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《RACE技术在钓取白血病相关基因 LRP16 全长cDNA.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、·18·中国实验血液学杂志JournalofExperimentalHematology2001;9(1)RACE技术在钓取白血病相关基因LRP163全长cDNA中的应用韩为东 于 力 楼方定 王全顺 赵 瑜 史子江 靳海杰(中国人民解放军总医院血液科 北京 100853)摘要 LRP16是我们应用甲基化敏感的限制性界标基因组扫描(restrictionlandmarkgenomicscanning,RLGS)技术时发现的一个与白血病复发相关的新基因。为钓取这一新基因的全长cDNA,本实验采用了cDNA
2、末端快速扩增法(rapidamplificationofcDNAend,RACE)。通过对RACE法若干步骤进行优化,克隆得到了LRP16基因cDNA的5′2与3′2非翻译区,进而获得其全长及完整的开放阅读框架,并作为新基因被GenBank收录。上述结果表明,RACE技术是钓取未知基因全长cDNA敏感而快速的方法,尤其是对5′2及3′2非翻译区的钓取更具有实用性。关键词 白血病相关基因 LRP16基因 cDNARACE技术中国图书资料分类法分类号 Q503Q781R733.7LRP16是我们用甲基化敏感的限制性
3、界标基生工生物工程公司。因组扫描(restrictionlandmarkgenomicscanning,方法RLGS)技术时发现的一个与白血病复发相关的新总RNA的提取 TRIZOL一步法提取外周血单[1]基因。从该基因现有的一段DNA碱基序列出个核细胞总RNA,1%琼脂糖凝胶电泳证明其完整发,通过与表达的序列标志(expressedsequencetag,性且无DNA污染。紫外分光光度计测OD260POD280EST)库电子杂交并进行重叠片段的组装“克隆”得,=1.88。到一段870bp的序列。本研究采用了cDNA末
4、端3′末端cDNA扩增(3′2RACE)cDNA合成:取快速扩增的方法(rapidamplificationofcDNAend,总RNA1μg,锚定引物10pmolPL(序列为5′GGC2RACE),钓取了白血病相关基因LRP16的全长CACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTT2TT-cDNA。3′),加SUPERSCRIPTⅡRNaseH反转录酶(200U)于42℃反转录合成cDNA后,RNaseH消化RNA。材料与方法聚合酶链反应(PCR):用3′2GSP1(10μmolPL)与AUAP引物(
5、10μmolPL,其序列为5′GGCCACGCGTCGACTAGTAC3′)进行第一次扩实验材料增。反应条件分两步:①94℃预变性4分钟,55℃2标本 来源于健康男性外周血。分钟,72℃40分钟;②94℃1分钟,60℃1分钟,引物及试剂 PCR引物由上海生工生物工程72℃2分钟,33个循环,最后72℃延伸10分钟。将公司合成,其中:3′2GSP1的序列为5′CCCTGC2第一次产物稀释后作为模板用3′2GSP2与AUAPAGAGCTGTAAGACTG3′;3′2GSP2的序列为5′(各10pmolPL)引物进行第二次扩
6、增,条件为94℃GATCACCGGCGGCTATCG3′;5′2RT2P为5′预变性3分钟,94℃1分钟,60℃1分钟,72℃2分GGAGCTCGGCAGCCTGACT3′;5′2GSP1为5′钟,33个循环,72℃再延伸10分钟。GGAGCTGTTGGCGGCGTTGA3′;5′2GSP2为5′5′末端cDNA扩增(5′2RACE)其方法:CCTCCCGCTGCTTGTCACT3′;5′2GSP3为5′cDNA合成及加尾:取总RNA1μg,5′2RT2PCCAGTCGGTGGAGGTGCTCA3′。RACE试剂盒和T
7、RIZOLReagent购于GibcoBRL,Life3本课题受国家自然科学基金资助 编号3997082Technologies,Inc.TaqplusⅠDNA聚合酶购于上海2000-03-28收稿;2000-09-06接受©1995-2004TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.RACE钓取白血病相关基因LRP16·19·2.5pmolPL于70℃孵育15分钟,加反转录酶显的特异带,二次扩增可见一条约180bp的特异SUPERSCRIPTⅡRT(20
8、0U)于50℃反转录合成带,见图3。cDNA后,RNaseMix消化RNA。用GLASSMAXDNAIsolationSpinCartridge柱纯化cDNA。将纯化的cDNA分成等体积2份,分别加5pmolPL的dATP与dCTP,94℃孵育3分钟后,置冰水中1小时,在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)作用下分别在cDNA的3′端加
