ－２处理可以刺激ＥＲＫ２９０ＲＳＫ丰度的１／的快速激活及下游目标基因ｐ７增加１１，伴随着隐窝细胞的增殖。蒋义等（２０１２）在离体培养的断奶仔猪空肠组织上－－－也研宄发现ＧＬＰ２通过激活ＥＲＫｌ／２／ｐ９０ＲＳＫ信号途径促进ＺＯ１、ｏｃｃｌｕｄｉｎ和ｃｌａｕｄｉｎ１一１２５［］致的报道Ｐ－基因的表达。也有与本试验结果，Ｌｉ等（２０１６）研宄发现ＧＬ２通过２－－抑制ＥＲＫ１／、ＪＮＫ１／２和ＮＦｋＢ信号旁路缓解了ＬＰＳ应激的ＢＶ２细胞炎症。Ｘｉｅ等１１１ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三１７４］［－（２０１４）研究也发现，ＧＬＰ２通过抑制巨噬细胞ＥＲＫ１／２的磷酸化缓解了ＬＰＳ诱－导的炎症发生，２。通过对以上结果的分析我们发现ＧＬＰ在细胞处于正常状态下激活ＥＲＫ１／２信号途径促进细胞增殖和细胞间ＴＪ结构的形成；然而，ＥＲＫ１／２途径在细Ｐ－胞受到不良刺激时激活２则可能通过其它信号途径抑制了ＥＲＫ１／２，ＧＬ的活化。分４０［］Ｋｒ２００５－２能通过ＧＬＰ－析造成这种差异的原因，ｏｅｈｌｅ等（）曾经指出ＧＬＰ２Ｒ偶联不同类型的Ｇ蛋白参与对细胞增殖－２通过偶联Ｇ、凋亡等过程的调控，ＧＬＰ蛋白激ＰｙＲＭＡＰＫ旁－ａｓ／Ｒａｆ／，ｓ活路调控细胞增殖；在细胞凋亡研宄中发现ＧＬＰ２通过Ｇａ激活ｃ－－ＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径，抑制ＰＡＲＰ的分解ＳＫ３，２，促进Ｇ卩的磷酸化。由此推测ＧＬＰ在细胞处于应激状态下，可能通过偶联Ｇａｓ蛋白激活ＰＫＡ信号途径发挥生物学功能，蛋白解偶联一，因而不能激活ＥＲＫ１／２信号旁路然而，这还需要做进步试而与Ｇ；Ｐｙ－验进行确定３．４考察ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径对的活化对ＥＲＫ１／２及ＮＦｋＢ信。本试验一－，结果发现，与上文的推测相致的是ｒｓｋｄｉｎ号途径的影响，ＧＬＰ２和Ｆｏ均抑制了２－２ＬＰＳ引起的ＥＲＫ１／的磷酸化；ＰＫＡ信号途径抑制剂Ｈ８９存在条件下，ＧＬＰ对ＥＲＫ，１／２磷酸化的抑制作用被取消并且单独添加Ｈ８９也对ＬＰＳ刺激的ＥＲＫ１／２磷；酸化没有作用效果；与此同时，本试验３．４还发现ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径的激活抑制了ＬＰＳ引起的ＭＬＣＫ蛋白的表达及ＭＬＣ的磷酸化水平，改善了ＬＰＳ引起的细胞单ＬＰ－层的高通透性。以上结果表明ＬＰＳ应激条件下，Ｇ２通过激活ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途ＥＲＫ２－径抑制了１／的激活及其下游ＮＦｋＢ信号通路的活化，从而下调了ＬＰＳ引起的ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ磷酸化。７０４．１．１．４ＨＳＰ的调节－ｋＢ，ＬＰＳ存在时ＩＫ研究发现，ＴＲＡＦ６发生自身泛素化，激活下游的Ｋ及ＮＦ，６５［］ＴＲＡＦ６启动基因的转录，陈华群等（２００６）研宄发现ＨＳＰ７０通过与结合抑制ＬＰＳ８５｜］ＴＲＡＦ６－刺激引起的泛素化激活，从而抑制ＮＦｋＢ信号通路。Ｇｏｏｄｍａｎ等（２００９）ＨＳＰ７一研宄发现ＥＲＫ级联信号的激活，增加０的蛋白水平。但也有不致的研宄，１７５］［７０－ＨＳＰ，ＰＳ应激，缺乏引起ＥＲＫ的活化那么，Ｌ下ＨＳＰ７０是否参与对ＮＦｋＢ信？号途径的调节／２，它与ＥＲＫ１信号之间存在什么样的关系呢本试验３．３通过对ＨＳＰ７０蛋白表达的检测，发现ＬＰＳ引起了ＥＲＫ１／２磷酸化水平升高，下调了ＨＳＰ７０的蛋白－２在抑制ＥＲＫ１／２磷酸化的同时，表达ＧＬＰ，提高了ＨＳＰ７０蛋白的表达水平但是；－ＥＲＫ１／２抑制剂对ＨＳＰ７０的表达没有作用效果；然而，ＧＬＰ２却以ＥＲＫ１／２依赖的方１７５［］ＮＦ－ｋＢ信号途径的激活式抑制了。根据结果进行分析，可以推测与Ｌｅｅ等（２００５）１１２ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三一ＰＥＲＫ－－研宄结果致７０可１／２２ｋＢ信号，ＨＳ能作为的上游信号参与ＧＬＰ对ＩＫＫ／ＮＦ一途径的抑制作用。进步，本试验考察了ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径对ＨＳＰ７０表达的影响，３ＧＬＰ－２ＰＫＡＨＳＰ７０的结果．４显示，以剂量依赖的方式提高了蛋白表达，并抑制了－２可能激活ｃＡＭＰＥＲＫ１／２的磷酸化。以上结果表明ＧＬＰ／ＰＫＡ信号途径促进ＨＳＰ７０一ＴＲＡＦ６结合抑的表达方面可能与，，ＨＳＰ７０表达量的提高制其泛素化进而抑制一－ＩＫＫ／ＮＦｋＢ信号途径的激活另方面，ＨＳＰ７０也可能影响ＥＲＫ１／２的磷酸化，抑制；－ｋＩＫＫ磷酸化介导的ＮＦＢ的活化。但是，ＨＳＰ７０对ＥＲＫ１／２磷酸化进行调节的中间环节尚不清楚。４．１．２ＭＬＣＰ／ＭＬＣ的调节机制ｐＭＬＣＰ催化磷酸化型ＭＬＣ向非磷酸化型转变，在ＭＬＣ磷酸化的调控中也具有重要作用。活化的ＲＯＣＫ对ＭＬＣＰ调节亚基ＭＹＰＴ１的第６９６位Ｔｈｒ残基进行磷酸，化修饰，使ＭＬＣＰ失活而不能将ｐＭＬＣ去磷酸化导致胞质内ｐＭＬＣ磷酸化水平增口３２ＬＰ－２可ＲＯＣＫＭＬＣＰ力。本试验．的研宄结果表明Ｇ能通过抑制活性恢复酶活，催化ＭＬＣＫ过度磷酸化的ｐＭＬＣ转化为非磷酸化形式的ＭＬＣ，从而缓解ＭＬＣ磷酸－化引起的细胞收缩，以维持ＴＪ在相邻细胞膜间的正常结构分布２对。关于ＧＬＰＲＯＣＫ／ＭＬＣＰ／ｐＭＬＣ信号通路的研宄目前尚未见相关报道。－那么，ＧＬＰ２信号对ＭＬＣＰ活性的调节在胞内传递是否也涉及了ＥＲＫ１／２以及＇ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径呢？本试验３．３结果显示，ＭＥＫ的抑制剂Ｕ０１２６下调了ＥＲＫｌ／２ｐＴｈｒｔ％的磷酸化，但是对ＬＰＳ提高的ＭＬＣＰ亚基ＭＹＰＴｌ的磷酸化及ＭＬＣＰ酶活没有－ＧＬＰ－２均ＥＲＫ显著的作用效果单独添加ＧＬＰ２和共同添加Ｕ０１２６＋ｌ／２和；下调了ｐＭＹＰＴＭＬＣＰ的酶－２ＰＳ１的磷酸化，并显著提高了活结果表明：ＧＬＰ在Ｌ应激的肠上皮细胞上对ＭＬＣＰ／ｐＭＬＣ的调节独立于ＥＲＫ１／２信号途径。关于ＥＲＫ１／２是否参与对ＭＬＣＰ／ｐＭＬＣ的调节，目前以肠上皮细胞为研究模型的相关文章未见报道，２，但是在其它细胞模型上有类似报道。在大鼠回肠平滑肌上抑制ＥＲＫ１／缓解了蛋白磷酸酶抑制剂ｍｃｒｏｃｓｔｉｎ２ｉｙ引起的平滑肌持续性收缩，表明活化的ＥＲＫ１／信号途ｃｒｏｃｓｔｎ引起的细ＬＣ的径参与了ｍｉｙｉ胞收缩，即ＥＲＫ１／２信号途径参与对ＭＬＣＰ／ｐＭｍ［］调节，这与本试验中ＬＰＳ激活ＥＲＫ信号途径最终引起ＭＬＣ磷酸化增强的作用效－ｋＢ信号途径调节ＭＬＣ果相似，本试验发现ＥＲＫ１／２信号途径通过ＮＦ；所不同的是的磷酸化过程，而独立于ＭＬＣＰ介导的ｐＭＬＣ去磷酸化过程。ｃＡＭＰＫＡＬＰ－关于／Ｐ信号途径是否作为Ｇ２的上游靶标参与对ＭＬＣＰ／ｐＭＬＣ的调１１３ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研究：试验三－节．，无论Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ，ＧＬＰＬＰＳ诱，本试验３４结果显示存在与否２处理均降低了导ＬＣＰＨ－的ＭＹＰＴ；，８９２１磷酸化，维持了Ｍ的酶活相反存在条件下，ＧＬＰ抑制了由ＭＬＣＰ酶－ＬＰＳ引起的ＭＹＴＰ１磷酸化，活降低至与ＬＰＳ组差异不显著；结果表明ＧＬＰ２经由ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径介导抑制ＬＰＳ下调的ＭＬＣＰ酶活，从而缓解ＭＬＣ磷酸化ＬＰ－２Ｐ过量引起的细胞持续收缩。目前，关于Ｇ对ＭＬＣ／ｐＭＬＣ信号的调节尚未见相关报道，ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径对ＭＬＣＰ活力的调节有些类似的研宄，但是。研宄发现在大鼠脑微动脉内皮细胞ＲＢＭＥＣｓ上，Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ提高胞内ｃＡＭＰ水平几乎完全阻断－－－－ＥＭＡＰＩＩ（ｌｏｗｄｏｓｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｍｏｎｏｃｙｔｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅＩＩ）降低的ＴＥＲ，增加ｐＰＴＢＡＰ－ＩＡ－Ｉ了ＨＲ穿过Ｂ屏障的漏过率，并抑制了ＥＭ改变的Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ活力、ＺＯ１１７７［］ＬＣ－ｔ＾１＾蛋白的表达和分布以及Ｍ的磷酸化，同时抑制了Ｆａｃｉｎ细胞骨架的重排＜抑制剂存在条件下，ＴＧＲ５不能抑制ＲｈｏＡ／ＲＯＣＫ的活力，表明ＴＧＲ５经由ＰＫＡ抑１７８［］ＰＫＡ制ＲｈｏＡ／ＲＯＣＫ的活性。此外，在血管平滑肌上，ｃＡＭＰ／信号通过抑制ＲｈｏＡ［１７９］旁路活化ＭＬＣＰ酶参与了ＧＰＣＲ介导的冠状血管舒张。ｃＡＭＰ／ＰＫＡ通过抑制１８（）［］－ＣＰＩ１７和ＲｈｏＡ／ＲＯＣＫ提高ＭＬＣＰ的活力从而调节内皮屏障功能。以上结果与本一－２通过激活ｃＡＭＰ试验发现的结果致，即ＧＬＰ／ＰＫＡ信号途径抑制下游ＭＬＣＰ调节Ｔｈ＿亚基ＭＹＰＴｌ的磷酸化，从而维持了ＭＬＣＰ的酶活不被ＬＰＳ应激所降低。分析ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信三（三）．１２号在胞内的传递路径，结合试验３３研宄发现的ＥＲＫ／信号－－并不参与ＧＬＰ２对ＭＬＣＰ活力的调节，由此表明ＧＬＰ２在ＬＰＳ应激条件下激活ｃＡＭＰ／ＰＫＡ后并不经ＥＲＫ１／２信号途径抑制ＭＬＣＰ调节亚基ＭＹＰＴ１的磷酸化。推测ＧＬＰ－２经ＰＫＡ作用于ＲｈｏＡ／ＲＯＣＫ实现对ＭＬＣＰ酶活的调节而关于ＰＫＡ抑制ＲＯＣＫ，上调ＭＬＣＰ酶活的具体的作用机制尚不清楚。目前仅在其它试验模型上有过零星报道，如在研究ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径对血小板功能的调节时发现，前列腺素Ｅ１（ＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥｌ，ＰＧＥ１）通过ｃＡＭＰ／ＰＫＡ途径诱导ＲｈｏＡ１８８位Ｓｅｒ残基磷酸化，抑制凝血酶Ｔｈｒｏｍｂｉｎ引起的ＲｈｏＡ在膜上的再定位以及ＲｈｏＡ／ＲＯＣＫ／ＭＹＰＴｌ复合物的形成，阻断ＲｈｏＡ与ＲＯＣＫ２和ＭＹＰＴ１之间的联系，缓解ＭＬＣＰ的催化亚基ＰＰ１５１８１Ｔ［］１与调节亚基ＭＹＰ的解离，从而恢复ＭＬＣＰ的活力，减少了ＭＬＣ的磷酸化。由此，ＬＰＳ应激是否是通过影响ＲｈｏＡ在膜上的定位及ＲｈｏＡ／ＲＯＣＫ／ＭＹＰＴｌ复合物的－２是否影响了ＲｈｏＡ的磷酸化水平形成影响了ＭＬＣＰ的酶活，而ＧＬＰ，进而抑制了该复合物的形成从而抑制ＲＯＣＫ的活性尚需要进一步试验进行验证。１１４ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三－－４．２ＧＬＰ２调节Ｚ０１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白表达的信号途径试验二和试验三－２（二）研宄结果显示在体内外ＧＬＰ均能促进ＬＰＳ应激状态下一－ＴＺ０－肠上皮细胞Ｊ蛋白１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ的表达，为了进步确定参与介导ＧＬＰ２调节ＴＪ蛋白表达的上游信号途径，本试验分别添加ＥＲＫ１／２信号途径抑制剂以及ＡＭＰ－ｃ／ＰＫＡ信号途径的激动剂和抑制剂，分别考察ＥＲＫ１／２和ＰＫＡ信号途径对ＧＬＰ２３．３ＰＳ组ＥＲＫ１的介导作用。本试验结果显示，尽管Ｌ／２磷酸化水平升高，伴随ＴＪ蛋白表达量的下调，但是单独添加ＥＲＫ１／２抑制剂对ＬＰＳ下调的ＴＪ蛋白的表达量没有作用，表明ＬＰＳ应激引起的ＴＪ蛋白表达量的下调独立于ＥＲＫ１／２信号旁路的激活。－ＲＫ－－ＧＬＰ２抑制了Ｅ１／２的磷酸化，促进了ＬＰＳ应激的Ｊ２Ｚ０１ＩＰＥＣ细胞ＴＪ蛋白和ｏｃｃ－ｌｕｄｉｎ蛋白的表达Ｕ０１２６和ＧＬＰ２，ＥＲＫ１／２；同时添加磷酸化水平下降，ＴＪ蛋白Ｚ０－－１ｏｃｃｕｄｎ上结果表明ＬＰ和ｌｉ蛋白表达上调；以：Ｇ２独立于ＥＲＫ１／２信号途径促进＿ＬＰＳ应激状态下Ｚ０１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的表达。与本试验ＬＰＳ应激独立于ＥＲＫ１／２信号下调ＴＪ蛋白表达的结果不同，ＥＲＫ１／２的激活能通过降低ＴＪ关键蛋白的表达实现对ＴＪ选择性屏障功能的调节。如ＨＧＦ刺激显著激活ＭＤＣＫＩＩ细胞的ＥＲＫ１／２信号，ａｕｄ－－，而阻断ＥＲＫ１／２的激活后Ｃｌａｕｄ导致ＴＪ蛋白Ｃｌｉｎ２的表达量下降ｉｎ２的表达量８１［］２显著升高氧化应激激活ＥＲＫ１／信号途径导致ＴＪ相关蛋白表达的降低并使ＴＪ；的８２［］１屏障功能下降。结合４．１．１的结果讨论分析，ＥＲＫ／２信号途径主要参与了ＬＰＳ诱＇导的由ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ信号介导的ＴＪ蛋白超微结构分布和细胞定位方面的变化。推测ＬＰＳ应激可能通过其它信号途径引起ＴＪ蛋白的降解从而下调了ＴＪ蛋白的表达量，但是具体是通过什么信号途径还需进一步研宄。－试验３，，ｏｒｓｋｏｉｎ，ＧＬＰ２．４结果显示ＬＰＳ应激条件下无论Ｆｌ存在与否均提高了ＴＪ蛋白的表达ＰＫＡ抑制剂Ｈ８９取消了ＧＬＰ－２促进ＴＪ？；而蛋白表达的作用效果，以上结果表明ＧＬＰ－２经ｃＡＭＰＡ途ＥＣ－／ＰＫ径促进ＬＰＳ应激的ＩＰＪ２肠上皮细胞ＴＪ蛋白３－的表达。综合本试验．３和３．４的结果表明，在ＬＰＳ应激状态下，ＧＬＰ２激活ＰＫＡ信号途径，经，下游信号独立于ＥＲＫ１／２其它信号分子实现对ＴＪ蛋白表达量的调节。ＬＰ－２上调ＴＪ关于Ｇ蛋白表达的分子机制己有零星报道。与本试验结果不同的是，蒋７［］－义等２可能通过激活ＭＥＫ－／－（２０１２）研究发现ＧＬＰＥＲＫｌ２ｐ９０ＲＳＫ信号通路促进离体的断奶仔猪空肠上皮ＴＪ蛋白ＺＯ－ｃｃｎ－１、Ｏｌｕｄｉ、Ｃｌａｕｄｉｎ１的基因表达。这可能与－－本试验中细胞遭受ＬＰＳ应激导致ＥＲＫ１／２信号途径激活，致使ＧＬＰ２选择性与ＧＬＰ２Ｒ偶联的Ｇａｓ蛋白结合激活ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径，而与０５蛋白解偶联钝化（７１１５ 四川农业大学博士学位论文第三章试验研宄：试验三４（）［Ｒａｓ］－２／Ｒａｆ／ＭＡＰＫ旁路有关。目前，尚未见到关于ＧＬＰ通过ＰＫＡ信号途径调节ＴＪＬＰ－２ＰＫＡ蛋白表达的相关报道，，但是有几篇关于Ｇ激活信号途径的报道。研宄发现ＧＬＰ－２－ＧＬＰ－２ＲｃＡＭＰＰ－刺激了ＢＨＫ细胞积聚，ＰＫＡ依赖地激活Ａ１活性，促进细－２ｃｏｓ胞增殖此外，ＧＬＰ刺激了、和ｚｉｆ２６８的表达，并瞬时激活７０Ｓ６；／ｐ３７－［］激酶，抑制胞外信号调节激酶ＥＲＫ１／２，减少了血清刺激的Ｅｌｋ１活性。在ＰＫＡ抑－２和ｆｏｒｓｋｏ制剂Ｈ８９存在或不存在的条件下，ＧＬＰｌｉｎ均减少了线粒体细胞色素的释－ｃａｓａｓｅ－－放，，降低了放线菌酮诱导的ｐ３的分解抑制了放线菌酮诱导的ＢＨＫＧＬＰ２ＲＰ－２在激酶抑制剂ＰＤ９８０５４００２存在条件下亦提高的细胞凋亡，ＧＬ和ＬＹ２９４；相似的了放线菌酮处理后的细胞存活ＬＰ－２ＬＰ－２ＲｃＡＭＰ；结果表明Ｇ与Ｇ偶联以依赖的蛋白激酶抑制ｃａｓｐａｓｅ酶活，促进细胞存活；ＰＫＡ、ＰＩ３Ｋ和ＭＡＰＫ信号途径之间相互１８２１［４３［］］ＬＰ－２Ｙｕ２０１６）ＬＰＳ补充整合介导Ｇ对细胞凋亡的调节。此外，等（报道，应－Ｔ－－激显著下调了ｆＥＣＪ２细胞Ｊ表达，破坏了ＩＰＥＣＪ２细胞屏障功能，而ＧＬＰ２可能－－３Ｋ－Ａｋｔ－通过激活ＰＩｍＴＯＲ信号转导途径对ＬＰＳ应激的ＩＰＥＣＪ２细胞产生保护效应，－－促进ＴＪ关键蛋白的表达，降低肠上皮细胞间的通透性。由此提示，ＧＬＰ２与ＧＬＰ２Ｒ结合后偶联不同类型的Ｇ蛋白激活下游不同信号途径发挥其肠道营养功能，但ＰＫＡ一－与ＰＩ３Ｋ，还是存在上下游关系之间是通过偶联不同类型的Ｇ蛋白激活，尚需进步试验验证。５．小结应激条件下，１）ＬＰＳ通过激活ＥＲＫ２ＮＦ－Ｉ／／ｋＢ信号途径刺激了ＭＬＣＫ的表达且ＥＲＫ１／２，并作为信号途径的上游介导ＧＬＰ－２ＮＦ－ＫＢ／ＭＬＣＫ／ＭＬＣ的抑制作用对ｐ。２－－ｋＢ信）ＧＬＰ２通过激活ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径抑制ＥＲＫ１／２的激活及其下游ＮＦ号通路的活化，从而下调ＬＰＳ引起的ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ的过磷酸化。３）ＧＬＰ－２在ＬＰＳ应激的肠上皮细胞上对ＭＬＣＰ／ＭＬＣ的调节独立于ＥＲＫｐ１／２信号途径。ｔ＿６－４）ＧＬＰ２通过激活ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号途径抑制下游ＭＬＣＰ调节亚基ＭＹＰＴ１的磷酸化，以维持ＬＰＳ应激降低的ＭＬＣＰ酶活。－立于ＥＲＫＬＰＳ应激状态下，ＧＬＰ２激活ＰＫＡ信号途径１／２５）在，下游信号独，实现对ＴＪ蛋白表达量的调节。１１６ 四川农业大学博士学位论文第四章全文总结一第四章全文总结与结论、创新点及有待进步研宄的问题１．全文总结与结论－２对仔猪生产性能本论文首先通过生产试验研宄在断奶仔猪上外源添加ＧＬＰ、ＬＰ－２肠道发育、消化吸收相关酶活的作用效果；考察在断奶仔猪上外源添加Ｇ对遭ＧＬＰ－２Ｔ受ＬＰＳ应激的仔猪肠粘膜屏障功能的保护作用，初步明确在体内对Ｊ蛋白表－ＩＰＥ达和分布的作用，ＣＪ２；在体外试验中确定所选用的仔猪空肠上皮细胞细胞系能ＬＰ－２ＬＰ－２ＲＬＰＳ表达与Ｇ特异性结合并发挥肠营养功能的Ｇ，确定体外试验应激剂量和ＧＬＰ－２的最适添加剂量ＬＰ－２ＴＪ；考察添加最适剂量Ｇ对细胞单层通透性增加的ＴＺ０－屏障功能的影响Ｊ１ｃｃｌｕｄｉｎ，包括蛋白和ｏ蛋白的表达和超微结构分布及细胞亚一一一一一一定位通过抑制剂或激动剂的添加，从蛋白质磷酸化核转位胞内信号胞；－外信号的传递由内而外层层递进，系统而深入地考察ＧＬＰ２调节ＴＪ分布和表达的信号途径。本试验条件下，：，根据试验结果得出以下结论－－１１２（１０ｎｍｏｌ／ｋ）２．外源高剂量ＧＬＰｇ的注射能提高ＧＬＰ的基础水平；断奶后ＬＰ－２能，增强肠道中消化吸收相关的酶活注射Ｇ促进肠道形态学发育，改善断奶仔猪的生产性能。－１．