应用 RACE 技术扩增柞蚕 Lectin基因及原核表达载体构建.pdf

《应用 RACE 技术扩增柞蚕 Lectin基因及原核表达载体构建.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、2014年第2期皇桑茶叶通讯应用RACE技术扩增柞蚕Lectin基因及原核表达载体构建林坤章邱建烽尹志亮2刘朝良。朱保建(1．安徽农业大学生命科学学院223096；2．江西省蚕桑茶叶研究所)摘要：根据其它昆虫Lectin基因同源序列分析，设计引物对，以柞蚕幼虫总RNA为模板，采用RT—PCR技术扩增获得了176bp的部分柞蚕Lecfin基因序列。根据获得的已知序列分别设计引物，采用3一RACE和5一RACE技术手段分离、克隆柞蚕Leefin基因，将编码区全长DNA序列克隆并连接至PET一28a(+)中构建原核

2、表达载体。结果为后续柞蚕Lectin基因原核表达、抗体制备及其功能研究奠定基础。关键词：柞蚕；Lectin；RACE；原核表达载体昆虫在适应外界环境的过程中，已经形成一套于全式金公司，SMARTrMRACEcDNAAmplification自身的免疫系统，包括体液免疫和细胞免疫，而这些Kit购于BDClontech公司，BarnHI和XhoI核酸内免疫反应是由模式识别受体调节的先天免疫识别所切酶、3"4DNALigase、pMD19一T载体试剂盒购于引发的【lJ。体液免疫系统能产生包括凝集素、抗TaKaRa公

3、司，pET一28a载体购于Promega公司，其菌肽等一系列的抗菌多肽【31。凝集素是一种重要的他试剂均为国产分析纯。模式识别受体。在宿主抵御和识别外界病原物方面1．2实验方法扮演着重要的角色，已成为近几年来的研究热题之1．2．1引物设计与合成一根据核酸和氨基酸序列比对，用Primerpremier。C一型凝集素(C—typelectins)是一种钙依赖5．0软件设计用于扩增柞蚕模式识别受体Lectin部的糖结合蛋白，属于凝集素的重要成员之一，在机体分片段的引物为：176F：5’一C1’I℃GCCCAG—的免

4、疫防御、控制糖蛋白的生物合成等方面具有重CAACTCCAATA一3’和176R：5’一，I1’GAC-要的功能J。它们一般含有1个或多个由约130CCGTCGCCCAACrAAC一3’，扩增片段长度为氨基酸残基组成的糖基识别域J。近几年来，一些176bp。用于RACE—PER的引物RC3：5’一CT-新的凝集素基因陆续被报道，它们具有参与细菌的TCGCCCAGCAACTCCAATA一3’和RC5：5’一rr．识别与清除、调节血液封装和黑化等多方面的功能GACCcGTCGcCCAACTAAC一3’，根据扩增获得

5、的也一度成为研究的热点L．卜m】。柞蚕(Antheraeaper-上述基因片段设计用于扩增ORF框的引物为：fw：nyi)是我国重要的经济昆虫之一，关于柞蚕抗病能5’一GGCGGATCC—ATGTATAAGACATTCTrrr_力和防御系统相关功能基因的关系是值得研究的课GTG一3’和rev：5’一CGCCTCGAGrCAArA—题。克隆获得柞蚕凝集素基因对今后研究柞蚕的免GATA兀GGCGAA一3’(下划线部分分别为BamHI疫反应机制，提高柞蚕的抗病能力具有一定的意和XhoI酶切位点)。以上引物均由上海英

6、骏生物技义。术有限公司合成。1．2．2柞蚕总RNA的提取和反转录1材料与方法柞蚕五龄幼虫经灭活的大肠杆菌注射12小时1．1实验材料后按RNA提取试剂盒TotalRNAkit提取总RNA。柞蚕五龄幼虫由河南农业厅赠送；大肠杆菌和然后根据反转录试剂盒TranscriptorFirsts~andcD—ToplO感受态细胞由本实验室所保存。NAsynthesiskit方法进行反转录，定量检测后保存RNA提取试剂盒TotalRNAkit、质粒抽提试剂于一2O。C冰箱备用。盒、DNA纯化回收试剂盒购于OMEGA公司，反转

7、录1．2．3PCR扩增试剂盒TranscriptorFimtstrandcDNAsynthesiskit购以上步合成的cDNA第一链为模板进行Lectin·4·蚕桑茶叶通讯总第170期因而，通过模式识别受体蛋白，昆虫的先天免疫反应295．能够识别和结合不同的病原微生物，从而达到抗菌[9]Ling，E．，Yu，X．Q．Cellulareneapsubtionandn~1wfliza-tionareenhance!byimmulectins。pattemrecognitionreceptors和抑菌的作用。动物C

8、一型凝集素通过结合包括细fromthetobaccohornwormManducasexta[J]．Dev．Comp．菌、真菌和病毒等病原微生物表面的碳水化合物来Immuno1．200l6，30：289—299．促进吞噬、黑化和酶原反应等免疫反应【1驯。关于[10]Jia—LinWang，Xu—ShengLiu，QiZhang，et8l，．Ex-柞蚕的C型一凝集素及其先天免疫反应系统的研pressi