果蝇精巢fasⅢ基因原核表达载体的构建_毕业论

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1、果蝇精巢fasⅢ基因原核表达载体的构建费紫薇，生命科学学院摘要：果蝇fasⅢ基因是蛋白编码类基因，在精巢中fasⅢ基因主要在hubcell中表达，本实验运用基因克隆技术，以PET28a质粒为载体，选用BamHI、HindⅢ两种酶做双酶切，将目的基因fasⅢ导入质粒载体PET28a，从而构建原核表达载体PET28a-fasⅢ，再将重组质粒转化到大肠杆菌TOP10中，实现fasⅢ基因的原核表达。实验所用质粒载体用卡那抗性（Kanr）标记，只有转化成功的大肠杆菌才能在涂有卡那霉素的LB培养基中生长。最终目的是实现fasⅢ

2、蛋白的原核表达与纯化，为以后制备多克隆抗体奠定基础。关键词：基因克隆；fasⅢ基因；原核表达载体；原核表达；TheconstructionoffasIIIprokaryoticexpressionvectorsziweiFei，CollegeoflifescienceAbstract:DrosophilaFasgeneisproteincodinggeneintestis,mainlyexpressedinhubcell.Inthisexperiment,bymeansofgenecloningtechnique,

3、thetargetgeneFasIIIwasinsertedintotheplasmidvectorPET28awhichwasdigestedbytwoenzymesofBamHIandHindⅢ.soastoconstructtheprokaryoticexpressionvectorPET28a-fasⅢ,thentherecombinantplasmidwastransformedintoEscherichiacoliTOP10,achieveFasIIIgeneprokaryoticexpression.

4、Theplasmidvectorwasmarkedwithkanamycinresistant(Kanr),OnlywastransformedsuccessfullyEscherichiacolicangrowinLBmediumwhichwascoatedwithkanamycin.TheultimateaimistorealizetheprokaryoticexpressionandpurificationofFasIIIprotein,forthefuturelaythefoundationforprepa

5、ringpolyclonalantibody.Keywords:Genecloning；fasⅢ；theprokaryoticexpressionvector；prokaryoticexpression；11前言1.1果蝇精巢的基本特征有两个精巢，形状为长而卷曲状的管状，图示1-2[3]显示出了精巢前端的结构。精巢里有两类干细胞:生殖干细胞GSC和体节干细胞SSC。GSC有7-9个，位于精巢的顶端，与Hubcell（HC）直接接触，HC是精巢GSC微环境的重要组成部分[4]，SSC包裹在GSC周围，和HC共同构成了

6、GSC的“niche”[5]。同卵巢GSCs一样,精巢的GSCs也通过不对称分裂产生2个子代细胞，一个仍然处于微环境中，与HC直接接触，成为新的GSC，另一个远离微环境，发育为GB（gonialblast）细胞，走向分化。GB细胞经四次胞质不完全分裂形成一个16cell相连的合胞体。Fusome在GB中是圆形的，在分化的合胞体呈分支状。每个GB或合胞体都被两个SCCs围绕着，持续调控它们的分化。图1-2精巢前端的结构Fig.1-2Theleading-endstructureoftesis1.2fasⅢ基因干细胞研

7、究是目前国际研究前沿的热点之一，生殖干细胞GSC的研究对于干细胞维持与分化等领域，以及生殖医学及其相关疾病等的治疗都将提供有价值的资料。果蝇具有繁殖周期短、结构相对简单、拥有成熟的遗传分析手段及丰富的遗传学资源等特点；同时鉴于果蝇生殖干细胞分裂和分化发育过程中的细胞谱系都研究得很清楚，故果蝇的精巢和卵巢是细胞和分子水平上研究干细胞生物学的理想系统。fasⅢ基因是蛋白编码类基因，具有七个转录本，最早发现于神经细胞中，功能是以Ca2+独立的方式介导细胞粘附，在轴突发展、指导和束状的神经系统的发展发挥作用。[1]果蝇精巢

8、中fasⅢ基因主要在hubcell中表达，利用fasIII基因的表达蛋白制备多克隆抗体，进行抗原抗体免疫荧光反应，可以确定Hub细胞的位2[2]置，从而有利于对果蝇精巢干细胞的研究。1.3载体（Vectors）广义上通常把能携带外源基因进入受体细胞的运载工具叫载体。在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体[6]。1、基因工程对载体的