法医物证学实验教案实验二pcr-str分型技术、dna的浓度测定

《法医物证学实验教案实验二pcr-str分型技术、dna的浓度测定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、新乡医学院教案首页课程名称法医物证学实验授课题目实验二PCR-STR分型技术、DNA的浓度测定授课对象03级法伏专业时间分配2007-3-2014：30-21：00课时目标掌握PCR-STR银染分型技术及实验结果分析，了解PCR-STR自动分型技术。掌握紫外分光光度法测定DNA浓度和评估DNA纯度。授课重点PCR-STR银染分型技术及实验结果分析授课难点PCR-STR银染分型技术授课形式实验课授课方法讲解、示教参考文献法医物证学实验指导思考题1.釆用紫外分光光度法测定DNA浓度的原理是什么？2.还有哪些方法可以测定DNA浓度？3.STR-PCR分型方法有哪些？4.ST

2、R-PCR分型技术在法医学中应用有哪些优点？教研室主任及课程负责人签字教研室主任（签字）课程负责人（签字）年月日年月日新乡医学院实验课教案课程名称：法医物证学基本内容教学手段和教学组织实验准备:1.仪器设备实验准备尽PCR扩增仪、电泳仪、ABI3130可能充分，包2•试剂(配制见附表)括各种器材。超纯水、TaqDNA聚合酶、引物、dNTP、基因组DNA、6%聚丙烯酰胺凝胶、10%APS、TEMED、10%乙醇、1%硝酸、AgNO3溶液、显色液、10%冰乙酸一、垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法源理］聚丙烯酰胺凝胶(PAG)由丙烯酰胺(Acr)和亚甲基双丙烯酰胺(Bis)聚合

3、而成。在凝胶聚合中，丙烯酰胺单体分子中的双键先打开，相互连接形成脂肪族长链分子，再由交联剂亚甲基双丙烯酰胺随机地与长链上的游离功能机团讲解实验原反应，构成三维网状结构的凝胶。打开丙烯酰胺双键必需理，回顾课本的自由基由引发剂过硫酸钱(APS)提供。凝胶聚合反应的催化剂为四乙基乙二胺(TEMED)o知识。描述聚丙烯酰胺凝胶物理特性使用两个技术参数：凝胶浓演示实验。第1页新乡医学院实验课教案课程名称：法医物证学基本内容教学手段和教学组织度(T)和交联度(C)。计算公式如下：讲解原理。T=a+b/VX100%C二b/a+bX100%式中a是Actg数，b是Bisg数，V是凝胶

4、总体积(ml)数。凝胶孔径大小主要与凝胶浓度有关，当交联度恒定时,T越小凝胶孔径越大，T越大孔径则越小。交联度C值与凝胶孔径的关系呈抛物线函数关系。C为5%时，凝胶孔径讲解凝胶配最小，平均直径大约20nm,低于5%或高于5%时凝胶孔置。径增大。在pH8.0~pH8・3的介质中，核酸分子带负电荷，向正极泳动。对于线形双链DNA,分子量的对数与电泳迁移率成反比例关系，据此可检测DNA片段长度多态性。银染法的原理是利用银离子(Ag+)或氨银络离子([Ag(NH3)2]+)的状态，渗入凝胶中与DNA分子结合成稳定的复合物。然后用甲醛作为还原剂使金属银析出，呈现黑褐色银沉淀而现

5、显出DNA分子条带。新乡医学院实验课教案课程名称：法医物证学基本内容教学手段和教学组织［注意事项］1.PCR各环节均要有防止污染的观念，并同时设立阳性与阴性（空白）对照进行监测。2.TaqDNA聚合酶使用时要在冰浴中操作，使用后要及时放入-20°C冰箱保存。3.保证凝胶聚合均匀的最佳温度为23〜25°C,温度降低会明显减慢凝胶聚合，相反温度升高会加速凝胶聚合。4.增加APS或TEMED用量，将使丙烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶变得脆弱而失去柔性。5.TEMED极易被氧化而失去催化能力，试剂中若污染有氧化剂杂质，溶液呈黄色。如果无法得到无色透明的试剂，只有适当增加用量以保证

6、凝胶聚合速度。APS容易吸潮，溶解于水后很快降解并失效，所以APS应避光、干燥、密封条件下保存，溶液要新鲜配置，4°C条件下保存不宜超过一周。6•显色液需新鲜配制，棕色瓶保存。强调注意事项。新乡医学院实验课教案课程名称：法医物证学基本内容教学手段和教学组织二、DNA的浓度测定一紫外分光光度法讲解DNA的［原理］在以紫外分光光度计测定样品的光密度时，核酸的浓度测定一最大吸收峰在260nm处，而蛋白质的最大吸收峰则在280紫外分光光nmo因而在对样品进行光密度测定时不仅可测定其浓度，度法。同时可以通过OD260/OD280的比值估计DNA的纯度。［注意事项］1.每次检测前

7、后必需将比色杯清洗干净。2.如DNA样品中含有一定RNAo用本方法测得的DNA含量不准确。3.每项次操作均需用稀释液设置对照，在260nm和280nm处校零。测定双链DNA则选择超纯水作为稀释液，测定单链DNA选择0.4mol/L、NaOH作为稀释液。核酸浓度和强调注意事吸光度间的关系如2项。双链DNA：10D双链DNA=50pg/mlDNA浓度(Mg/

8、jl)=(OD260值X50X稀释倍数)/1000