cDNA末端快速扩增技术RACE

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1、cDNA末端快速扩增技术(rapidamplificationofcDNAends,RACE)张晓玲技术背景基本RACE原理和方法样品要求RACE产物的鉴定和全长cDNA的获得基本RACE原理技术背景得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法：建立和筛选cDNA和DNA文库。利用GenBank数据库中的表达序列标签(expresssequencetags,ESTs)拼接出全长或近全长cDNA。是多聚酶链式反应即PCR。cDNA末端快速扩增(RACE)技术。用RNase保护、S1核酸酶谱和引物延伸等方法来保证mRMA5′末端的获取，但又需要大量的mRNA。基本RACE原理和方法

2、利用Oligo(dT)对mRNA进行反转录的同时在两头加上通用接头(引物)，从而可利用基因特异的引物(genespecificprimer，GSP)通过PCR反应快速获得目的序列的5′端和3′端。RACE流程5′-RACE法原理图（1）（2）（3）（4）RNaseH样品要求：◇提取TotalRNA的材料要新鲜，采样后立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂。◇TotalRNA无降解，OD260/280=1.8~2.0。◇提供尽量多的实验材料：3′RACETotalRNA＞15μg；5′RACETotalRNA＞25μg。如果基因的含量较低或者未知序列较长，样品量需相应增加。RACE

3、产物的鉴定和全长cDNA的获得3′或5′双链cDNA限制性内切酶酶切Southernblot分析克隆3′和5′重叠序列的连接RACE产物的3′和5′末端序列的分析合成相应引物PCR获得全长cDNASMARTRACEcDNAsynthesisKitSMARTRACEcDNAsynthesisKit碱基互补配对原则AT之间形成两个氢键GC之间形成三个氢键poly(C)替代poly(A)增加5′接头与cDNA第一链的结合牢固性增加模板中有效双链丰度提高目的基因获取几率SMARTRACEcDNAsynthesisKit原理cDNA第一链的合成机制SMARTerRACE流程5’RACE流

4、程图3’RACE流程图GSP与cDNA模板的关系GSP要求：23–28nt50–70%GCTm≥65℃；降落式（touchdown）PCR，Tm>70℃与通用引物的3’-末端不互补GSP与cDNA模板的关系GSP1：5’-RACEPCR的反义引物GSP2：3’-RACEPCR的正义引物合适的酶切位点100~200bp注意：GSP1与GSP2的Tm值要相似GSP与cDNA模板的关系NGSP：槽式（Nested）PCR引物扩增后的预期：具体实验方法cDNA第一链的合成阳性对照RACEPCR实验cDNA末端的快速扩增RACE产物鉴定试剂盒试剂比较用GSPs和NGSPs引物获得的PCR

5、产物SouthernblotanalysisNucleoTrapGelExraction克隆和测序RACE产物服务理念中的“点点”◆理解多一点真情浓一点◆学习勤一点品质高一点◆理由少一点效率高一点◆处理问题灵活点工作过程用心点◆对待同事宽容点互相协作快乐点放映结束！敬请各位的批评指导！谢谢观看