２ＧＬＰ２能缓解ＬＰＳ应激的断奶仔猪肠粘膜屏障损伤及炎症的发生；这与ＧＬＰ－２－调节紧密连接ＺＯ１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的表达和分布有关。－－－１．３ＩＰＥＣＪ２细胞系能表达ＧＬＰ２Ｒ，可用于ＧＬＰ２的功能研究；建立影响仔猪肠－上皮细胞间通透性的应激模型，其适宜的ＬＰＳ添加剂量为ｌＯＯｘ／ｍｌＧＬＰ２；可以缓ｉｇ８ｘｍ〇解ＬＰＳ应激增强的仔猪肠上皮细胞单层的通透性，其适宜添加剂量为ｌｌ（Ｔｌ／Ｌ。８－－ｘ１，ｌｌｍｏＬＰ２改善应激肠上皮．４在ＩＰＥＣＪ２细胞系上（Ｔ／ＬＧ单层的通透性的作－用机制与ＴＪ结构的稳定密切相关。ＧＬＰ２对ＴＪ的调节涉及：１）促进细胞膜上ＴＪ蛋白的表达；２）下调ＬＰＳ应激初始提高的ＭＬＣ磷酸化水平，调节ＴＪ关键蛋白的细胞定位和胞间重分布。此外，ＭＬＣＫ介导的ｐＭＬＣ磷酸化并不参与应激状态下对ＴＪ蛋白表达量的调节，当应激后期ＴＪ蛋白的表达量降低，抑制ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ对改善通１１７ 四川农业大学博士学位论文第四章全文总结透性的作用—：－ｋＢ１：．５在１７蛋白超微结构分布方面ＬＰＳ通过激活ＥＲＫＩ／２／ＮＦ信号途径上调ＭＬＣＫ的表达ＧＬＰ－２通过激ｃＡＭＰ／ＰＫＡ２；活信号途径抑制ＬＰＳ对ＥＲＫ１／及其下游ＮＦ－ｋＢ信号通路的活化／ＭＬＣ过磷酸化ＧＬＰ－２在ＬＰＳ，从而下调ＬＰＳ引起的ＭＬＣＫｐ；应激的肠上皮细胞上对ＭＬＣＰ／ｐＭＬＣ的调节独立于ＥＲＫ１／２信号途径，依赖Ｔｈｒ６９６ｃＡＭＰ／ＰＫＡＭＬＣＰ调ＭＹＰＴｌＬＣＰ信号途径抑制下游节亚基的磷酸化，维持Ｍ的酶活，实现对ｐＭＬＣ去磷酸化过程的调节；在ＴＪ蛋白表达方面：在ＬＰＳ应激状态－２ｃＡＭＰ下，Ｊ，ＧＬＰ激活依赖的ＰＫＡ信号途径下游信号独立于ＥＲＫ１／２，实现对Ｔ蛋白表达量的调节。２．本研究的创新点本研究紧跟动物营养专业断奶仔猪肠道营养调控的前沿科学问题，获得了以下新的研宄成果：２－２对ＬＰＳ．１体外注射ＧＬＰ应激的断奶仔猪肠粘膜屏障功能损伤及肠炎发生发展具有显著的保护作用效果；其作用机制与ＴＪ蛋白表达量增加和ＭＬＣ磷酸化水平紧密相关。－２对－ｋＢ２ＩＫＫＮＦ，．２首次证实了ＧＬＰ介导的信号途径以及ＲＯＣＫ介导的ＭＬＣＰＣＫ和ＭＬＣＰ－信号的调控作用２的调。；ＭＬ作为关键蛋白受到ＧＬＰ控２－．３发现ＬＰＳ应激条件下ＧＬＰ２抑制ＥＲＫ１／２信ＥＲＫ１／２，号途径的活化，信号途ＮＦ－ｋＢ信号的上游参与对ＭＬＣＫ／ＭＬＣ磷酸化的调节ＴＪ径作为ｐ，实现对结构开放ＥＲＫ－１／２ＧＬＰ２对ＴＪ。的调节，；然而信号途径独立于蛋白表达的调节２ｃＡＭＰ／ＰＫＡＧＬＰ－．４率先研究并证实了活化的信号途径作为２从胞外到胞内信号ＧＬＰ－２对ＴＪ蛋白传递的起始介导了表达及结构重排的调节作用。－本研宄首次系统地研宄了介导ＧＬＰ２调节ＴＪ蛋白结构稳定的相关信号途径。一３．有待进步研究的问题“３ＧＬＰ－２ＴＪ关ｌ．１研究发现能调节键蛋白ｏｃｃｕｄｉｎ从胞浆到膜上ＴＪ复合体的募”集，影响ＴＪ蛋白的定位和胞间分布，除了可能受到ＭＬＣ磷酸化引起的细胞收缩所致以外，是否还作用于其它某种激酶或某条信号途径尚待研宄。３２研ＨＳＰ７０介导了ＧＬＰ－２，ＥＲＫ／２．究发现的保护作用但是它是通过作用于１１１８ 四川农业大学博士学位论文第四章全文总结－ｋＢ信号途径尚待研究信号途径还是通过与ＴＲＡＦ６结合抑制ＩＫＫ／ＮＦ。３－．３研究发现在ＬＰＳ应激状态下２以ＰＫＡ依赖、ＥＲＫ１／２信号独立的方式，ＧＬＰＴＪ蛋白表达的促进作用可能与ＧＬＰ－２Ｒ偶联不同类型的Ｇ蛋白有实现对，这种作用一－３Ｋ关，但尚待进步验证；而ＰＫＡ与ＰＩ信号途径之间是否存在上下游关系也未可知。３－．４研究发现ＧＬＰ２具有保护应激的断奶仔猪肠道健康的作用效果，但是在生产上其应用还受到价格一、使用方式的限制必要进，有步开展试验考察如何通过营养调控的方法提高仔猪体内ＧＬＰ－２的循环基础水平，以缓解应激造成的断奶仔猪的肠道损伤。１１９ 四川农业大学博士学位论文参考文献参考文献１ＳＵＬＳＨＥＮＬ，ＬＡＹＢＵＲＧＨＤＲ，ｅｔａｌ．Ｔａｒｅｔｅｄｅｉｔｈｅｌｉａｌｔｉｈｔｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｇｐｊ［］ｇｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｃａｕｓｅｓｉｍｍｕｎｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｔｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｅｘｅｒ２００９－ｐｉｍｅｎｔａｌｃｏｌｉｔｉｓＪ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏ，，１３６２：５５１５６３．［］ｇｙ（）－２贾刚．胰高血糖素样肽２与断奶仔猪肠道发育关系及作用机理研究Ｄ．，适应的［］［］：四川农业大学２００９．雅安，Ｌ－－３ＨＡＤＪＩＹＡＮＮＩＩＩＫＫＤＲＵＣＫＥＲＤＪ．Ｇｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２ｒｅｄｕｃｅｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ，，ｇｐｐ［］ｅｒｍｅａｂｉｉｔｂｕｔｄｏｅｓｎｏｔｍｏｄｉｆｙｔｈｅｏｎｓｅｔｏｆｔｅ１ｄｉａｂｅｔｅｓｉｎｔｈｅｎｏｎｏｂｅｓｅｄｉａｂｅｔｉｃｐｌｙｙｐｍｏｕｓｅＪＥ２００９１５０２５９２－５９９．ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ：．［］ｇｙ，，（）－－４ＫＩＳＳＯＷＨＶＩＢＹＮｅｔａｌＥｘｏｌｌｉｋ－ＥＨＡＲＴＭＡＮＮＢ．ｅｎｏｕｓｕｃａｏｎｅｅｔｉｄｅ２？，，ｇｇｇｐｐ［］－－ｓＧＬＰ２ｒｅｖｅｎｔｓｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｉｎｄｕｃｅｄｍｕｃｏｉｔｉｓｉｎｒａｔｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅＪ．Ｃａｎｃｅｒ（）ｐｐｙ［］ｌ３９－４ＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙａｎｄＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１２，７０（）；８．Ａｅ－５ＢＰＥＦＦＥＲＮＰＩＲＯＮＥＡｔａｌ．ＧＬＰ２ｒｅｃｅｔｏｒａｏｎｉｓｍａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓＭＯＯＲＥ，，，ｐｇ［］ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｔａｓｉｓｉｎｍｕｒｉｎｅｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅｉｌｅｕｓ．Ｐ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ－ＰｈａｒｍａｃｏｌｏａｎｄＥｘｅｒｉｍｅｎｔａｌＴｈｅｒａｅｕｔｉｃｓ２０１０３３３２５７４５８３：．ｇｙｐｐ，，（）＇ＷＭＣＬＡＵＧＨＬＩＮＪＴ－６ＭＯＲＡＮＧＯＮＥＩＬＬＣ．ＧＬＰ２ｅｎｈａｎｃｅｓｂａｒｒｉｅｒｆｏｒｍａｔｉｏｎ，，［］－－２ｃｅａｎｄａｔｔｅｎｕａｔｅｓＴＮＦａｉｎｄｕｃｅｄｃｈａｎｇｅｓｉｎａＣａｃｏｌｌｍｏｄｅｌｏｆｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｒｅｕａ－－ｂａｒｒｉＪ．ＲｇｌｔｏｒｙＰｅｐｔｉｄｅｓ２０１２，１７８ｌ３：９５１０１．［］，（）ｅ－２７蒋义贾刚，惠明弟，ｔａｌ．胰高血糖素样肽对断奶仔猪肠上皮紧密连接蛋白相［］５－Ｊ〗２４１．关基因表达的影响［．动物营养学报２０２９：〗７８５７９２］，，（）［８］ＭＣＣＲＡＣＫＥＮＢＡ，ＳＰＵＲＬＯＣＫＭＥ，ＲＯＯＳＭＡ，ｅｔａｌ．ＷｅａｎｉｎｇａｎｏｒｅｘｉａｍａｙｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏｌｏｃａｌｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｐｉｇｌｅｔｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅＪ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆ［］－ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ１９９９１２９３：６１３６１９．，，（）［９］ＰＩＳ，ＬＡＬＬＥＳＪ，ＢＬＡＺＹＦ，ｅｔａｌ．Ｗｅａｎｉｎｇｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈａｎｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｘｒｅｓｓｏｎｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｃｔｏｋｉｎｅｓｉｎｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅｏｆｉｌｅ．ｏｕｒｎａｏｆｐｉｙｙｐｇｔｓ［Ｊ］ＪｌＮｕ－ｔｒｉｔｉｏｎ２００４１３４３：６４１６４７．，，（）１０ＳＤＥＲＨＯＬＭＪＤＰＥＲＤＵＥＭＨ．ＩＩ．ＳｔｒｅｓｓａｎｄｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｒｒｉｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎＪ．［］，ｆ］Ｊｏ－ｕｒｎａｌｏｆＰｈｓｉｏｌｏＧａｓｔｒｏｔｔＬｉｖＰｈｌＡｍｅｒｉｃａｎｉｎｅｓｉｎａｌａｎｄｅｒｓｉｏｏｙｇｙｙｇｙ，２００１２８０１－：７１３．？（）［１１］ＫＩＬＩＡＡＮＡＪ，ＳＡＵＮＤＥＲＳＰＲ，ＢＩＪＬＳＭＡＰＢ，ｅｔａｌ．Ｓｔｒｅｓｓｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｕｐｔａｋｅｉｎｒａｔｊｅｊｕｎｕｍ［Ｊ］．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｓ－５７－４４ｙｉｏｌｏｇｙＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｎｄＬｉｖｅｒＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ１９９８，２７５：１０３１０．，（）［１２』刘海萍，胡彩虹，徐勇．早期断奶对仔猪肠通透性和肠上皮紧密连接蛋白１２０ 四川农业大学博士学位论文参考文献－ＯｃｃｕｄｎｍＲＮＡ表达的影卩２００８２０４：４４ｌｉ向［Ｊ？动物营养学报，，２４４６．］（）［１３］ＢＪＥＲＫＮＥＳＭ，ＣＨＥＮＧＨ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓｂｙｅｎｔｅｒ．ｔｉｃｎｅｕｒｏｎｓＪＰｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆｔｈｅＮａｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，［］ｇｙ２００－１１９８２２：１２４９７２５０２，（）Ｊ－－１４ＥＳＴＡＬＬＪＬＤＲＵＣＫＥＲＤ．Ｔａｌｅｓｂｅｏｎｄｔｈｅｃｒｔ：ｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２ａｎｄ［］，ｙｙｐｇｇｐｐ－ｃｔｏｒｏｔｅｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａＪ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ２００５１４６１：１９２１．ｙｐ［］ｇｙ，，（）１５ＧＵＡＹＦＤＯＮＯＶＡＮＳＴＲＯＴＴＩＥＲＮ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｍｏｒｈｏｌｏｉｃａｌ［］，，ｐｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓａｒｅｐａｒｔｉａｌｌｙｉｍｐａｉｒｅｄｉｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａｆｒｏｍｇｒｏｗｉｎｇｐｉｇｓｆｅｄｒｅｃｅｄ－ｒｏｄｕｐｔｅｉｎｄｉｅｔｓｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓ［Ｊ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌ］４９－Ｓｃｉｅｎｃｅ２００６８４７：１７１７６０．，，（）－－１６ＳＴＥＰＨＥＮＳＪＳＴＯＬＬＢＣＯＴＴＲＥＬＬＪｅｔａｌ．Ｇｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２ａｃｕｔｅｌ［］，，ｇｙ，ｐｐｅａｓｅｓｒｏｘ－ｉｍａｌｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂｌｏｏｄｆｌｏｗｉｎＴＰＮｆｅｄｎｅｏｎａｔａｌｉｌｅｔｓＪ．ｉｎｃｒｐｐｇ［］－ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｓｉｏｌｏＲｅｕｌａｔｏｒＩｎｔｅｒａｔｉｖｅａｎｄＣｏｍａｒａｔｉｖｅＰｈｓｉｏｌｏｙｇｙｇｙ，ｇｐｙｇｙ，２００６２９０２２８３－２８９．：，（）１７ＮＥＬＳＯＮＤＷＳＨＡＲＰＪＷＢＲＯＷＮＦＩＥＬＤＭＳｅｔａｌ．Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［］，，，－ｏｆ－２ｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅｒｅｃｅｔｏｒｓｏｎｖａａｌａｆＴｅｒｅｎｔｓｉｎｔｈｅｒａｔＪ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｇｐｐｇ［，ｐ］ｇｙ－２００７１４８５：１９５４１９６２．？（）１８ＤＲＵＣＫＥＲＤＪＳＨＩＣＲＩＶＩＣＩＡｅｔａｌ．Ｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｂｉｏｌｏｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｏｆ［］，Ｑ，，ｇｇｙｃａｏｎ－ｅｅｔｉｅ２ｉｎｖｉｖｏｂｉｅｔｉｅｔｉｄａｓｅＩａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｏｇｌｕｇｌｉｋｐｐｄｙｄｐｐｄｙｌｐｐＶＪ．Ｎｌｇｙ，［］－１９９７１５７：６７３６７７．，（）－Ｉｔｔ［１９ＢＵＲＲＮＤＧ，ＳＴＯＬＬＢ？ＧＵＡＮＸ，ｅｔａｌ．ＧＬＰ２ｒａｐｉｄｌｙａｃｔｉｖａｅｓｄｉｖｅｒｅｎ］ｇｔｔｔｔｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｉｎｇａｈｗａｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｉｎｅｓｉｎａｌｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌａｎｄｒｏｌｉｆｅｒａｉｏｎｉｎｐｙｐｎｅｏｎａｔａｌｉｌｅｔｓＪ．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｓｉｏｌｏｇｙ：ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍｇ，ｐｆ］ｙｇｙ－２００７２９２．：２８１２９１，１（）Ｄ－－２０ＢＵＲＲＩＮＧＳＴＯＬＬＢＧＵＡＮＸｅｔａ］．Ｇｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２ｄｏｓｅｄｅｅｎｄｅｎｔｌ［］，，，ｇｐｐｐｙａｃｔｉｖａｔｅｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｎｅｏｎａｔａｌｐｉｌｅｔｓＪ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙｇ［］，２００５４６－１ｌ：２２３２．，（）Ｆ－－２１ＫＩＴＣＨＥＮＰＩＴＺＧＥＲＡＬＤＡＧＯＯＤＬＡＤＲ，ｅｔａｌ．Ｇｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２［］，，ｇｐｐ－ｔ－－ｉｎｃｒｅａｓｅｓｓｕｃｒａｓｅｉｓｏｍａｌｔａｓｅｂｕｔｎｏｃａｕｄａｌｒｅｌａｔｅｄｈｏｍｅｏｂｏｘｐｒｏｔｅｉｎ２ｇｅｎｅｅｘｒｅｓｓＪＡ－ｉｏｎ．ｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｓｉｏｌｏＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｎｄＬｉｖｅｒＰｈｓｉｏｌｏ，ｐ［］ｙｇｙｙｇｙ－２０００２７８３４．：４２５２８，（）－２２ＰＥＴＥＲＳＥＮＹＭ，ＥＬＮＩＦＪ，ＳＣＨＭＩＤＴＭｅｔａｌ．Ｇｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２ｅｎｈａｎｃｅｓ［］？ｇｐｐ－－ｔｔｍａｌｔａｓｅｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅａｎｄｓｕｃｒａｓｅｉｓｏｍａｌａｓｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖｉｙｉｎａｒｅｎｔｅｒａｌｌｆｅｄｒｅｍａｔｕｒｅｎｅｏｎａｔａｌｉｌｅｔｓＪ．ＰｅｄｉａｔｒｉｃＲｅｓｅａｒｃｈｐｙｇ［，ｐｐ］１２１ 四川农业大学博士学位论文参考文献－２００２５２４．：４９８５０３，（）２３Ｃ－ＣＨＥＥＳＥＭＡＮ．ＵｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＳＧＬＴ１ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｒａｔｅｕｎｕｍｉｎｄｕｃｅｄｊｊ［］－２－ｂＧＬＰｉｎｆｕｓ．