大豆子叶节遗传转化体系的优化及大豆异黄酮相关合成酶基因转基因大豆的鉴定

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1、大豆子叶节遗传转化体系的优化及大豆异黄酮相关合成酶基因转基因大豆的鉴定OptimizationofSoybeanCotyledonary-nodeGeneticTransformationSystemandIdentificationofSoybeanIsoflavoneSynthaseGeneTransgenicPlant作者姓名：姬长媛专业名称：作物遗传育种指导教师：王庆钰教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月3日本研究由转基因重大专项——优质功能型转基因大豆新品种培育（2014ZX08004-003）；国家自然科学基金——大豆MYB转录因子基因对大豆异

2、黄酮合成调控的研究(31371641）资助Projectsupportedby-NationalGMOscultivatenewvarietiessub-questio-nsoftechnologymajorprojects:Thequalityfunctionalnewvarietiesofgen-eticallymodifiedsoybeansnurtured“highisoflavonenewvarietiesofgenetic-allymodifiedsoybeannurtured(2014ZX08004-003);TheNationalNaturalSci

3、enceFoundationofChinaThestudyofthemolecularregulationmechanismonsoybeanisoflavonesbyMYB(v-mybavianmyeloblastosisviraloncogenehomolog)transcriptionfactor(31371641).中文摘要大豆子叶节遗传转化体系的优化及大豆异黄酮相关合成酶基因转基因大豆的鉴定大豆（Glycinemax（L.）Merr）最早起源于中国，到目前为止已有五千余年的栽培历史。如今，作为在全世界广泛种植的重要粮食、油料作物，对其品质产量的改良刻不容缓

4、。转基因技术的使用可以加速对大豆优质品种的培育，选育出更适合消费者食用的优质大豆。异黄酮(isoflavone)是高等植物苯丙烷类次生代谢产物中的一种，在预防疾病如癌症﹑骨质疏松症﹑心脑血管等常见病方面具有良好功效，近年来引起医药卫生﹑食品﹑农业等领域科技工作者的广泛关注。日常生活中最常见的异黄酮就是来自大豆和各种豆制品中。因此，通过对代谢途径中相关合成酶基因的研究具有重要意义。异黄酮合成途径是植物类黄酮代谢途径的一个分支，部分参与异黄酮合成的酶的表达量的改变或表达功能的丧失及酶的失活都将直接影响到黄酮类代谢产物的量。大豆异黄酮合成酶（IFS2）、查尔酮合成酶(CH

5、S)和查尔酮异构酶（CHI）是大豆异黄酮合成路径的关键酶，对异黄酮合成起到关键作用，可以直接影响异黄酮的合成量。由于大豆再生频率低遗传转化困难，本研究对已初步建立的大豆吉林47的农杆菌介导子叶节转化体系进行了优化。研究可能影响的因素，从萌发方式和时间、侵染时不同的划伤方式、共培养阶段外植体的摆放方式、芽诱导与芽伸长过程中添加不同的生长调节剂等方面进行优化。结果表明，大豆吉林47子叶节萌发选择液体营养液培养基，萌发13～14h；侵染时采用普通划伤和浸泡菌液划伤的两种方式，通过对共培养后的GUS染色效率统计，沾菌液划伤可以提高农杆菌在切口的附着率，从而提高侵染效率；通过

6、共培养过程中外植体的摆放方式，可以得出切口水平向上摆放时有利于外植体的芽诱导率。在芽伸长阶段加入浓度-1-1为50mgL的Asn和Gln、5ugL的三十烷醇可以有效促进芽伸长率和生长速-1度。在生根阶段，在3/8的MSB培养基内加入0.5mgL的IBA的为可以有效提高生根状态。按以上优化后的方法对大豆吉林47进行子叶节转化，并对含有IFS、CHS、ICHI的吉林47、吉林35和威廉姆斯82进行转基因植株进行验证。对T1、T2、代植株进行PCR检测，对得到的T2代植株进行Basta叶片涂抹检测、Bar试纸条和Westernblot蛋白检测，均可检测出阳性植株，证明目的

7、基因已经转入大豆基因组中。对大豆品种吉林47、吉林35、威廉姆斯82的转异黄酮相关合成酶基因（IFS2、CHS8和CHIⅡ）的植株后代用HPLC检测异黄酮含量。结果表明，三个品种转基因植株异黄酮含量均有提高。在吉林47和吉林35两个品种中，IFS基因对异黄酮提高最大，CHS基因对异黄酮提高量影响次之，CHIⅡ提高最小。关键词：大豆，子叶节，遗传转化，异黄酮相关合成酶，转基因株系IIAbstractOptimizationofSoybeanCotyledonary-nodeGeneticTransformationSystemandIdentificationof