利用巢式PCR扩增目的基因构建hsa-miR-200c真核表达载体及鉴定.pdf

《利用巢式PCR扩增目的基因构建hsa-miR-200c真核表达载体及鉴定.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、免疫学杂志2012年1月第28卷第1期IMMUNOLOGICALJOURNALVo1．28No．1Jan．2012·59··论著·【文章编号11000—8861(2012)01—0059—05利用巢式PCR扩增目的基因构建hsa-miR-200c真核表达载体及鉴定陈登宇，陈峻崧，王净，曹文虎，张洪义，杨翠萍，窦骏【摘要】目的用巢式PCR从人类基因组获取miR～200c及侧翼序列，构建hsa—miR一200c重组体，转染卵巢癌细胞系SKOV3，检测其对E一钙粘蛋白表达的影响，为miR一200c对肿瘤细胞基因表达调控奠定基础。方法据microRNA数据库设计人miR一200c及侧翼引物，提取人细胞

2、基因组进行PCR和巢式PCR获得miR一200c及侧翼共307个碱基序列，连接到pIRES2一EGFP载体中，测序鉴定后再将的miR一200c基因经慢病毒载体系统转染SKOV3细胞，检测miR一200c过表达对卵巢癌细胞E一钙粘蛋白表达的影响。结果成功扩增出miR一200c及侧翼共307个碱基序列，构建的重组体plRES2一EGFP—miR一200c测序正确，转染SKOV3细胞后miR一200c过表达引起E一钙粘蛋白表达增多。结论巢式PCR技术能有效地从基因组中扩取miR一200c及侧翼片段用以构建miR一200c表达载体，miR一200c过表达可引起卵巢癌SKOV3细胞E一钙粘蛋白表达增多，

3、可能导致细胞间黏附性增高。【关键词】巢式PCR；miR一200c；卵巢癌；SKOV3细胞【中图分类号】R737．31【文献标识码】AConstructionandidentificationofeukaryoticexpressionvectorofhumanmiR-200cbynested-PCRCHENDengyu，CHENJunsong，WANGJing，CAOWenhu，ZHANGHongyi，YANGCuiping，DOUJunDepartmentofPathogenicBiologyandImmunology,MedicalCollege，SoutheastUniversity,N

4、anjing210009,China【Abstract】Researchshowsthathsa-miR-200cplaysanimportantroleinovariancancermetastasis．Ashsa—miR一200cmightbeusedtocontrolovariancancermetastasis．weamplifiedhsa—miR一200canditsflankingsequencebynested-PCRtoconstructitseukaryoticexpressionvector．SOastostudyitsregulatoryeffectonE—cadheri

5、nexpression．Accordingtohsa-miR-200canditsflankingsequencefrommiRdatabase，nested-PCRwasperformedtoamplifyexpectedproduct．Thetargetgenewasdigestedbydoubleendonuclease，andclonedintothepIRES2-EGFPvector．Therecombinantwasidentifiedbydoubleendonucleasedigestionandsequencingfinally．Thentherecombinantcontai

6、ningmiR一200cgenewastransfectedintoSKOV3cellsbylentivirusvectorsystem．Forty—eighthoursafterthetransfection．themiR一200cexpressionwasdetectedbyRT—PCR．andE—cadherinexpressionwasdetectedbyWesternblot．Weusednested—PCRassaytoamplifymiR一200canditsflankingsequencefromhumangenome．andconstructedmiR一200cexpress

7、ionvectorsuccessfully．Wef0undthatmoreE～cadhefinexpressioninSK0V3cellswithmiR一200ctransfectioncomparedwiththeSKOV3cellswithmocktransfection．ItiSaneffectivemethodtousenested—PCRtoamplifymicroRNAsandflan