ＡＪＲＩｔｔｉｏｎｉｎｖｉｖｏＪｍｅｒｉｃａｎｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｓｉｏｌｏｅｕｌａｔｏｒｎｅｒａｉｖｅｙ［］ｙｇｙｇｙ，ｇａｒａｔｖｅＰｈｓｉｏｌｏ１９９７２－ａｎｄＣｏｍｉ：１９７１．ｐｙｇｙ，，７３６１９６５（）－２４ＫＯＵＲＩＳＧＪＬＩＵＲＯＳＳＩＨｅｔａｌ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２ｏｎ，？［］？ＱｇｇｐｐｔｔｔｔｅｒａｔｒｔａｔｎｅｃｒｔｎａｎｃｒｅａｔｔｓＪ．ｉｎｅｓｉｎａｌｅｒｍｅａｂｉｌｉａｎｄｂａｃｉｌａｎｓｌｏｃａｉｏｎｉｎｃｕｅｏｉｚｉｉｉｐｙｇｐ［］ａｎｏｕｒｎａｏｆ－ＡｍｅｒＳｕｒｅｒ１１１：１５７５ｉｃＪｌｇｙ８６５７．，２００，（）ＭＣＫＡＹＤＰ－－２５ＢＥＮＪＡＭＩＮＭｅｔａｌ．Ｇｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２ｅｎｈａｎｃｅｓ，ＹＡＮＧ？，ｇｐｐ［］ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｉｔｈｅｌｉａｌｂａｒｒｉｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｂｏｔｈｔｒａｎｓｃｅｌｌｕｌａｒａｎｄａｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐａｔｈｗａｙｓｉｎｐｐ２－ｔｈｅｍｏｕｓｅＪ．Ｇｕｔ２０００４７１：１１１１９．［，？）］（ＢＯＵＳＨＥＹＲＰＹＵＳＴＡＢＤＲＵＣＫＥＲＤＪｏｎ－２ｄｅｃ２６５，．Ｇｌｕｃａｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅｒｅａｓｅｓ［］ｇｔｓ－ｍｏｒｔａｌｉｙａｎｄｒｅｄｕｃｅｔｈｅｓｅｖｅｒｉｔｙｏｆｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎｉｎｄｕｃｅｄｍｕｒｉｎｅｅｎｔｅｒｉｔｉｓＪ．［］ＡｍＪｏｕｒｎａ－ｅｒｉｃａｎｌｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ，－１９９９２７７５：９３７９４７．？（）２７ＡＬＡＶＩＫ？ＳＣＨＷＡＲＴＺＭＺ，ＰＡＬＡＺＺＯＪＰ，ｅｔａｌ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｂｏｗｅｌ［］ｅｅｓｎａ－－ｄｉｓｅａｓｅｉｎａｒｏｄｅｎｔｍｏｄｌｗｉｔｈｔｈｅｉｎｔｔｉｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ２Ｊ．［］ｏｆ－ＪｏｕｒｎａＰｅｄｉａｔｒｉｃｕｒｅｒ２０００３５：．ｌＳｇｙ，？（６８４７８５１）２８ＣＡＭＥＲＯＮＨＬ，ＰＥＲＤＵＥＭＨ．Ｓｔｒｅｓｓｉｍａｉｒｓｍｕｒｉｎｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｒｒｉｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎ：［］ｐｏｖｅｍｅｎｕｃａ－－ｔｂｏｎｌｉｋｅｅｅ２Ｊ．ａｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏａｎｄｉｍｐｒｙｇｌｇｐｔｉｄＪｏｕｒｎｌｇｙｐ［］ｅｒｔ１４ｌ２１４－２２０ＥｘｐｉｍｅｎｔａｌＴｈｅｒａｅｕｉｃｓ２００５３：．．ｐ，，（）［２９］ＳＩＧＡＬＥＴＤＬ，ＷＡＬＬＡＣＥＬＥ，ＨＯＬＳＴＪＪ，ｅｔａｌ．Ｅｎｔｅｒｉｃｎｅｕｒａｌｐａｔｈｗａｙｓｍｅｄｉａｔｅｔｈｅａｎｔ－ｔｏｒａｃｔｏｎｓｏｆｃａｎ－ｅｅｔｅＡｍｅｒｃａｎＪｏｕｒｎａｏｉｉｎｆｌａｍｍａｙｉｇｌｕｇｏｌｉｋｐｐｉｄ２Ｊ．ｉｌｆ［］－Ｐｈｓｏｏ－ａｓｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｎｄＬｉｖｅｒｈｓｉｏｌｏ２９３１：２２２１ｙｉｌｇｙＧｔＰｙｇｙ，２００７，（）１１．３０ＣＡＮＩＰＤ，ＰＯＳＳＥＭＩＥＲＳＳ，ＶＡＮＤＥＷＩＥＬＥＴ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｎｇｅｓｉｎｇｕｔｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ［］－－ｃｏｎｔｒｏｌｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎｏｂｅｓｅｍｉｃｅｔｈｒｏｕｇｈａｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎｖｏｌｖｉｎｇＧＬＰ２ｄｒｉｖｅｎｏｖｅｍｅｎｔｏｆｕｔｅｒｍｅａｂｉｌｉｔ－．ｕｔ２００９５８：１１．ｉｍｐｒｇｐｙＪ］Ｇ，，８１０９１０３［（）－－１ＪＬＹＵＳＴＡＢＤＲＵＣＫＥＲＤＪｔ３ＥＳＴＡＬＬ．Ｌｉｉｄｒａｆｄｅｅｎｄｅｎｔｌｕｃａｏｎｌｉｋｅ；［］，ｐｐｇｇ－－ｐｅｐｔｉｄｅ２ｒｅｃｅｐｔｏｒｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇｏｃｃｕｒｓｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙｏｆａｇｏｎｉｓｔｉｎｄｕｃｅｄＭｏ－ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎＪ．ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｏｆｔｈｅＣｅｌｌ，２００４，１５８：３６７３３６８７．［］ｇｙ（）ＹＵＳＴＡＢＨＵＡＮＧＬｅ－２３２，ＭＵＮＲＯＥＤ，ｔａｌ．ＥｎｔｅｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＧＬＰ［］，ｒｅｃｅＪｔｒｔ－ｔｐｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｓａｎｄｒｏｄｅｎｔｓ．ＧａｓｏｅｎｅｒｏｌｏＢａｌｉｍｏｒｅＴｈｅｎ［］ｇｙＰｈｉ１－７５５：ｌａｄｅｌｈｉａ２０００１９３７４４．ｐ，，（）－ＧＵＡＮＸＫＡＲＰＥＮＨＥＳＴＥＰＨＥＮＳＪｅｔａ．２ｔｏｅｎｔｅｒ３３ｌＧＬＰｒｅｃｅｔｏｒｌｏｃａｌｉｚｅｓｉｃｓ，［］，ｐｎｅｕｒｏｎｓａｎｄｅｎｄｏｃｒｉｎｅｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｖａｓｏａｃｔｉｖｅｅｔｉｄｅｓａｎｄｍｅｄｉａｔｅｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｐｐ１２２ 四川农业大学博士学位论文参考文献－ｂｌｏｏｄｆｌｏｗＪ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ２００６１３０１１１６４ｌｏ：５０．［］ｇｙ，，（）－３４ＧＵＡＮＸＳＨＩＸＬＩＸｅｔａｌ．ＧＬＰ２ｒｅｃｅｔｏｒｉｎＰＯＭＣｎｅｕｒｏｎｓｓｕｒｅｓｓｅｓｆｅｅｄｉｎ，，，ｐｐｇ［］ｐｂｅｈａｖｉｏｒａｎｄａｓｔｒｉｃｍｏｔｉｌｉｔＪ．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｓｉｏｌｏ：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏａｎｄｇｙ［］ｙｇｙｇｙ－Ｍｅｔａｂｏ．ｌｉｓｍ２０１２３〇３７：８５３８６４，？（）ＤＡｅ－３５ＭＵＮＲＯＥＧＧＵＰＴＡＫＫＯＯＳＨＥＳＨＦｔａｌ．ＰｒｏｔｏｔｉｃＧｒｏｔｅｉｎｃｏｕｌｅｄ，，，ｙｐ［］ｐｐ－ｒｅｃｅｐｔｏｒｆｏｒｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２Ｊ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆｔｈｅｇｇｐｐ［］ｇＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，－１９９９９６４：１５６９１５７３．，（）ＷＡＬＳＨＮＡＹＵＳＴＡ－－３６，Ｂ，ＤＡＣＡＭＢＲＡＭＰ，ｅｔａｌ．Ｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ２ｒｅｃｅｐｔｏｒ［］－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｒａｔｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａＪ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ２００３１４４１０：４３８５４３９２．［］ｇｙ，，（）ＳＯＭＷＡＲＲｅ－－３７ＹＵＳＴＡＢ，ＷＡＮＧＦ？ｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２［］，ｇｇｐｐ－－ｔａＧＬＰ２ａｃｉｖｔｅｄｓｉｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓｉｎｂａｂｙｈａｍｓｔｅｒｋｉｄｎｅｙｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｅｘｒｅｓｓｉｎ（）ｇｐｇ－ｔｈｅｒａｔＧＬＰ２ｒｅｃｅｔｏｒＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｐ［］ｇｙ，１２７４－９９９４３：３０４５９３０４６７．，（）３８ＢＥＣＫＰＳＩＧＡＬＥＴＤ．ＧｕｔｈｏｒｍｏｎｅｓａｎｄｓｈｏｒｔｂｏｗｅｌｓｎｄｒｏｍｅＭＡＲＴＩＮＧ：ｔｈｅ［］，，，ｙｍａ－－ｅｎｉｇｔｉｃｒｏｌｅｏｆｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ２ｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｄａｐｔａｔｉｏｎＪ．［］－ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌ２００６２２６４４．ｌｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｏ１：１１７１２９ｇｙ，，（）３９ＹＵＳＴＡＢＥＳＴＡＬＬＪＤＲＵＣＫＥＲＤＪ－－．Ｇｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｅ２ｒｅｃｅｔｏｒａｃｔｖａｔｏｎｉｄｉｉ［］，，ｇｐｐｐ－－ｅｎｇａｇｅｓｂａｄａｎｄｌｃｏｅｎｓｎｔｈａｓｅｋｉｎａｓｅ３ｉｎａｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＡｄｅｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒｇｙｇｙｐｐ－ａｎｄｐｒｅｖｅｎｔｓａｐｏｐｔｏｓｉｓｆｏｌｌｏｗｉｎｇｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３ｋｉｎａｓｅＪ．［］ＪｏｕｒｎａＢｔ－ｌｏｆｉｏｌｏｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｒ２００２２７７２８：２４８９６２４９０６．ｇｙ，，（）ＢＤＲＵＣＫＥＲＤ－－４０ＫＯＥＨＬＥＲＪＹＵＳＴＡ．ＴｈｅＨｅＬａｃｅｌｌｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ，２［］，ｇｇｐｐｒｅｃｅｐｔｏｒｉｓｃｏｕｐｌｅｄｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄＥＲＸ１／２ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｎｄｏｃｒ－ｄｒｅｎｔｓｎａｌｉｎａｔｈｗａｓＪ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｎｏｌｏ２００５１９２：４５９４７３．ｉｖｅｇｉｇｇｐｙＥｇｙ，，（）［］４１ＪＡＳＬＥＥＮＪＳＨＩＭＯＤＡＮＳＨＥＮＥＲｔ－ｌｍｅｃｈａｎｉ，ｅａｌ．Ｓｉｎａｉｎｓｍｓｏｆｌｕｃａｏｎｌｉｋｅ［］，，ｇｇｇｇ－ｅｔｌｉｄｅ２ｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．ＪｏｕｒｎａｌｆＳｕｒｉｃａｐｐｐｐ＾ｏｇｌ］－Ｒｅｓｅａｒｃｈ２０００９０１：１３１８．，，（）ＡＳＬＥＥＮＡＳＨＬＥＹＳＷＳＨ－４２ＪＪ，ＩＭＯＤＡＮ，ｅｔａｌ．Ｇｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ［］，ｇｐｐｔｔｔｏｅａｔｏｎｎｖｔ．ＤｔｉｎｅｓｉｎａｌｅｉｈｅｌｉａｌｒｌｉｆｒｉｉｉｒｏＪｉｅｓｉｖｅＤｉｓｅａｓｅｓａｎｄＳｃｉｅｎｃｅｓｐｐ［］ｇ，－２００２４７５：１１３５１１４０．，（）４３ＨＡＲＥｔ－ＫＪＨＡＲＴＭＡＮＮＢＫＩＳＳＯＷＨｅａｌ．Ｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｒｏｈｉｃｅｔｉｄｅｌ２，，？，，［］ｐｐｐｇｐｌａｔｒｏｈｉｉｂｈｉｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｐｙｉｎｍｃｅｎｄｕｃｅｄｔｅｅｄｅｒｍａｌｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｔｏｒｙｐｇｐ－ｔｔＪｌｉｉｃａｌａｎｃｅｒＲｅｓｅａｈ２００７１３１７５１７０５１７５ｉｎｈｉｂｉｏｒｅｆｉｉｎｉｂ．ＣｎＣｒｃ：．，ｇ［］，，（）ＯＡＯＵＤ－－４４ＡＮＩＮＩＹＩＺＺＩＴＧＹｅｔａｌ．Ｒｏｌｅｏｆｈｏｓｈａｔｉｄｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３ｋｉｎａｓｅｉｎｔｈｅ，，，ｐｐｙｙ［］１２３ 四川农业大学博士学位论文参考文献ａｃ－－２ｏｎｔｉｏｎｓｏｆｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅｔｈｅｍｕｒｉｎｅｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅＪ．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｇｇｐｐ［］－Ｍｅ－ｏｆＰｈｓｉｏｌｏｇｙＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙａｎｄｔａｂｏｌｉｓｍ２００７２９２６：１５９９１６０６．ｙ，，（）－－－４５ＳＨＩＸＬＩＸＷＡＮＧＹｅｔａｌ．Ｇｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｒｏｔｅｉｎｓｎｔｈｅｓｉｓ？，，ｇｐｐｙ［］ｐ－－－ｔｈｒｏｕｈｔｈｅＰＩ３ｋｎａｓｅｄｅｅｎｄｅｎｔＡｋｔｍＴＯＲｓｉｎａｌｉｎａｔｈｗａＪ．Ａｍｅｒｉｃａｎｇｉｐｇｇｐｙ［］Ｊ－－ｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｓｉｏｌｏＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ２０１１３００３：５５４５６３．ｙｇｙｇｙ，，（）－４６ＦＡＮＮＩＮＧＡＳＪＡＭＥＳＯＮＢＪ，ＪＥＳＡＩＴＩＳＬＡｅｔａｌ．ＴｈｅｔｉｈｔｕｎｃｔｉｏｎｒｏｔｅｉｎＺＯ１［］，，ｇｊｐｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓａｌｉｎｋｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｏｃｃｌｕｄｉｎａｎｄｔｈｅａｃｔｉｎｌｉ４－ｃｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｓｔｒｙ１９９８２７３４５：２９７５２９７５３．ｙ，，ｆ］（）［４７］ＵＬＬＵＷＩＳＨＥＷＡＤ，ＡＮＤＥＲＳＯＮＲＣ，ＭＣＮＡＢＢＷＣ９ｅｔａｌ．ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｂｙｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｄｉｅｔａｒｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ［］－Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ２〇ｌｌ１４１５：７６９７７６．，，（）［４８ＣＡＰＡＬＤＯＣＴ５ＮＵＳＲＡＴＡ．ＣｙｔｏｋｉｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｉｇｈｔｕｎｃｔｉｏｎｓＪ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ］ｊ［］－Ｂ－ＢｉｏｈｓｉｃａＡｃｔａＢＢＡｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ２００９１７８８４：８６４８７１．ｙ（），ｐ，（）４９ＳＡＫＡＫＩＢＡＲＡＡＦＵＲＵＳＥＭＳＡＩＴＯＵＭｅｔａｌ．Ｐｏｓｓｉｂｌｅｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆ［］，，，ｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｏｃｃｌｕｄｉｎｉｎｔｉｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＪ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｃｅｌｌｂｉｏｌｏ，ｐｇ［］ｇｙ－１９９７１３７６：１３９３１４０１．？（）－ｕ５０ＡＮＤＲＥＥＶＡＡＹＬＣｅｔａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｒｅｌａｔｅｓｔｈｅ，ＫＲＡＵＳＥＥ，ＭＬＥＲＥ，Ｃ［］ｇｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｏｃｃｌｕｄｉｎＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｉｃａｌｐ［］ｇ－Ｃｈｅｍｉｓｔｒ２００１２７６４２．：３４８０３８４８６ｙ，，８（）５１ＳＩＭＯＮＯＶＩＣＩＲＯＳＥＮＢＥＲＧＪＫＯＵＴＳＯＵＲＩＳＡｅｔａｌ．Ｅｎｔｅｒｏａｔｈｏｅｎｉｃ［］，，，ｐｇＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓａｎｄｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｓｏｃｃｌｕｄｉｎｆｒｏｍｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｔｉｈｔｕｎｃｔｉｏｎｓＪ．ＣｅｌｌｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ２０００２４：３０５３１５．ｇ，，ｊ［］ｇｙ（）［５２］ＺＨＡＮＧＱ．ＬＩＱ，ＷＡＮＧＣ，ｅｔａｌ．ＥｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｃｈａｎｇｅｓｄ－ｉｌＺＯ１ｈｔｉｉｓｔｒｉｂｕｔｏｎｏｆｏｃｃｕｄｉｎａｎｄｉｎｔｉｇｕｎｃｔｉｏｎｍｅｍｂｒａｎｅｍｃｒｏｄｏｍａｉｎｓｉｎｊｃｒｏｂ－ｖｉｖｏＪｉａｌＰａｔｈｏｅｎｅｓｉｓ２０１０４：２．Ｍｉｇ，８ｌ８３４．，［］（）５３ＣＬＡＲＫＥＨＳＯＬＥＲＡＰＭＵＬＬＩＮＪＭ．ＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣａｃｔｉｖａｔｉｏｎｌｅａｄｓｔｏ［］，，ｄｅｈｏｒ－ｐｓｈｏｙｌａｔｉｏｎｏｆｏｃｃｌｕｄｉｎａｎｄｔｉｇｈｔｕｎｃｔｉｏｎｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｉｎｃｒｅａｓｅｉｎＬＬＣＰＫ１ｐｊｐｙ－ｅｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｈｅｅｔｓＪ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ２０００１１３１８：３１８７３１９６．ｐ［］，，）（－５４ＡＬＳＡＤＩＲＢＯＩＶＩＮＭ．ＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃｔｏｋｉｎｅｍｏｄｕａｔｔｅａＭＡＴｌｉｏｎｏｆｅｉｈｌｉｌ［］，，ｙｐ２００９－ｔｉｈｔｕｎｃｔｉｏｎｂａｒｒｉｅｒＪ．ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ１４：２２７７８．ｇ，７６５ｊ［］，５５Ｈ－ＯＺＡＫＩＨＩＳＩＩＫＨＯＲＩＵＣＨＩＨｅｔａｌ．Ｃｕｔｔｉｎｅｄｅ：ｃｏｍｂｉｎｅｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＴＮＦａ［］，？，ｇｇ－ｃａｕｓｅｓｒｅｄｉｕｎｃｔｉｏｎａｌｈｅｉａｎｄＩＦＮｉｓｔｒｉｂｕｔｏｎｏｆａｄｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅｎｈｕｍａｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｙｊ－ｃｅｌｌｓＪ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆ１：５５５５７Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１９９９６３２３．［］，，（）＊ＨＡＮＩＮＫＭＰＤＥＬＵＤＥ－５６ＸＦ，ＲＬ．ＰｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｃｔｏｋｉｎｅｓｃａｕｓｅＮＯｄｅｅｎｄｅｎｔ［］，ｙｙｐ１２４ 四川农业大学博士学位论文参考文献－ｉｔｉｈｉａｎｄｎｄｅｅｎｄｅｎｃｈａｎｇｅｓｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｇｔｕｎｃｔｉｏｎｒｏｔｅｎｓｉｎｐｊｐ－ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｓｈｏｃｋ２００３，１９３：２２９２３７．ｐ，（）［］－－ｉｉｉＭＡＴＹｉｌｔｈｌｌｉｈｉ５７ＡＬＳＡＤＩＲＭ．ＩＬｉｃａｕｓｅｓａｎｎｃｒｅａｓｅｎｎｔｅｓｔｎａｅｉｅｉａｔｔｕｎｃｔｏｎ，ｐｐｇｊ［］－ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００７，１７８（７：４６４１４６４９．［］）［５８］ＤＵＦＦＹＨＳ，ＪＯＨＮＧＲ，ＬＥＥＳＣ，ｅｔａｌ．Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ－－ｔｅｓｃｌａｕ１ａｎｃｏｎｎｅｘｉｉｉｐｒｏｉｎｄｉｎｄｉｎ４３ｂｙｉｎｔｅｒｌｅｕｋｎ１ｂｅｔａｎｐｒｍａｒｙｈｕｍａｎｆｅｔａｌａｓｔｒｏｃｔｅｓＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ２０００２０２３：ＲＣ１１４．ｙ［］，，（）－５９ＹＡＮＧＲＨＡＮＸＵＣＨＴｅｔａｌ．ＩＬ６ｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｏｆｕｔＩＹＡＭＡ，［］，，ｐｇｂａｒｒｉｅｒｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｆｔｅｒｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｓｈｏｃｋａｎｄｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅＪ．Ａｍｅｒｉｃａｎ［］ｏｕｒｎａｏｆｓｏｏ－ａｓｔｒｏ－ＪｌＰｈｙｉｌｇｙＧｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｎｄＬｉｖｅｒＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００３？２８５３：６２１６２９．（）ＨＹＮＥＳｅ－６０ＤＥＳＡＩＴＲＬＥＥＰＥＲＮＪＫＬｔａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ６ｃａｕｓｅｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｂａｒｒｉｅｒ［］，，，ｄｓｆｕｎｃｔｉｏｎｖｉａｔｈｅｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣａｔｈｗａＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｕｒｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈｙｐｐｙ，［］ｇ２００２－１０４２：１１８１２３．，（）６１ＴＵＲＮＥＲＪＲＲＩＬＬＢＫＣＡＲＬＳＯＮＳＬｅｔａｌ．Ｐｈｓｉｏｌｏｉｃａｌｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｉｔｈｅｌｉａｌ，，？ｙｇｇｐ［］－ｔｔｔｔｉｔｈｍｏｓｉｎｌｉｈｔｃｈａｉｎｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎＪ．Ａｍｅｒｉｃａｎｉｇｈｕｎｃｉｏｎｓｉｓａｓｓｏｃｉａｅｄｗｇｐｐｙｊｙ［］－－ＪｏｕｒｎａｌＣｌＰｈｌ１２７３４１１．ｌｏｆＰｈｓｉｏｏｅｌｓｉｏｏ９９７：３７８３８５ｙｇｙｙｇｙ，，（）［６２］ＤＡＵＰＨＩＮＥＥＳＭ，ＫＡＲＳＡＮＡ．Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ［Ｊ］．－ＬａｂｏｒａｔｏｒＩｎｖｅｓｔｉａｔｉｏｎ２００５８６１：９２２．ｙｇ，，（）［６３］ＹＥＤ？ＭＡＴＹ．Ｃｅｌｌｕｌａｒａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｔｈａｔｍｅｄｉａｔｅｂａｓａｌａｎｄｔｕｍｏｕｒ－－ｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒａｉｎｄｕｃｅｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｙｏｓｉｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｋｉｎａｓｅｅｎｅａｃｔｉｖｉｔＪ．ｇｙ［］ｏｕｒｎａＭｏ－ＪｌｏｆＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ２００８１２４：１３３１１３４６．，，（）ＡＬ－－－６４ＳＡＤＩＲＹＥＤＳＡＩＤＨＭｅｔａｌ．ＩＬｌｉｎｄｕｃｅｄｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｉｔｈｅｌｉａｌ［］，，ｐｐ，－－ｔｔＦｔｉｇｈｔｕｎｃｔｉｏｎｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｉｓｍｅｄｉａｅｄｂＭＥＫＫ１ａｃｔｉｖａｉｏｎｏｆｃａｎｏｎｉｃａｌＮｋＢｊｐｙｙ－ａｔｈｗａＪ．ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎｏｕｒｎａｌｏｆａｔｈｏｌｏ２０１０１７７５：２３１０２３２２．ｐｙｆ］ｐｇｙ，，（ｊ）－６５陈华群．诱生型热休克蛋白７０与ＴＲＡＦ６结合抑制ＬＰＳ激活的ＮＦｋＢ信号［］通路Ｄ］．南京：南京师范大学，２００６．［－６６ＣＨＥＮＨＷＵＹＺＨＡＮＧＹｅｔａｌ．Ｈｓ７０ｉｎｈｉｂｉｔｓｌｉｏｏｌｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｎｄｕｃｅｄ，，，ｐｐｐｙ［］－ｔｔｔｅｒａｔｎＡＦ６ｎｄｎｈｔｎｔｓｕｔｎａｔｏｎＮＦｋａａＢａｃｗｉｔｈ．ｐｐｉｖａｉｏｎｂｙｉｎｃｉＴＲａｉｉｂｉｉｇｉｂｉｕｉｉｉＪｇｑ［］ｅ－ＦＥＢＳＬｔｔｅｒｓ２００６５８０１３：３１４５３１５２．，，（）ＡＳＨＷＯＲＴＨＳＬｅ－－６７ＣＡＭＰＯＳＳＢＷＥＡＮＳｔａｌ．ＣｔｏｋｉｎｅｉｎｄｕｃｅｄＦａｃｔｉｎ［］，，，ｙｒｅｏｒａｎｉｚａｔｉｏｎｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｉｎｖｏｌｖｅｓＲｈｏＡａｃｔｉｖａｔｉｏｎＪ．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆｇｆ］－Ｒｅｎａ２００９－５ＰｈｓｉｏｌｏｌＰｈｓｉｏｌｏ２９６３：４８７４９．ｙｇｙｙｇｙ，，（）［６８］ＰＥＮＧＪ，ＨＥＦ，ＺＨＡＮＧＣ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣａｓｉｇｎａｌｓＰ１１５ＲｈｏＧＥＦ１２５ 四川农业大学博士学位论文参考文献ｈｏ－－ｐｈｏｓｐｒｙｌａｔｉｏｎａｎｄＲｈｏＡａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎＴＮＦａｉｎｄｕｃｅｄｍｏｕｓｅｂｒａｉｎｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅａｃｅｌａｒｒｉｅｒｓｆｕｎｃｔｉｏｎＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ２０１１８：２８．ｌｉｌｌｂｄｙ，［，］６９ＳＡＨＶＰＳＥＡＳＨＯＬＴＺＴＭＳＡＧＩＳＡｅｔａＴｒｏｏＲｈｏｔｅ－ｌ．ｈｅｌｅｆｉｎＧｒｏｉｎｃｏｕｌｅｄ，，，［］ｐｐ－ｒｅｃｅｔｏｒｓ．ｉｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＪ．ＳｃｉｅｎｃｅＳｉｎａｌｌｉｎ２０００４０ｌ：４５９４８９ｐｇ［］ｇｇ，，（）７０ＬＩＡＯＪＫ，ＳＥＴＯＭ，ＮＯＭＡＫ．ＲｈｏｋｉｎａｓｅＲＯＣＫｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ［］（）［］２００７－ＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＰｈａｒｍａｃｏｌｏ５０ｌ：１７２４．ｇｙ，，（）７－－１ＵＴＥＣＨＭＩＶＡＮＯＶＡＩＳＡＭＡＲＩＮＳＮｅｔａｌ．ＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＩＦＮａｍｍａｉｎｄｕｃｅｄ［］，，？ｇ－ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓｏｆｔｉｇｈｔｕｎｃｔｉｏｎｒｏｔｅｉｎｓ：ｍｏｓｉｎＩＩｄｅｅｎｄｅｎｔｖａｃｕｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｊｐｙｐｃａａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅｏｅｃｕａｒＢ－ａｉｏｏｏｆｔｈｅｅ１１：５５０５２ｉｌｐｌＪ．ＭｌｌｌｇｙＣｌｌ，２００５６００４０．ｐ［］，（）［７２］ＤＵＦＦＥＹＭＥ，ＨＡＩＮＡＵＢ？ＨＯＳ，ｅｔａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎ－ｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｂｃｙｃｌｉｃＡＭＰＪ．Ｎａｔｕｒｅ１９８１２９４：４５１４５３．ｐｙｙ［］，，７３ＲＡＵＢＴＪ．Ｓｉｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｌｉａｌｃｅｌｌｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｂｒａｉｎｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ［］ｇｇｅｎｄｏｔｈｅａｌｃｅｌｌｔ－ｉｈｔｕｎｃｔｉｏｎｓＪ．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｓｉｏｌｏＣｅｌｌＰｈｓｉｏｌｏｌｉｇｙｇｙｙｇｙ，ｊ［］６２７－１２４９５５０３１９９：．，（）７４ＩＳＨＩＺＡＫＩＴ，ＣＨＩＢＡＨ？ＫＯＪＩＭＡＴ，ｅｔａｌ．ＣｙｃｌｉｃＡＭＰｉｎｄｕｃｅｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆ［］ｃ－ｔ－－－ｌａｕｄｉｎ５ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｉｐｉｔａｅｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｌａｕｄｉｎ５ｅｎｅｉｎｂｌｏｏｄｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒｐｇ－－ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｖｉａｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＡｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎｄｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐａｔｈｗａｙｓＪ．［］Ｅｘｅｒ２９０２２７５－ｉｍｅｎｔａｌＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ２００３：２８８．ｐ，，（）７５ＬＡＷＲＥＮＣＥＤＷＣＯＭＥＲＦＯＲＤＫＭ．ｅｏｆＶＡＳＰｉｎ？ＣＯＬＧＡＮＳＰＲｏｌ［］？＋ｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｉｈｔｕｎｃｔｉｏｎａｓｓｅｍｂｌａｆｔｅｒＣａ２ｓｗｉｔｃｈＪ．Ａｍｅｒｉｃａｎｇｊｙ［］Ｊ－－ｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙＣｅｌｌＰｈｓｉｏｌｏｇｙ２００２２８２６：１２３５１２４５．ｙ，，（）－７６ＰＲＥＺＬＭＩＬＫＷＩＣＺＰＡＨＭＥＤＣＨＯＵＤＨＵＲＹＪｅｔａｌＯｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ？ＭＩＥ９，［］ｔ－ｔ－ｔｔｔｔａｔｔｔｔｉｎｄｕｃｅｓａｃｉｎｃｙｏｓｋｅｌｅａｌａｎｄｉｇｈｕｎｃｉｏｎａｌｌｅｒａｉｏｎｓｉｎｈｅａｏｃｅｓｂａｊｐｙｙ＋２ａ－ｄｅｅｎｄｅｎＰＫＣ－Ｃｔ，ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｃｈａｎｉｓｍ：ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆＰＫＡＪ．ＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌｐ［］Ｂ－ｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ２００６４０１１：２００５２０１７．，，（）＋＋２２７７ＧＡＮＶ－ｔ－ｔＩＴＫＥＶＩＣＨＶＨＡＳＳＥＰＦＩＴＺＥＲＧ．ＣａｄｅｅｎｄｅｎａｎｄＣａｉｎｄｅｅｎｄｅｎ［］，，ｐｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｕｓｃｌｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＣｅｌｌ［］Ｍｏ２００２２３ｌ－ｔｉｌｉｔｙ？：４７５２．，（）７８ＬＥＵＮＧＴｅ－ＤＯＮＧＪＭＭＡＮＳＥＲＥｔａｌ．ｃＡＭＰｉｎｄｕｃｅｄｍｏｒｏｌｏｉｃａｌｃｈａｎｅｓａｒｅ［］５，５ｐｈｇｇｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｅｄｂｙｔｈｅａｃｔｉｖａｔｅｄＲｈｏＡｓｍａｌｌＧＴＰａｓｅａｎｄｔｈｅＲｈｏｋｉｎａｓｅＲＯＫａ［Ｊ］．Ｂ－ＪｏｕｒｎａｌｏｆｉｏｌｏｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ１９９８２７３３５：２２５５４２２５６２．ｇｙ，，（）ＩＡＯＪＨＵＡＮＧＦＬＵＭＨ．ＰＫＡｉｎｈｉｂｉｔｓＲｈｏＡａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ａｒｏｔｅｃｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍ７９］Ｑ，，ｐ［－ａｇａｉｎｓｔｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｒｒｅｒｓｆｕｎｃｔｏｎＪ．ＡｍｅｒｃａｎｏｕｒｎａｏｆＰｈｓｏｏＬｕｎｌｂａｉｄｙｉｉＪｌｙｉｌｇｙｇ［］Ｃｅ２００３２８４６９７２－９８０ｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈｓｉｏｌｏ：．ｙｇｙ，，（）１２６ 四川农业大学博士学位论文参考文献［８０］ＫＡＷＥＤＩＡＪＤ，ＪＩＡＮＧＭ，ＫＵＬＫＡＲＮＩＡ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＡｐａｔｈｗａｙ－ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｔｏＨｇ２＋ｉｎｄｕｃｅｄａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｎｄｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｏｃｃｌｕｄｉｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｉｇｈｔｕｎｃｔｉｏｎｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｏｆｊｐｙｓａｌｉｖａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ｜＾Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＴｈｅｒａｅｕ－ｔｉｃｓ２００８３２６：８３７．ｐ，３８２９，（）ＡＲ－８１ＬＩＰＳＣＨＵＴＺＪＨＬＩＳＩＳＣＯＡｅｔａｌ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｎａｌｒｅｕｌａｔｅｄｋｉｎａｓｅｓ１／２［］，，，ｇｇ－－ｃｏｎｔｒｏｌｃｌａｕｄｉｎ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＭａｄｉｎＤａｒｂｙｃａｎｉｎｅｋｉｄｎｅｙｓｔｒａｉｎＩａｎｄＩＩｃｅｌｌｓＪ．［］ｕｒｎａ２００５５－ＪｏｌｏｆＢｉｏｌｏｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ２８０：３７８０３７８８．ｇｙ，，（）［８２］ＫＲＩＺＢＡＩＩＡ，ＢＡＵＥＲＨ，ＢＲＥＳＧＥＮＮ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｏｎｔｈｅｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｏｔｅｉｎｓｏｆｃｕｔｅａｅｎｄｏｔｈｅｌｉａ．ｅｌａｒａｎｄｏｌｕｒｅｄｃｒｅｂｒｌｌｃｅｌｌｓＪＣｌｕｌＭｌｅｃｕｌａｒｊｐ［］ｅｕｏｂ－Ｎｒｉｏｌｏｇｙ２００５，２５１：１２９１３９．，（）－ＣＧＯＳＨＩＭＡＴＡＬＥＸＡＮＤＥＲＢｅｔａｌ．Ｈ〇ｅｒｍｅａｂｉｔ８３ＫＥＶＩＬｍｅｄｉａｔｅｄｌｉ：ｒｏｌｅ，，，２２ｐ［］ｙＡｍｅｒ－ｏｆＭＡＰＫａｎｄｏｃｃｌｕｄｉｎＪｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｓｉｏｌｏＣｅｌｌＰｈｓｉｏｏ．ｙｇｙｙｌｆ］ｇｙ，２０００－２７９：２１３０．ｌ，（）－ＴＮＦ－８４ＡＬＳＡＤＩＲＧＵＯＳＹＥＤｅｔａｌ．ａＭｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆＩｎｔｅｓｔｉｎａｌＥｉｔｈｅｌｉａｌＴｉｈｔ，，，ｇ［］ｐ－ＪｕｎｃｔｉｏｎＢａｒｒｉｅｒＩｓＲｅｇｕｌａｔｅｄｂｙＥＲＫ１／２ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＥｌｋ１Ｊ，ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ［］ａ－ｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｏｌｏｇｙ２０１３１８３６：！８７１１８８４．ｐ，，（）ｊＬ－８５ＧＯＯＤＭＡＮＲＩＮＹＥＡＧＥＤＤＩＳＭＳｅｔａｌ．Ｅｘｔｒｅｍｅｌｌｏｗｆｒｅｕｅｎｃ］？，，ｙｙ［ｑｅｌｅｃｔｒｏｍａｎｅｔｉｃｆｉｅｌｄｓａｃｔｉｖａｔｅｔｈｅＥＲＫｃａｓｃａｄｅｉｎｃｒｅａｓｅｈｓ７０ｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓａｎｄｇ，ｐｐｒｏｍｏｔｅｒｅｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎＰｌａｎａｒｉａＪ．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＲａｄｉａｔｉｏｎＢｉｏｏｇ［］ｌｐｇｙ，２００９－８５１０：８５１８５９．，（）－８６贾刚．２，王康宁，邓秋红胰高血糖素样肽促进细胞增殖，抑制细胞凋亡的分子［］２２－机制［Ｊ］．动物营养学报２０１００４：８３０８３９．，，（）［８７］ＰＥＴＥＣＣＨＩＡＬ，ＳＡＢＡＴＩＮＩＦ，ＵＳＡＩＣ，ｅｔａｌ．ＣｙｔｏｋｉｎｅｓｉｎｄｕｃｅｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎｄＥＧＦＲ－－ｉｓａｓｓｅｍｂｌｉｎａｉｒｗａｃｅｌｌｓｖｉａａｎｄｅｅｎｄｅｎｔＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２ａｔｈｗａＪｙｙｐｐｙ．［］Ｌ－ａｂｏｒａｔｏｒＩｎｖｅｓｔｉａｔｉｏｎ２０１２９２８：１１４０１１４８．ｙｇ，，（）ＬＩＮｔｔ－８８ＮＥＵＪ．ＧｌｔｉｔｔｉｔｈｔｔＰＩ３ＫＡｋｔｌｕａｍｉｎｅｄｅｒｉｖａｉｏｎａｅｒｓｎｅｓｎａｌｉｕｎｃｉｏｎｓｖｉａａ／［］，ｐｇｊ－ａ－ｍｅｄｔｅｄａｔｈｗａｉｎＣａｃｏｌｌｓ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｎｕｔｒｉｔｉｏｎ２００９１３９４：７１０１ｉｙ２ｃｅ［Ｊ］７４．ｐ，，（）８９ＷＲＯＢＬＥＷＳＫＩＬＥＳＨＥＮＬＯＧＤＥＮＳｅｔａｌ．ＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｌｏｒｉＤｓｒｅｕｌａｔｏｎｏｆ，，，ｙｙｇｉ［］ｐＧａｓｔＴｉｔｔｅａｓｅ－ｔｔｔｒｉｃＥｉｈｅｌｉａｌｇｈＪｕｎｃｉｏｎｓｂｙＵｒＭｅｄｉａｔｅｄＭｏｓｉｎＩＩＡｃｉｖａｉｏｎＪ．ｐｙ［］ｅｎ－Ｇａｓｔｒｏｔｅｒｏｌｏｇｙ１３６１：２３６２４６．，２００９，（）－－ｌ．ｋＢａｒｅ９０ＨＥＦＰＥＮＧＪＤＥＮＧＸＬｅｔａＲｈｏＡａｎｄＮＦｉｎｖｏｌｖ，，，ｅｄｉｎ［］－ａａｔｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｎｄｕｃｅｄｂｒａｉｎｍｉｃｒｏｖｓｃｕｌｒｃｅｌｌｌｉｎｅｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｙＪ．［］１２７ 四川农业大学博士学位论文参考文献Ｎｅｕｒｏ５－４７ｓｃｉｅｎｃｅ２０１１，１８８：３．，９１ＨＥＤＥＭＡＮＮＭＳＪＥＮＳＥＮＢＢ．Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓｉｎｅｎｚｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｎｓｔｏｍａｃｈａｎｄ［］，ｙｙｐａｎｃｒｅａｔｉｃｔｉｓｓｕｅａｎｄｄｉｇｅｓｔａｉｎｐｉｇｌｅｔｓａｒｏｕｎｄｗｅａｎｉｎｇ［Ｊ］．ＡｒｃｈＡｎｉｍＮｕｔｒ，２００４５８４７－１：５９．，（）９２ＰＬＵＳＫＥＪＲＨＡＭＰＳＯＮＤＪ，ＷＩＬＬＩＡＭＳＩＨ．Ｆａｃｔｏｒｓｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄ［］，ｇｆｉｉｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅｉｎｔｈｅｗｅａｎｅｄｉ：ａｒｅｖｉｅｗＪ，ＬｉｖｅｓｔＰｒｏｄＳｃｉｐｇ，［］－－１９９７５１ｌ３：２１５２３６．，（）［９３］ＬＩＵＸ，ＮＥＬＳＯＮＤＷ，ＨＯＬＳＴＪＪ，ｅｔａｌ．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌｅｎｔｅｒａｌ－ｎｕｔｒｉｅｎｔｓａｎｄｅｘｏｇｅｎｏｕｓｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ２ｏｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｄａｐｔａｔｉｏｎｉｎａｒａｔｍｏｄｅｌｏｆｓｈｏｒｔｂｏｗｅｌｓｙｎｄｒｏｍｅ［Ｊ］．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，５－２００６８４：１１４２１１５０．，（）９４ＰＥＴＥＲＳＥＮＹＭ？ＨＡＲＴＭＡＮＮＢ，ＨＯＬＳＴＪＪ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｅｎｔｅｒａｌｆｏｏｄ［］－ｃｅａｓｅｓ－ＬＰｔｌａｓｍａＬＰ２ａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｓＧ２ｒｅｃｅｏｒｍＲＮＡａｂｕｎｄａｎｃｅｄｕｒｉｎｉｉｎｒｐＧｐｇｐｇｔｔｏｎ２００３１－ｄｅｖｅ：１ｌｏｍｅｎｔＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｕｒｉｉ３３６７８１１７８６．ｐ，，［］（）ｃａｏｎ－ｅｅｔｅｓ９５ＤＲＵＣＫＥＲＤＪ：ｒｅｕａｏｒｓｏｆｃｅｒｏｅｒａｔｏｎ．Ｇｌｕｇｌｉｋｐｐｉｄｇｌｔｌｌｌｉｆｉ［］ｐ，－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄａｏｔｏｓｉｓＪ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ，２００３，１７２：１６１１７１．，ｐｐ［］ｇｙ（）９６ＬＩＵＹ，ＨＵＡＮＧＪ，ＨＯＵＹ，ｅｔａｌ．Ｄｉｅｔａｒｙａｒｉｎｉｎｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎａｌｌｅｖｉａｔｅｓ［］ｇｔｔｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｌｉｏｏｌａｃｃｈａｉｉｎｉｎｔｅｓｉｎａｌｍｕｃｏｓａｌｄｉｓｒｕｐｉｙＥｐｐｙｓｒｄｅｕｒｎａ－ｗｅａｎｅｄｓｔＢｒｉｔｉｓｈｌｏｆＮｕｔｒｉｉｏｎ２００８１００３：５５２５６０．ｐｉｇＪ．ｈｅＪｏｔ，［］，（）ＺＨＵＨＬＬＩＵＹＬＸＩＥＸＬｅｔａＥｏｆＬ－ｔｔ９７，，，ｌ．ｆｆｅｃｔａｒｇｉｎｉｎｅｏｎｉｎｅｓｉｎａｌｍｕｃｏｓａｌ［］ｔｅａｎｅｄｓａｅＥｓｃｈｅｒｃｃｏＬＰＳｃｈａｅｎｅｉｍｍｕｎｅｂａｒｒｉｅｒｆｕｎｃｉｏｎｉｎｗｐｉｇｆｔｒｉｈｉａｌｉｌｌｇＪ．［］ＩｔＩ－ｎｎａｅ２０１３１９３：２４２２５２ｍｍｕｎ．，，（）９８ＪＬＯＴＳＰＥＩＣＨＦＪＫＲＡＵＳＥＲＦ．ＰｒｅａｒａｔｉｏｎａｎｄｒｏｅｒｔｉｅｓｏｆＭＯＦＦＡＤ，，ｐｐｐ［］－ｒｏｍｒａｔｅｓｔｎａｍｕｃｏｓａｏｕｒｎａｏｆｏｏｃａｒｅｔｉｎａｌｏｘｉｄｉｚｉｎｇｅｎｚｙｍｅｆｉｎｔｉｌＪ．ＪｌＢｉｌｇｉｌ［］－Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９７０２４５２：４３９４４７．？，（）９９ＫＩＫＭＪＰＯＥＬＡｅｔａｌ．Ｐａｔｈｏｌｏｉｃｃｈａｎｅｓｏｆｔｈｅｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ，ＨＵＩＳＭＡＮ，，ｇｇ［］Ｐｈａｓａｎ．ＶｔｍｕｃｏｓａｏｆｉｓａｆｔｅｒｆｅｅｄｉｎｓｅｏｌｕｓｖｕｌａｒｉｂｅｓＪｅｔｅｒｉｎａｒＰａｈｏｌｏｐｇｇｇ［］ｙｇｙ，２７５－１９９０：３２９３３４．，（）［１００］ＨＩＲＯＴＡＮＩＹ，ＹＡＭＡＭＯＴＯＫ，ＩＫＥＤＡＫ，ｅｔａｌ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｐｌａｓｍａ－ｅｅｓａｎｒｏｅｒａｔｖｅｍａｋｅｒｓｎｓｍａｎｔｅｓａｎｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ２ｌｖｌｄｐｌｉｆｉｉｌｌｉｔｉｎｌｉｎｕｒｉｊｙｒａｔｓｉｎｄｕｃｅｄｂｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅａｄｍｉｎｓｔｒａｔｏｎＪ．ＢｏｌｏｉｃａａｎｄａｒｍａｃｅｕｔｃａｙｉｉｉｇｌＰｈｉｌ［］－２３３０Ｂｕｌｅｔｉｎ１：２．ｌ２００６２９１３２７，，（）－１ＶＡＮＢＥＥＲＮＡＢＵＵＲＳＭＡＬｅｔａ１０ＳＳＣＨＲＥＵＲＳＨＭＧＪＶＥＬＬＥＮＧＡｌ．，，，［］Ｗｅａｎｉｎｇａｎｄｔｈｅｗｅａｎｌｉｎｇｄｉｅｔｉｎｆｌｕｅｎｃｅｔｈｅｖｉｌｌｏｕｓｈｅｉｇｈｔａｎｄｃｒｙｐｔｄｅｐｔｈｉｎｔｈｅ１２８ 四川农业大学博士学位论文参考文献－ｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅｏｆｉｓａｎｄａｌｔｅｒｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｓｈｏｒｔｃｈａｉｎｆａｔｔａｃｉｄｓｉｎｔｈｅｐｇｙ－ｔｅｓｔｏｏｄｎａｌｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎ１１：ｌａｒｅｉｎｉｎｅａｎｄｂｌＪ，Ｊｏｕｒ，９９８２８６９４７９５３．ｇ，［］（）２ＤＲＵＣＫＥＲＤＩＣＨｅｔａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｉｔｈｅｌｉａｌ１０Ｊ，ＥＲＬＰ，ＡＳＡＳＬ，ｐ［］－ｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｂｙｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ２Ｊ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡｐｇ［］，１９９６９３７９１１—１５：７９１６，（）１０３ＮＩＦＮＩＫＯＳＫＩＨ，ＳＴＯＬＬＢ，ＧＵＡＮＸ，ｅｔａｌ．Ｏｎｓｅｔｏｆｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｔｒｏｈｉｓ［］ｐｙａｓｓｏｃｔｅｔｃｅｄｎｔｅｓｔｉｎａｌｏｏｄｏｗｎＴＰＮ－ｎｅｏｎａｔａｔｏｕａｉａｄｗｉｈｒｅｄｕｉｂｌｆｌｉｆｅｄｌｐｉｇｌｅｓＪ．Ｊｒｎｌ［］ｏｆｕ－ｔｒｔｉｏｎ１：４６７１Ｎｉ２００４３４６１４７４．，，（）１０４ＢＲＥＭＨＯＬＭＬ，ＨＯＲＮＵＭＭ，ＡＮＤＥＲＳＥＮＵＢ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆ［］Ｇ－－ｔｏｄｌｕｃａｏｎＬｉｋｅＰｅｐｔｉｄｅ２ｏｎｍｅｓｅｎｅｒｉｃｂｌｏｆｌｏｗａｎｄｃａｒｄｉａｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｉｎｇ－－－ｅｎｄｅｕｎｏｓｔｏｍｓｈｏｒｔｂｏｗｅｌａｔｉｅｎｔｓＪ．ＲｅｇｕｌａｔｏｒＰｅｔｉｄｅｓ２０１１１６８ｌ３：３２３８．ｊｙｐ［］ｙｐ，，（）ｊ－１０５ＨＡＮＳＥＮＬＢ．ＧＬＰ２ａｎｄｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｂｌｏｏｄｆｌｏｗＪ．ＤａｎｉｓｈＭｅｄｒｎａｉｃａｌＪｏｕｌ，［］［］２０１３Ｓ６０５：Ｂ４６３４．（）ＡＮＧＲ－１０６ＢＵＲＲＩＮＤＳＴＯＬＬＢＪＩｅｔａｌ．ＧＬＰ２ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｒｏｗｔｈｉｎ［］，，，ｇｒｅｍａ－ｐｔｕｒｅＴＰＮｆｅｄｐｉｇｓｂｙｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ－Ｇａｓｔｒｏ１ｉｎｔｅｓｔＬｉｖｅｒＰｈｓｉｏｌ２０００２７９６：２４９１２５６．ｙ，，（）０７ＣＵＶ－ｔ１ＩＥＲＰＲＥＳＡ，ＫＥＳＴＥＭＯＮＴＰ．Ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｏｆｓｏｍｅｄｉｅｓｉｖｅｅｎｚｍｅｓｉｎ［］ｐｇｙＥｕｒａｓｉａｎｐｅｒｃｈｌａｒｖａｅＰｅｒｅａｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ［Ｊ］．ＦｉｓｈＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００－１２４４：２７９２８５．，（）１０８ＬＩＵＷＨＵＯＨｅｔａ．ＩｔＡＰｈｔＨＵＤｌｎｅｓｔｉｎａｌｌｋａｌｉｎｅｏｓｈａａｓｅＲｅｕｌａｔｅｓＴｉｈｔ［］，，，ｐｇｇＪｕｎｃｔｔＬ．ｉｏｎＰｒｏｅｉｎｅｖｅｌｓＪＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｏｌｌｅｅｏｆＳｕｒｅｏｎｓ［］ｇｇ，２２２－２０１６６：１００９１０１７．，（）１０９ＭＡＮＯＨＡＲＡＮＰＧＡＹＡＭＳＡＲＴＨＵＲＳｅｔａｌ．Ｃｈｒｏｎｉｃａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｖｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆ，，，［］－ｂａｓｏｔＫ－ＡＴＰａｔＮｌａｅｒａｌｍｅｍｂｒａｎｅＮａｓｅｕｎｉｑｕｅｌｙｒｅｇｕｌａｅｓｂｒｕｓｈｂｏｒｄｅｒｍｅｍｂｒａｎｅａａｂｓｏｒｔｏｎｅｓｔｎａｌｅｉｔＡｍｅｒ－ｉａｃｅｌｓｃａｎｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｓｏｏｅｐｉｉｎｉｎｔｉｐｈｅｌｌｌＪ．ｉＪｙｉｌｇｙＣｌｌ［］ｓ－Ｐｈｙｉｏｌｏ２０１５３０８８：６５０６５６．，ｇｙ，（）１１０ＭＥＩＳＴＥＲＡ．ＯｎｔｈｅｅｎｚｍｏｌｏｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｔｒａｎｓｏｒｔＪ．Ｓｃｉｅｎｃｅ［］ｙｇｙｐ［］，－１９７３１８０４０８１．：３３３９？（）－－１１１ＣＯＴＴＲＥＬＬＪＳＴＯＬＬＢＢＵＤＤＩＮＧＴＯＮＲｅｔａｌ．Ｇｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２ｒｏｔｅｃｔｓ，，，［］ｇｐｐｐａａ－ｔｔｇｉｎｓｔＴＰＮｉｎｄｕｃｅｄｉｎｅｓｉｎａｌｈｅｘｏｓｅｍａｌａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｉｎｅｎｔｅｒａｌｌｙｒｅｆｅｄｉｇｌｅｔｓＪ．ｐ［］ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：ＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｎｄＬｉｖｅｒＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２９０－３００２００６２：２９３．，（）－－１１ＬＵｅｔａ－２ＧＵＡＮＸＳＴＯＬＬＢＸｌＬＰ２ｍｅｄｉａｔｅｄｕｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆｎｔｅｓｔｉｎａｏｏｄ．Ｇｉｌｂｌ［］，，，ｐｇ－－ｆｌｏｗａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｕｐｔａｋｅｉｓｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｉｎＴＰＮｆｅｄｐｉｇｌｅｔｓＪ．［］１２９ 四川农业大学博士学位论文参考文献ｓ１１－１Ｇａｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００３１２５：３６４７．，（）１ＩＷＵＤＥＮＧＢｅｔａＰａｔｅｄｏｒｃｎｅｌｕｃａｏｎ－ｅｅｔｅ－ｒｏｖｅ１３ＫＫＪｌ．ＥＧｌｉｌｉｋｉｄ２ｉｍｐｄ［］Ｑ，，，ｙｐｇｇｐｐｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｄｉｇｅｓｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｅｖｅｎｔｅｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｏｆｗｅａｎｉｎｇｐｉｇｌｅｔｓｃｈａ－ｌｅｄｗｔＪＡｎｉｍａｌ２０１５９：１４８１１４８９．ｌｅｎｇｉｈＬＰＳ．，，９）［］（ＭＤＷＭＵＲＡＬＩＧｔＥｘｏｌ－１１４ＫＯＯＰＭＡＮＮＣＮＥＬＳＯＮＳｅａｌ．ｅｎｏｕｓｕｃａｏｎｌｉｋｅ？？，ｇｇｇ［］－ｅ－－ｐｐｔｉｄｅ２Ｐ２ａｕｇｍｅｎｔｓＧＬＰ２ｒｅｃｅｐｔｏｒｍＲＮＡａｎｄｍａｉｎｔａｉｎｓｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ（ＧＬ）ｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｉｎｒｅｓｅｃｔｅｄｒａｔｓ［Ｊ］．ＪＰＥＮ：ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｒｅｎｔｅｒａｌａｎｄＥｎｔｅｒａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，－２００８３２３：２５４２６５．，（）［１１５］ＫＡＪＩＴ，ＴＡＮＡＫＡＨ，ＨＯＬＳＴＪＪ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎｓｉｎｄｏｓｅａｎｄｍｅｔｈｏｄ－ｏｆａｄｍ．ｉｎｓｔｒａｔｏｎｏｎｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉ２ａｃｔｉｖｉｔｉｎｔｈｅｒａｔＪＥｕｒｏｅａｎＪｏｕｒｎａｏｆｉｉｇｌｇｐｐｄｅｙｐｌ［］－－Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ２００８５９６１３：１３８１４５．ｇｙ，，（）１１ＴＡＮＧ－－６ＣＨＲＩＳＴＥＮＳＥＮＭ．ｒｏｌｕｃａｏｎｄｅｒｉｖｅｄ，ＬＡＲＳＥＮＰＪ，ＴＨＵＬＥＳＥＮＪＴｈｅｐ［］ｇｇｅｔ－ｔ－ｔｒｔｔｔｉｄｅｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｉｄｅ２ｉｓａｎｅｕｒｏａｎｓｍｉｅｒｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｈｅｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｐ，ｇｇｐｐ，ｇ－ｆｏｏｄｉｎｔａｋｅＪ，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０００６７：８０２８０７．［］，（）Ｇ－－１１７ＤＡＬＶＩＰＳＢＥＬＳＨＡＭＤＤｌｕｌｉｋｔ２ｄｉｔ．ｃａｏｎｅｅｉｄｅｒｅｃｔｌｒｅｕｌａｅｓ，ｇｐｙｇ［］ｐｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃｎｅｕｒｏｎｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓｌｉｎｋｅｄｔｏａｐｐｅｔｉｔｅｃｏｎｔｒｏｌｉｎｖｉｖｏａｎｄ－１２３９７ｉｎｖｉｔｒｏＪ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０１２，５３（５）：２３８５．［］１１８ＨＯＮＤＡＫＳＡＮＥＹＡＳＵＴＳＨＩＭＡＴＡＮＩＴｅｔａｌ．Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ，，，［］－－ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｃｈｉｃｋｅｎｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２ｏｔｅｎｔｌｓｕｒｅｓｓｅｓｆｏｏｄｉｎｔａｋｅｉｎｇｇｐｐｐｙｐｐＪ－ｃｈｉｃｋｓ．ＡｎｉｍＳｃｉＪ２０１５８６３：３１２３１８．［］？（）１１９ＢＡＬＤＡＳＳＡＮＯＳ，ＢＥＬＬＡＮＣＡＡＬＳＥＲＩＯＲ，ｅｔａｌ．Ｆｏｏｄｉｎｔａｋｅｉｎｌｅａｎａｎｄｏｂｅｓｅ［］，ｅｒｅｒａｍｎｓｔｒａｔｏｎｏｆｕｃａｏｎ－ｅｅｔｅｎａｏｆｍｉｃｅａｆｔｅｒｐｉｐｈｌａｄｉｉｉｇｌｇｌｉｋｐｐｉｄ２Ｊ．Ｊｏｕｒｌ［］ｄｏｃｒ－２８４Ｅｎｉｎｏｌｏ２０１２２１３３：２７７．ｇｙ，，（）１２０ＳＣＨＭＩＤＴＰＴＮＡＳＬＵＮＤＥＧＲＹＢＡＣＫＰｅｔａｌ．Ｐｅｒｉｈｅｒａｌａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆ［］，？？ｐ－ＪＲＧＬＰ２ｔｏｈｕｍａｎｓｈａｓｎｏｅｆｅｃｔｏｎａｓｔｒｉｃｅｍｔｉｎｏｒｓａｔｉｅｔ．ｅｕｌａｔｏｒＰｅｔｉｄｅｓｇｐｙｇｙ，［］ｇｙｐ２００３－－２５１１６ｌ３：２１．９（）ＳＯＲＥＮＳＥＮＬＢＦＬＩＮＴＡＲＡＢＥＮＡｅｔａｌ．Ｎｏｅｆｅｃｔｏｆｈｓｉｏｌｏｉｃａｌ１２１，，，ｙｇ［］ｐｕｃａ－ｅｅ－ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｇｌｏｎｌｉｋｐｐｔｉｄｅ２ｏｎａｅｔｉｔｅａｎｄｅｎｅｒｇｙｉｎｔａｋｅｉｎｎｏｒｍａｌｇｐｐｗｅｉｇｈｔｓｕｂｊｅｃｔｓ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｂｅｓｉｔｙａｎｄＲｅｌａｔｅｄＭｅｔａｂｏｌｉｃＤｉｓｏｒｄｅｒｓ，２００３２７４４５０－４５６：．，（）１２２ＬＡＬＬＳＪＰＢＯＵＤＲＹＧＦＡＶＩＥＲＣｅｔａｌ．Ｇｕｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｏｕｎｇ［］，？，ｙＲ５３４－ｉｓ：ｈｓｉｏｌｏＪ．Ａｎｉｍａｌｅｓｅａｒｃｈ２００４：３０１３１６．ｐｇｐｙｇｙ，，（）［］ＷＡＬＬＡＣＥＬ－－１２３ＭＡＲＴＩＮＧＨＡＲＴＭＡＮＮＢｅｔａｌ．ＮｕｔｒｉｅｎｔｓｔｉｍｕｌａｔｅｄＧＬＰ２［？，，］ｒｅｌｅａｓｅａｎｄｃｒｙｐｔｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｈｏｒｔｂｏｗｅｌｓｙｎｄｒｏｍｅＪ．［］１３０ 四川农业大学博士学位论文参考文献Ａｍｅｒ－ｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｎｄＬｉｖｅｒＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００５５１３１－４３８：４３．９（）２４ＬＥＢ－Ｍ１ＩＩＪＷＡＮＧＸ，ｅｔａｌ．ＧＬＰ２ＰｒｅｖｅｎｔｓＩｎｔｅｓｔｉｎａｌｕｃｏｓａｌＡｔｒｏｈａｎｄ［］Ｑ？，ｐｙＩｍｐｒｏｖｅｓＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＣａｐａｃｉｔｙｉｎａＭｏｕｓｅＭｏｄｅｌｏｆＴｏｔａｌＰａｒｅｎｔｅｒａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ，２０１６，８（１）：３３．ＲＥＮ－Ａｔｔ－ＩＮＬＩＵＢＷＷＺｅｔａｌ．ＧＬＰ２ｅｎｕａｔｅｓＬＰＳＩｎｄｕｃｅｄＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎ［１２５Ｌ，，，］－－ＢＶ２ＣｅｌｌｓｂＩｎｈｉｂｉｔｉｎＥＲＫ１／２ＪＮＫ１／２ａｎｄＮＦｋａａＢＳｉｎａｌｉｎＰａｔｈｗａｓＪ．Ｉｎｔｙｇ，ｐｐｇｇｙ［］ＪＭｏ：ｌＳｃｉ２０１６１７２１９０．，，（）－１２６ＮＡＫＡＭＥＫＫＡＪＩＴＭＵＫＡＩＭｅｔａｌ．Ｔｈｅｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｎｄａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒ，，，ｐｙ［］－－ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２ｉｎａｎｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｒａｔｍｏｄｅｌｏｆｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇｐｐｐ－ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｓＪ．Ｐｅｔｉｄｅｓ２０１６７５：１７．［］ｐ，，ＲＲＳＴＡ－１２７ＩＴＵＩＮＯＪ，ＣＡＭＩＬＬＥＲＩＭ，ＡＣＯＡ，ｅｔａｌ．ＡｃｕｔｅＥｆｅｃｔｓｏｆａＧｌｕｃａｇｏｎＬｉｋｅ［］Ｐｅｐｔｉｄｅ２Ａｎａｌｏｇｕｅ，Ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ，ｏｎＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌＭｏｔｏｒＦｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｉｎＡｄｕｌｔＰａｔｉｅｎｔｓＷｉｔｈＳｈｏｒｔＢｏｗｅｌＳｙｎｄｒｏｍｅｏｎＨｏｍｅＰａｒｅｎｔｅｒａｌｒｔｏｎＪｏｕｒｎａｔ－ｉｌｏｆＰａｒｅｎｔｅｒａｌａｎｄＥｎｔｅｒａｌＮｕｒｉｔｉｏｎ２０：１Ｎｕｔｉ．Ｊ，１６４０８１０８９０９５．［］，（）［１２８］ＭＣＫＡＹＤ？ＢＡＩＲＤＡ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙａｎｄｉｏｎ－ｔｒａｎｓｏｒｔ．Ｇｕｔ１９９９４４２：２８３２８９．ｐ＾］，，（）ＷＡＮＧＬ－１２９ＨＯＵＹＺＨＡＮＧＷｅｔａｌ．ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＮａｃｅｔｌｃｓｔｅｉｎｅｏｎ［］，，，ｙｙｎｔｅｓｔｉｎａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｉｌｅｔｓｃｈａｌｌｅｎｅｄｗｉｔｈｌｉｏｏＩｓａｃｃｒｉｄｅ．ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓｉｐｇｇｐｐｙｈａＪ，［］２０－２１２４３３：１２３３１２４．？（）－１３０ＰＦＡＦＦＬＭＷ．Ａｎｅｗｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌｍｏｄｅｌｆｏｒｒｅｌａｔｉｖｅｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｒｅａｌｔｉｍｅ［］ｑ－Ｊ２００２９４．ＲＴＰＣＲ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１９：ｅ５［］，，（）－－１ＪＺＨＡＮＧＲ．Ｃｈａｎｅｓｏｆ３１ＲＵＡＮＰｌａｓｍａＤｌａｃｔａｔｅｄｉａｍｉｎｅ［，ＧＯＮＧＺ，Ｑｇｐ），］（ｏｘｉｄａｓｅａｎｄｅｎｄｏｔｏｘｉｎｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｌｉｖｅｒｃｉｒｒｈｏｓｉｓＪ．Ｈｅａｔｏｂｉｌｉａｒ＆Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ［］ｐｙｓｅａｓｅｓ－ＤｉＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ２００４３１：５８６１．，，（）ＩＫＯＢＡＹＡＳＨＩＭＤＡＢＡＮＡＫＡＫｔＤ１３２ＦＵＫＵＤＯＭＥｅａｌ．ｉａｍｉｎｅｏｘｉｄａｓｅａｓａ［］，，，ｍａｒｋｅｒｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａｌｉｎｕｒａｎｄｔｈｅｅｆｉｆｅｃｔｏｆｓｏｌｕｂｌｅｄｉｅｔａｒｆｉｂｅｒｏｎｊｙｙ－ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔｔｏｘｉｃｉｔｙａｆｔｅｒｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ５ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎｒａｔｓＪ．［］－Ｍｏｌｅｃｕ．ｅｄｉｃａｌａｒＭｏｒｈｏｌｏ２０１４４７２：１００１０７Ｍｌｐｇｙ，，（）１３３ＬＵＫＧＤ，ＢＡＹＬＥＳＳＴＭ，ＢＡＹＬＩＮＳＢ．Ｐｌａｓｍａｐｏｓｔｈｅｐａｒｉｎｄｉａｍｉｎｅｏｘｉｄａｓｅ．［］Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｏｖｏｃａｔｉｖｅｔｅｓｔｆｏｒｕａｎｔｉｔａｔｉｎｌｅｎｔｈｏｆａｃｕｔｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａｌｉｎｕｒｉｎｐｑｇｇｊｙ－ｔｒａｔ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａＩｎｖｅｓｔａｔｉｏｎ：１１１ｈｅＪｌｉｇ１９８３７１５３０８３５．［］，，（）－Ｄ－ＩＲｔ．ｔＩ１３４ＡＬＳＡ，ＧＵＯＳ９ＹＥＤ，ｅａｌＴＮＦａＭｏｄｕｌａｉｏｎｏｆｎｔｅｓｔｉｎａｌＴｉｈｔＪｕｎｃｔｉｏｎ［］ｇＰ－－ｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙＩｓＭｅｄｉａｔｅｄｂｙＮＩＫ／ＩＫＫａＡｘｉｓＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣａｎｏｎｉｃａｌＮＦｋＢ１３１ 四川农业大学博士学位论文参考文献－ＰａｔｈｗａＪ．ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎｏｕｒｎａｏｆａｔｈｏｏ２０１６１５：１１５１１１５．ｙｌｌ８６６ｐｇｙ，，［］ｊ（）ＪＹＵＳＴＡ－ＢＢＯＵＳＨＥＹＲＰｔＨ２２１３５ＤＲＵＣＫＥＲＤ，，，ｅａｌ．ｕｍａｎＧｌＧＬＰｒｅｄｕｃｅｓｔｈｅ］［ｙ］［ｓｅｖｅｒｉｔｙｏｆｃｏｌｏｎｉｃｉｎｕｒｉｎａｍｕｒｉｎｅｍｏｄｅｌｏｆｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｌｉｔｉｓＪ．Ａｍｅｒｉｃａｎｊｙｐ［］－－ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｓｉｏｌｏＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｎｄＬｉｖｅｒＰｈｓｉｏｌｏ１９９９２７６１：７９９１．ｙｇｙｙｇｙ，，（）－ＡＤＩＲｔｔ１３６］ＧＵＯＳ，ＮＩＧＨＯＴＭ，ＡＬＳ，ｅａｌ．Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｎｅｓｔｉｎａｌ［ｔｔｃｏｎｅｒｍｅａｂｔｓｍｅｔｅｔｒｓｎａｔｒａｎｓｃｔｏｎａｔｈｗａａｃｔｖａｏｎｉｇｈｕｎｔｉｉｌｉｉｄｉａｄｂｙｌ４ｉｌｄｕｉｐｙｉｔｉｊｐｙｇｏｆＦＡＫ－ａｎｄＭ８８ＪｈｅｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏ２０５１１：４９９９５０１０．ｙＤ［］．ＴＪｇｙ１９５０，？（）ＴＵＲＮＥＲＩ１３７ＮＡＬＬＥＳ，Ｊ．ｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｒｒｉｅｒｌｏｓｓａｓａｃｒｉｔｉｃａｌｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｌｉｎｋｂｅｔｗｅｅｎ［］－－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｂｏｗｅｌｄｉｓｅａｓｅａｎｄｒａｆｔｖｅｒｓｕｓｈｏｓｔｄｉｓｅａｓｅＪ．ＭｕｃｏｓａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｙｇ，［］ｇｙ１４－２０５８：７２０７３０．，（）１３８ＦＵＲＵＳＥＭＨＩＲＡＳＥＴＩＴＯＨＭｅｔａｌ．Ｏｃｃｌｕｄｉｎ：ａｎｏｖｅｌｉｎｔｅｒａｌｍｅｍｂｒａｎｅ，？，ｇ［］ｒｏｔｅｉｎｌｏｃａｌｉｚｉｎｇａｔｔｉｈｔｕｎｃｔｉｏｎｓＪ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙｐｇｊ［］，－１１９９３１２３６：１７７７７８８．，（）ＢＡＬＤＡＭｔｔｅｔ１３９ＷＩＬＬＯＴＴＥＳ，ＨＥＩＮＴＺＥＬＭＡＮＭｅａｌ．Ｌｏｃａｌｉｚａｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｒｅｎｉａｌ［］，，－ＡｍｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｗｏｉｓｏｆｏｒｍｓｏｆｔｈｅｔｉｇｈｔｕｎｃｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＺＯｌＪ．ｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆｊ［］－ｏｏ－ｅｌＰｈｓｌｓｉｏｏ２６２：１１１９１１２ｉｌＣＰｈｙｌｇｙ１９９２５４．ｙｇｙ，？（）ＦＥＮＧ－１４０ＣＨＥＮＺＹ，ＸＳ，ＹＡＮＧＰ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＧＬＰ２ｏｎｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ［］ｔｕｎｃｔｔｓｔｒｔ．ｔＡｉｇｈｔｉｏｎｉｎｒａｏｆｏｂｓｕｃｉｖｅａｕｎｄｉｃｅＪＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｕｒｒｅｎｄｖａｎｃｅｓｊ［］ｊｅａｕｒｅｒ２００８－１：７ｉｎＧｅｎｒｌＳｇｙ，，７（８）６０７６３．１４１－ＣＬＯＶＥＲＣＭＥＬＳＡＳＳＥＲＴＨｅｔａｌ．ＳｈｏｒｔＷＡＬＫＥＲＭＰ５ＥＶＯＣＫ？，［］－－ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ：Ｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ２ａｎｄｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓａｌｔｅｒｔｉｈｔｕｎｃｔｉｏｎｅｎｅｇｊｇｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔｏｆｄａｉｒｙｃａｌｖｅｓＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤａｉｒＳｃｉｅｎｃｅｐｇ［］ｙ，－２０１５９８５：３４３２３４３７．，（）－１４２ＹＵＣＪＩＡＧＪＩＡＮＧＹｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｉｉｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｄｅ２ｏｎｔｈｔｕｎｃｔｉｏｎｉｎ，，，ｇｇｐｐｇｊ［］ｅｕｎａｌｅｉｔｈｅｌｉｕｍｏｆｗｅａｎｅｄｐｉｓｔｈｏｕｇｈＭＡＰＫｓｉｎａｌｉｎｇａｔｈｗａＪ．ｊｊｐｇｇｐｙ［］Ａｓ－－ｉａｎＡｕｓｔｒａｌａｓｉａｎｏｕｒｎａｏｆａｎｉｍａｌｓｃｉｅｎｃｅｓ２０１４５：７．ｌ，２７３３７４２ｊ，（）－－１４３ＹＵＣＪＩＡＧＤＥＮＧｅｔａｌ．ＴｈｅＥｆｆｅｃｔｓｏｆＧｌｕｃａｏｎｌｉｋｅＰｅｔｉｄｅ２ｏｎｔｈｅＴｉｈｔ，，Ｑ？ｇｇ［］ｐＪＦｕｎ－ｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＢａｒｒｉｅｒｃｔｉｏｎｉｎＩＰＥＣＪ２ＣｅｌｌｓｔｈｒｏｕｇｈＰｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ－－－Ｍａｍｍａ３ｋｉｎａｓｅＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅＢｌｉａｎＴａｒｇｅｔｏｆＲａｐａｍｃｉｎＳｉｇｎａｌｉｎｇＰａｔｈｗａＪ．ｙｙ［］－Ａｓ－ｉａｎＡｕｓｔｒａｌａｓｉａｎｏｕｒｎａｌｏｆａｎｉｍａｌｓｃｉｅｎｃｅｓ２０１６２９５：７３１７３８．ｊ，，（）［１４４］ＳＨＥＮＵＢＬＡＣＫＥＤ，ＷＩＴＫＯＷＳＫＩＥＤ，ｅｔａｌ．ＭｙｏｓｉｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｅｓｂａｒｒｉｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎｂｙｒｅｍｏｄｅｌｉｎｔｉｈｔｕｎｃｔｉｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅＪ．ｇｇｊ［］Ｊ－ｏｕｒｎａｅｌｉｅｎｃｅ２００６１１：２０９５２１０６．ｌｏｆＣｌＳｃ１９０，，（）ＭＡ－１４５ＹＥＤＩ，ＭＡＴＹ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒａｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ［，］１３２ 四川农业大学博士学位论文参考文献ｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｉｇｈｔｕｎｃｔｉｏｎｂａｒｒｉｅｒＪ．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆｊ［］－Ｇ－ＰｈｓｉｏｌｏａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｎｄＬｉｖｅｒＰｈｓｉｏｌｏ２００６２９０３４９６５０４．ｇｙ：ｙｇｙｙ，，（）１４６ＧＥＥＮＳＭＭＮＩＥＷＯＬＤＴＡ．Ｏｔｉｍｉｚｉｎｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆａｏｒｃｉｎｅｅｉｔｈｅｌｉａｌ［］，ｐｇｐｐｃｅ－ｉｎｅＩＰＥＣＪ２ｔｒｏｕａｓｔｏｌｏｉｃａｌａｎｄｈｓｉｏｌｏｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｏｎＪｌｌｌｈｇｈｈｉｇｐｙｇｉ．［］－Ｃｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏ２０１１６３４：４１５４２３．ｙｇｙ，，（）［１４７］ＭＡＲＣＩＮＫＯＶＭ，ＫＬＩＮＧＢＥＲＧＴＤ，ＬＡＵＫＯＶＡ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐＨ，ｂｉｌｅａｎｄｃａｌｃｉｕｍｏｎｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆｐｒｏｂｉｏｔｉｃｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉｏｆａｎｉｍａｌｏｒｉｇｉｎｔｏｔｈｅ－－ｏｒｃｉｎｅｅｕｎａｌｅｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅＩＰＥＣＪ２Ｊ．Ａｎａｅｒｏｂｅ２０１０１６２：１２０１２４．，，ｐｊｊｐ［］（）ＢＲＯＳＮＡＨＡＮＡＢＲＯＷＮＤＲｏｒｃｎｅＰＥＣ－Ｊｔｅｓｔｎａｌｅｔｅａｃｅｓ１４８Ｊ．ＰｉＩ２ｉｎｉｉｈｌｉｌｌｌｉｎ［］，ｐＭ－ｍｃｒｏｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉａｔｉｏｎｓ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉｃｒｏｂｉｏｌｏ２０１２１３：２２９２３７．ｉｂｉｏｌｏｇｇ［Ｊ］ｙｇｙ，，５６（）－１４９ＬＩＵＦＬＩＧＷＥＮＫｅｔａｌ．ＰｏｒｃｉｎｅｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅＩＰＥＣＪ２ｏｆ［］，，，ｐ（）ｒｏｔａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｓａｎｅｗｍｏｄｅｌｆｏｒｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｂｔＪＶ－ｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｒｏｉｏｉｃｓ．ｉｒａｌＩｍｍｕｎｏｌｏ２０１０２３２：１３５１４９．ｐ［］ｇｙ，，（）－ＭＬＵＣＥＮＡＣｔＩｔｔｔ１５０ＡＲＣＥＣＲＡＭＩＲＥＺＢＯＯｅａｌ．ｎｎａｅｉｍｍｕｎｅａｃｉｖａｉｏｎｏｆｓｗｉｎｅ，，，［］－－ｔｔａｅｔｅａｃｅｎｅｓＩ２ａｎｄＩＰＩ２ＩｎｒｅｓｏｎｓｅｔｏＬＰＳｆｒｏｍｉｎｅｓｉｎｌｐｉｈｌｉｌｌｌｌｉＰＥＣＪｉ（）ｐＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｈｉｍｕｒｉｕｍＪ．ＣｏｍａｒａｔｉｖｅＩｍｍｕｎｏｌｏＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓｙｐ［］ｐｇｙ，ｇｙ２０－Ｄｉｓｅａｓｅｓ１０３３２：１６１１７４．，，（）［１５１］ＳＡＲＧＥＡＮＴＨＲ，ＭＩＬＬＥＲＨＭ，ＳＨＡＷＭＡ．ＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆｐｏｒｃｉｎｅｅｔｅａＩＰｃｅｓｔｏｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｅｎｉｃＥ．ｃｏｉｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｓｍｏｔｅｃｐｉｈｌｉｌＥＣＪ２ｌｌｇｌｄｕｌａｄｂｙｚｉｎ－－ｓｕｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎＪ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏ２０１１４８１５１６：２１１３２１２１．ｐｐ［］ｇｙ，，（）－－１５２ＤＵＢＰＥＢＲＵＢＡＫＥＲＰＬ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２：ｍｕｌｔｉｌｅａｃｔｉｏｎｓ［］，ｇｇｐｐｐ，Ｊｏｕ－ｍｕｌｔＪｌｉｌＥｎｄｏｌｔｉｐｅｍｅｄｉａｏｒｓ．ＡｍｅｒｉｃａｎｒｎａｏｆＰｈｓｏｏｃｒｉｎｏｌｏａｎｄ［］ｙｇｙｇｙ－Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ２００７２９３２：４６０４６５．，，（）ＷＡＮＧＰ－１５３ＣＨＥＮＳＷＹＺＨＵＪｅｔａｌ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆ１２５ｄｉｈｄｒｏｘｖｉｔａｍｉｎｄ３，，，，ｙｙ［］－－ｉｉｎｔｅｓｔｌｈｌｉｌｈｉ２ｏｎｌｉｐｏｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｎｄｕｃｅｄｉｎａｅｉｔｅａｔｉｇｔｕｎｃｔｉｏｎｎｕｒｉｎｃａｃｏｃｅｌｌｐｐｊｊｙａｍｍａｔｏｎ－ｅｒｓＪ：ｍｏｎｏｌａ，Ｉｎｆｌｉ２０１５３８１３７５３８３．ｙ，，［］（）ＳＨＡＮＣＹＹＡＮＧＪＨＫＯＮＧＹｅｔａｌ．Ａ１５４ｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｒｒｉｅｒａｎｄＧＬＰ２］，，，［－ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎＢｅｒｂｅｒｉｎｅｔｒｅａｔｅｄｔｅ２ｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｙｐ［］ｇｙ，－２０１３２１８３：２５５２６２．，（）Ｉｔ１５５ＦＡＲＳＨＯＲＰＫＡＣＨＡＲＢ．Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｈｏｓｈｏｒｌａｉｏｎｏｆｏｃｃｌｕｄｉｎｄｕｒｉｎ［，］ｐｐｙｇｏｐｅｎｉｎｇａｎｄｒｅｓｅａｌｉｎｇｏｆｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ［Ｊ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ］－ＭｅｍｂｒａｎｅＢｉｏｌｏ１９９９１７０２１４７１５．，：６ｇｙ，（）１５６ＲＡＯＲＫＢＡＳＵＲＯＹＳｅｔａｌ．Ｔｒｏｓｉｎｅｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎａｎｄ，，［］，ＲＡＯＶＵｙｐｐｙ—＿－—－ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｃｃｉＺＯｌａｎｄＥｃａｄｈｅｒｎｃａｔｅｎｎｃｏｍｌｅｆｏｍｔｈｅｉｏｎｏｆｌｕｄｎｉｐｉｐｘｅｓｒ１３３ 四川农业大学博士学位论文参考文献ｔｔｉｌｌ－ｃｏｓｋｅｉｄａｔｉｖｅｓｔｒＪ．ＢｉｏｃｈｅｍｃａＪｏｕｒｎａ２００２３６８２：４７１４８１．ｌｅｏｎｂｏｘｅｓｓ，ｙｙ［，（）］ＴＡＫＥＮＡＧＡＹＴＡＫＡＧＩＮＭＵＲＯＴＯＭＩＫｅｔａｌｉｉｔｉｉｔ１５７ＩｎｈｂｉｔｏｎｏｆＳｒｃａｃｖ［］，，，ｙｄｅｃｒｅａｓｅｓｔｙｒｏｓｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｏｃｃｌｕｄｉｎｉｎｂｒａｉｎｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓａｎｄａｔｔｅｎｕａｔｅｓｔｏｆｔｈｅｂｏｄ－ｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒａｆｔｅｒｔｒａｔｆｏｃａｃｅｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｙｌｏｂｎｓｉｅｎｌｒｅｂｒａｌ－ｓｃｅｍｉａ．ｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｒｅｂｒａｌＢｌｏｏｄＦｌｏｗａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ２００９２９６：１０９９１１０８．ｉｈＪＪ，，（）［］［１５８］ＫＡＬＥＧ，ＮＡＲＥＮＡＰ，ＳＨＥＴＨＰ，ｅｔａｌ．Ｔｙｒｏｓｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｏｃｃｌｕｄｉｎ－－－ＢａｔｔｅｎｕａｔｅｓｉｔｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈＺＯ１ＺＯ２ａｎｄＺＯ３Ｊ．ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ，，［］Ｂ－ｉｏｈｓｃａＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ２００３３０２２：４ｐｙｉｌ，，（）３２３２９．１５９ＲＡＯＲ．ＯｃｃｌｕｄｉｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｉｇｈｔｕｎｃｔｉｏｎｓＪ．［］ｊ［］ｏｆ－ＡｒｍａｉｓｔｈｅＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，２００９，１１６５：６２６８．［１６０］ＬＩＵＸ，ＸＵＪ，ＭＥＩＱ，ｅｔａｌ．Ｍｙｏｓｉｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｉｎｈｉｂｉｔｓｄｅｘｔｒａｎ－．ＤｓｕｌｆａｔｅｓｏｄｉｕｍｉｎｄｕｃｅｄｃｏｌｉｔｉｎｍｉｃｅｉｅｓｔｉｖｅＤｉｓｅａｓｅｓａｎｄＳｃｉｅｎｃｅｓｉｓ［Ｊ，］ｇ２０－４１３５８１：１０７１１．，（）１６１ＣＨＥＮＣＷＡＮＧＰＳＵｅｔａｌ．Ｍｙｏｓｉｎｌｉｈｔｃｈａｉｎｋｉｎａｓｅｍｅｄｉａｔｅｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ［］，？Ｑ，ｇｂａｒｒｉｅｒｄｉｓｒｕｔｉｏｎｆｏｌｌｏｗｉｎｂｕｍｉｎｕｒＪ．ＰｌｏＳＯｎｅ２０１２７４：ｅ３４９４６．ｐｇｊｙ［］，，（）１６２ＡＬＥＸＡＮＤＥＲＲＷ．ＨｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎａｎｄｔｈｅＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆＡｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ［］ｄｌＩｌＯｘｉｄａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓａｎｄｔｈｅＭｅｉａｔｉｏｎｏｆＡｒｔｅｒｉａｎｆａｍｍａｔｏｒｙＲｅｓｐｏｎｓｅ：ＡＮｅｗ－ＰｔＪＨｅｒｔｅｎｓ．ｅｒｓｅｃｉｖｅｉｏｎ１２：１５５１６１．９９５？２５ｐ［］ｙｐ，（）ＩＭＵＲＰＨＹｔＡ－Ｄ１６３ＤＡＭＲＯＮＤＳ，ＤＡＲＶＳＨＡ，Ｌ，ｅａｌ．ｒａｃｈｉｄｏｎｉｃＡｃｉｄｅｅｎｄｅｎｔ［］ｐＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆＴｒｏｐｏｎｉｎＩａｎｄＭｙｏｓｉｎＬｉｇｈｔＣｈａｉｎ２ｉｎＣａｒｄｉａｃＭｙｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．１－ｒｃｕｌａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ９９５７６６１Ｃ：０１１１０１９．ｉ，，（）１６４ＭＩＹＯＳＨＩＨＳＴＡＰＰＥＮＢＥＣＫＴＳ．Ｉｎｖｉｔｒｏｅｘａｎｓｉｏｎａｎｄｅｎｅｔｉｃｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ，ｐ［］ｇｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｓｐｈｅｒｏｉｄｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０－１３８１２２４７１２４８２：．，（）ＩＪＩＵＷＫＯＨＥＮＡＶＲＡＭＯＧＬＵＲｔｌＭＥＫ－ＥＲＫＩｎｈｉ１６５ＴＳＡｅａ．ｉｂｉｔｏｎＣｏｒｒｅｃｔｓ［，Ｑ，，］ｔｈｅＤｅｆｅｃｔｉｎＶＬＤＬＡｓｓｅｍｂｌｙｉｎＨｅｐＧ２ＣｅｌｌｓＰｏｔｅｎｔｉａｌＲｏｌｅｏｆＥＲＫｉｎ－ＢＶＬＤＬＡｏｌＯＯＰａｒｔｉｃｌｅＡｓｓｅｍｂｌＪ．ＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓａｎｄＶａｓｃｕｌａｒｐｙ，，［］１－Ｂ：ｉｏｌｏ２００７２７２１１２１８．ｇｙ，，（）Ｍ－ＩＪｔＬｉｋ１６６ＤＵＢＰＥＦＯＲＳＥＣＬ，ＢＡＨＲＡ，ｅａｌ．ＴｈｅＥｓｓｅｎｔｉａｌＲｏｌｅｏｆＩｎｓｕｌｉｎｅ［］，ｔ－－－ＧｒｏｗｈＦａｃｔｏｒ１ｉｎｔｈｅＩｎｔｅｓｔｉｎａｌＴｒｏｐｉｃＥｆｆｅｃｔｓｏｆＧｌｕｃａｇｏｎＬｉｋｅＰｅｐｔｉｄｅ２ｉｎＭ１２５８９－ｉｃｅＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏ２００６１３：６０５．［］．ｇｙ，，（）１６７ＳＩＮＣＬＡＩＲＥＹＵＳＴＡＢ？ＳＴＲＥＵＴＫＥＲＣ，ｅｔａｌ．ＧｌｕｃａｇｏｎＲｅｃｅｐｔｏｒＳｉｇｎａｌｉｎｇＩｓ［］ＥｓｓｅｎｔｆｏＣＭｕｒｉｎＨｉｌ．ｉａｌｒｏｎｔｒｏｌｏｆｅｅａｔｏｃｔｅＳｕｒｖｖａＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｐｙ［］ｇｙ，２００８１３５６２０９６－２１０６：．？（）１３４ 四川农业大学博士学位论文参考文献［１６８］ＮＡＫＡＮＯＨ，ＳＨＩＮＤＯＭ，ＳＡＫＯＮＳ，ｅｔａｌ．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＩｋａｐｐａＢｔ－－ｋｉｎａｓｅａｌｈａａｎｄｂｅａｂｔｗｏｕｓｔｒｅａｍｋｉｎａｓｅｓＮＦｋａａＢｉｎｄｕｃｉｎｋｉｎａｓｅａｎｄｐｙｐ，ｐｐｇｅｎ－ａｃＥＲＸ－ｍｉｔｏｇｔｉｖａｔｅｄｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ／ｋｉｎａｓｅｋｉｎａｓｅ１Ｊ．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌｐ［］ｇＡ－ｃａｄｅｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ１９９８９５７：３５３７３５４２．ｙ，？（）－１６９ＤＵＭＩＴＲＵＣＤＣＥＣＩＪＤＴＳＡＴＳＡＮＩＳＣｅｔａ．ＴＮａｌａｉｎｄｕｃｔｏｎｂｉｓｌＦｉＬＰＳ［］，，，ｐｈｙｒｅｕｔＲＫ－ｔｔｌａｔｅｄｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｉｏｎａｌｌｖｉａａＴｌ２／ＥｄｅｅｎｄｅｎａｈｗａＪ．Ｃｅｌｌｇｐｙｐｐｙ，ｐｐ［］２０００７１１－１０３：０７１０８３．，（）＇１７０ＧＵＨＡＭＯＣＯＮＮＥＬＬＭＡＰＡＷＬＩＮＳＫＩＲｅｔａｌ．Ｌｉｏｏｌｓａｃｃｈａｒｉｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，，；ｐｐｙ［］ｏｆ－ｔｔｈｅＭＥＫＥＲＫ１／２ｐａｔｈｗａｙｉｎｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｙｔｉｃｃｅｌｌｓｍｅｄｉａｔｅｓｔｉｓｓｕｅｆａｃｏｒａｎｄ－－ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒａｌｐｈａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｉｎｄｕｃｉｎｌｋ１ｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎａｎｄＥｒ１ｇＥｐｐｙｇｏｄ２００－ｅｘｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｌｏ１９８５：１４２９１４３９．ｐ＾］，，（）ＭＡＡ－１７１ＬＩＮＴＹ？ＦＡＮＣＷ，ＭＣ，ｅｔａｌ．Ｌｉｐｏｐｏｌｓａｃｃｈａｒｉｄｅｒｏｍｏｔｅｄｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ［］ｙｐｐ－－Ｃａｃｏ２ｃｅｌｌｓｉｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｃＳｒｃｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＥＲＫａｃｔｉｖａｔｉｏｎＪ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ［］ａｅ－Ｔｉｉ２０１５５ｌ：３３３８．（ｐ），，（）［１７２］ＴＡＮＪ，ＷＡＮＧＹ，ＸＩＡＹ？ｅｔａｌ．Ｍｅｌａｔｏｎｉｎｐｒｏｔｅｃｔｓｔｈｅｅｓｏｐｈａｇｅａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｂａｒｒｉｅｒｂｓｕｒｅｓｓｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖｉｔｏｆｍｏｓｉｎｌｉｈｔｃｈａｉｎｋｉｎａｓｅｙｐｐｇｐ，ｙｙｇｐｔｈｒｏｕｈＥＲＫ１／２ｓｉｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＪ．ＣｅｌｌｕｌａｒＰｈｓｉｏｌｏａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｇｇ［］ｙｇｙｙ，２０－１４３４６：２１１７２１２７．，（）１７３ＮＧＵＹＥＮＡＣＨＥＮＰＣＡＩＨ．ＲｏｌｅｏｆＣａＭＫＩＩｉｎｈｄｒｏｅｎｅｒｏｘｉｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆ，，ｙｇｐ［］Ｖ１２ＡＰＫ２７ａｎｄａｃｔｔｔＦＥＢＳ，ＥＲＫ／３８ＭＨＳＰｉｎｒｅｏｒａｎｉｚａｉｏｎｉｎｅｎｄｏｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓＪ．，ｐ，ｇ［］－－Ｌｅｔｔｅｒｓ２００４５７２ｌ３：３０７３１３．，，（）－７４ＳＬＩＵＢＦＵＳｅｔａ－１ＸＩＥｌ．ＧＬＰ２ｓｕｒｅｓｓｅｓＬＰＳｉｎｄｕｃｅｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎ，，［］，ｐｐ－ｈａｅｓｂｉｎｈｔｎＥＲＫｔ．ｍａｃｒｏｐｇｙｉｂｉｉｇｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｉｏｎａｎｄＮＦｋａｐｐａＢａｃｔｉｖａｔｉｏｎＪｐ［］ａｒ－ＣｅｌｌｕｌＰｈｙｓｉｏｌｏａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１４３４２：５９０６０２．ｇｙ，２０，（）－ＬＥＥＪＳＬＥＥＪＪＳＥＯＪＳ．ＨＳＰ７０ｄｅｆ１７５ｉｃｉｅｎｃｒｅｓｕｌｔｓｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｃＪｕｎ，，ｙ［］－－－ＮｔｅｒｍｉｎａｌＫｉｎａｓｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｎａｌｒｅｕｌａｔｅｄｋｉｎａｓｅａｎｄｃａｓａｓｅ３ｉｎ，ｇｇ，ｐｔ－ｏｔｏｓｈｅｒｏｓｍｏｉＪｓｔｒｌａｒｉｉｎｄｕｃｅｄａｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｉｃａｌＣｈｅｍｉｙｐｙｐｐ［］ｇｙ，２８０８－２００５：６６３４６６４１．，（）［１７６］ＩＨＡＲＡＥ５ＭＯＦＦＡＴＬ，ＯＳＴＲＡＮＤＥＲＪ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ２＋ａｔｈｗａｙｓｒｅｓｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒＣａｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎｉｎｒａｔｉｌｅａｌｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅＪ．ｐｐ［］ＡｍｅｒＰｈｓｏｏ－ｏｏｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆｉｌＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｎｄＬｉｖｅｒＰｈｓｉｌｙｇｙｙｇｙ，２９３４－７１０：２００７６９９．，（）－１７７ＬＩＺＬＩＵＸＢＬＩＵＹＨｅｔａｌ．ＲｏｌｅｏｆｃＡＭＰｄｅｅｎｄｅｎｔｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＡａｃｔｉｖｉｔｉｎ［］，，，ｐｐｙ－－－－ｔｃｔｅａｃｔｔｔｏｆｌｏｗｄｏｓｅｅｎｄｏｈｅｌｉａｌｍｏｎｏｙｉｖａｉｎｇｐｏｌｙｐｅｐｉｄｅＩＩｉｎｄｕｃｅｄｏｅｎｉｎｇｐ１３５ 四川农业大学博士学位论文参考文献－－ｂｌｏｏｄｔｕｍｏｒｂａｒｒＪ．ＪｏｒｒＮｅｕｒｏｓｃｅｎｃｅ２０１５：ｉｅｒｕｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｉ５６ｌ６０６９．［］，，（）ＹＡＮＧＺＴＧＲ５－１７８ＸＩＯＮＧＦ，ＬＩＸ，，ｅｔａｌ．ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅｉｎｄｕｃｅｄ［］－ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｅｔａｌｉｎｒａｔｇｌｏｍｅｒｕｌａｒｉａｌｃｅｌｌｓｂｉｎｈｉｂｉｔｉｎＲｈｏＡ／ＲＯＣＫｓｉｎａｌｉｎＪ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅｍｅｓａｎｇｙｇｇｇ［］，２０－１６５４３：６５７６７０．，（）－１７９ＹＵＸＬＩＦＫＬＵＳＳＭＡＮＮＥｅｔａｌ．Ｇｒｏｔｅｉｎｃｏｕｌｅｄｅｓｔｒｏｅｎｒｅｃｅｔｏｒ１ｍｅｄｉａｔｅｓ，，，ｐｇｐ［］ｐｒｅａｘａ－ｔｉｏｎｏｆｃｏｒｏｎａｒａｒｔｅｒｉｅｓｖｉａｃＡＭＰ／ＰＫＡｄｅｅｎｄｅｎｔａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＭＬＣＰＪ．ｌｙｐ［］Ａｍｅｒｏ－ＥｎｄｏｃｎｏｏｔｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｓｉｏｌｒｉｌａｎｄＭｅａｂｏｌｉｓｍｙｇｙｇｙ，２０４－１４３〇７：３９８４０７．？（）１８０ＡＳＬＡＭＭＨＡＲＴＥＬＦＶＡＲＳＨＡＤＭ，ｅｔａｌ．ｃＡＭＰ／ＰＫＡａｎｔａｏｎｉｚｅｓ［］，，ｇｈ－ｉｔｉｔｈｉｔｒｏｍｂｉｎｉｎｄｕｃｅｄｖａｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｅｌｉｌｉｈｔｃｈａｉｎｔｎａｃｌａｍｙｏｓｎｇｈｏｓｈａａｓｅ：ｒｏｌｅｏｆｐｐ－Ｉ－１７ａｒｄｏｖａｓｃｕｌａｒｅｓｅａｒｃｈ２０２ＣＰＪ：．ＣｉＲ１０８７３７５３８４．［］，？（）ＫＲＡＬＡＮｔＡＭＰ１８１ＡＢＵＲＩＭＡＡ？ＷＲＡＩＴＨＳ，ＳＺ？ｅａｌ．ｃｓｉｇｎａｌｉｎｇｒｅｇｕｌａｔｅｓｌａｔｅｌｅｔ［］ｐｍｙｏｓｉｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎＭＬＣｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎａｎｄｓｈａｅｃｈａｎｅｔｈｒｏｕｈｔａｒｅｔｉｎｔｈｅ（）ｐｐｙｐｇｇｇｇＲｈＡ－ａｓｅ－ＭＬＣｓａｏＲｈｏｋｉｎｈｏｐｈｔａｓｅｓｉｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙＪ．Ｂｌｏｏｄｇ，ｐ［］－２０１３１２２２０：３５３３３５４５．？（）ＹＵＳＴＡ－－ＢＲＰＤＲＵＣＫＥＲＤＪ．Ｔｈｅｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｅｔｉｄｅ２ｒｅｃｅｔｏｒ１８２，ＢＯＵＳＨＥＹ，ｇｇｐｐｐ［］ｔｔｆｃｅｌｌｕｌａｒａｏｔｏｓ－ｍｅｄｉａｅｓｄｉｒｅｃｉｓｖｉａａｃＡＭＰｄｅｅｎｄｅｎｔｏｔｅｉｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｐｐｐｐｒｓｅ－ｎｄｅｅｎｄｅｎｋｉｎａｉｐｔａｔｈｗａｙＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ，ｐ［］ｇｙｉ２０００２７５４５５３４５－：３３５３５２．，（）（１３６ 四川农业大学博士学位论文致谢致谢一在论文即将完成之际，，，心中无限感慨。回眸过去，路走来需要感谢的人太多实在是这些简单的文字所不能表达和承载的。首先诚挚的感谢恩师贾刚教授对我的严格要求和悉心指导。由于恩师的循循善诱和严格要求，基，学生的科研能力有所提高础知识更为扎实。论文从选题、方案设计、研宄开展、到论文撰写，处处倾注了您的辛劳，字字凝结了您的心血和窨智。硕士２年、博士６年，恩师在学习、科研和生活各方面给予了无微不至的指导和关怀，使我顺利地完成了学业！。在此，谨向恩师致以最诚挚的感谢感谢四川农业大学动物营养研究所全体教职工的关心与帮助，我为自己能在这样一个优秀的集体中学习而感到荣幸。特别感谢陈代文教授、吴德教授、张克英教授、余冰教授、王康宁研宄员、王之盛教授、薛白教授、何军教授、方正峰教授、曾秋凤教授、黄志清教授、车炼强副教授、毛湘冰副教授、白世平副教授、林燕副教授、丁雪梅副教授，以及饲料方向导师组的蔡景义副教授、田刚副教授、赵华副教授、陈小玲副教授、刘光芒副研宄员等老师为学生的学习科研创造了良好的环境与氛围，在课程学习中的指导以及在读书报告、开题报告和论文实施、撰写中提出的宝贵建议。特别感谢营养所的钟邦胜所长、朱兵书记、李润香老师、彭光兰老师、吴树安、宋陈玲、高洁等老师，非常感谢您们在学习和生活中给予的指导、关心、支持和帮助。特别感谢李华老师、汤加勇老师在分子生物学分析上提供的便利和帮助。在试验实施过程中还得到了吴秀群老师、吴彩梅老师、曾静康老师、宋德田老师等老师提供的优良试验一环境和支持，在此并向他们表示衷心的感谢！衷心感谢在整个论文实施过程、帮助中在学习和生活上给予我无私帮助和关心支持的同窗好友、师兄师姐！、师弟师妹们感谢你们为我的博士论文付出的辛劳相汗水！特别感谢我的父母和家人。感谢父母亲的默默关心，感谢爱人对我的理解，感谢我所有的家人，！，谢谢你们那么爱我、支持我有了你们，我感觉特别幸福最后，衷心祝愿四川农业大学动物营养研宄所的明天更加美好，所有教职工事业业有成、前程似锦！顺利，所有同学学邓秋红敬谢２０１６年９月于温江１３７ 四川农业大学博士学位论文致谢攻读博士学位期间发表和录用的主要学术论文一作者己发表ＳＣ以第Ｉ收录论文１篇：Ｊ－１ＤＥＮＧＱＨ，ＩＡＧＺＨＡＯＨｅｔａｌ．Ｔｈｅｒｏｌｏｎｅｄｅｆｅｃｔｏｆｌｕｃａｏｎｌｉｋｅ［］，，ｐｇｇｇｅｔｅ２ｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｎｒｏｗｔｈｅｒｆｏｒｍａｎｃｅａｎｄｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｏｆｗｅａｎｅｄｐｐｉｄｐｇｐｐ一－ｔＡｎｉｍａｃｔ２０７ｌｌｉｌｅｓＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｌＳｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｃｈｎｏｌｏ１６：９．（作者，ｐｇ［］ｇｙ，，（）第＝２ＳＣＩ，ＩＦ．０３７）Ｇ－－２ＹＵＣＳＪＩＡＤＥＮＧＯＨｌＴｈＥｆＧｌｕｌｋｅｄｅ２ｏｎ，ｅｔａ．ｅｆｅｃｔｓｏｃａｏｎｉＰｅｔｉ，，ｇｐ［］ｔ－ｈｅＴｉｇｈｔＪｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＢａｒｒｉｅｒＦｕｎｃｔｉｏｎｉｎＩＰＥＣＪ２Ｃｅｌｌｓｔｈｒｏｕｇｈ－－Ｐ－Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３ｋｉｎａｓｅｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅＢＭａｍｍａｌｉａｎＴａｒｇｅｔｏｆＲａｐａｍｙｃｉｎａ－ＳｉｎａｌｉｎＰｔｈｗａｙＪ．ＡｓｉａｎＡｕｓｔｒａｌａｓｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅｓｇｇ，［］－ＣＩＩＦ＝０６２０１６２９５：７３１７３８．（Ｓ，．７５），（）＊Ｉ３ＤＥＮＧＯＨ．ＪＡＧＺＨＡＮＧＺＹｅｔａｌ．Ｔｈｅｒｏｌｏｎｅｄｅｆｆｅｃｏｆ，，ｇｔ［］ｐｖ－ｔ２ｏｎ－ｔｔｇｌｕｃａｏｎｌｉｋｅｐｅｐｉｄｅｉｎｅｓｉｎａｌｍｕｃｏｓａｌｂａｒｒｉｅｒｉｎｕｒｉｎＬＰＳｃｈａｌｌｅｎｅｄｇｊｙｇｗｅａｎｅｄｅｔｓ（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ，ｉｇｌ．ｇｙ审稿中）ｐ－４ＤＥＮＧＯＨＪＩＡＧｔ．ＴｉｍｏｆＧＬＰ２ｌｔｔｈ【】，ｅａｌｈｅｍｅｃｈａｎｓｒｅｕａｅｓｅ，ｇ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅｋｅｙｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｔｉｇｈｔｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎＬＰＳｓｔｒｅｓｓｅｄｊ－２ｃｅＩＰＥＣＪｌｌ．（Ｐｒｅｐａｒｅｄ，待发表）１１３８
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