大豆子叶节植株再生体系的优化及转EPSPS基因的研究-论文.pdf

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1、作物杂志Crops20l2．3大豆子叶节植株再生体系的优化及转EPSPS基因的研究王伟王罡’季静’郑丽红关春峰(。天津大学农业与生物工程学院，300072，天津；天津大学化工学院，300072，天津)摘要为提高农杆菌介导转化大豆子叶节褐化现象，从而提高转化效率。2008年，李文霞再生体系的遗传转化效率，优化了激素水平、基因等发现丛生芽伸长培养基与芽诱导培养基的6．型、抗生素及筛选压力等影响植株再生的多个因BA浓度比为1／5时可提高芽伸长率。目前，农杆素，并用s基因转化大豆子叶节。结果表明，菌介导的大豆子叶节遗传转化体系已初步建立，不定芽诱导培养基中6一苄氨基嘌呤(6

2、一BA)浓度为但其遗传转化率低、重复性差、基因依赖性强等问1．6mg／L时，不定芽诱导率最高，黑农37和合丰题严重影响着大豆遗传转化研究的效率和进35的不定芽诱导率较吉育91高，吲哚丁酸(IBA)程。诱导生根的适宜浓度为0．5～1．Omg／L。头孢霉本实验探讨了影响大豆子叶节再生系统中的素的最适抑菌浓度为500mg／L，草甘膦有效筛选不定芽诱导及生根等因素，并以草甘膦作为筛选压力为8mg／L，并获得转EPS基因的抗性植株。剂获得PCR阳性植株，进一步优化了大豆子叶节关键词大豆；子叶节；植株再生；遗传转化；遗传转化及植株再生系统。农杆菌介导1材料与方法1．1供试材料大

3、豆(Glycinemax)是重要的粮油作物和经济1．1．1大豆基因型黑农37、合丰35和吉育91作物，也是重要的工业原料¨J，利用遗传转化的方的种子由黑龙江省农业科学院和吉林省农业科学式将外源基因导人大豆来改善大豆品质、提高其院提供。经济价值，已成为大豆育种及改良的重要方法之1．1．2菌种和质粒根癌农杆菌(Agrobacterium一。由于大豆子叶节再生体系具有取材不受季节tumefaciens)EHA101，质粒pSOY12携带EPSPS基限制、诱导率高、组培成苗时间短、不易发生变异、因(抗草甘膦)，由浙江大学寿惠霞教授提供。遗传稳定性好等优点，已成为大豆遗传转化

4、常用1．1．3培养基及培养条件基本培养基为MSB受体系统之一_2J。1980年，Cheng等首先报道培养基，添加不同浓度及组合的激素、3．0％用无菌苗的子叶节为外植体，在改良的B5培养基蔗糖和0．7％琼脂，pH5．7，121c【=灭菌20min。培养上诱导丛生芽获得高频率的再生植株。1988年，温度26±1oC，光照周期16h，光照强度801xmo]／m。Hichee等用农杆菌侵染大豆子叶节获得转基因1．2试验方法大豆植株，1999年，Zhang等以Bar基因作选择1．2．1大豆子叶节外植体的获得大豆种子氯标记基因，用除草剂草铵膦进行筛选获得转化植气灭菌后接种于发芽

5、培养基(MSB+6-BA株，转化率为3％。2001年，Olhoft等在培养基2．Omg／L)上培养5d，取出保留2～3ram下胚轴，中添加硫醇类化合物来防止由农杆菌侵染导致的剥去种皮，将子叶从下胚轴处切开，除去顶芽及腋作者简介：王伟，硕士研究生，研究方向为植物组织培养及遗传转芽。化王罡为通讯作者，教授，主要从事植物基因工程研究1．2．2大豆子叶节再生体系的优化采用单因基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08004—素完全随机试验设计，研究6-BA、基因型、头孢霉001，2009ZX(】801O—O13B)收稿日期：2012—02—26素和草甘膦4

6、个因子对诱导大豆子叶节不定芽的232012．3作物杂志Crops影响以及IBA对诱导不定芽生根的影响。弓I物J芋歹0：5GCTGGCCATCGACGAGTTC3和黑农37、合丰35、吉育913个基因型的大豆5GGCCAGGAAGTTCGGGAAG3。子叶节接种于添加不同浓度(0．5、1．0、1．6、2．5、PCR反应体系：10×Buffer(MgC1220mmol／L)3．Omg／L)6-BA的不定芽诱导培养基上培养15d。2．5L；dNTP2．0L；Taq酶(2U／~L)0．25[xL；双当黑农37不定芽伸长至3cm左右时，从基部引物1．Op~L；ddH2O18．

7、25L；模板DNA1．01xL。切下转接到添加不同浓度(0、0．25、0．5、0．75、PCR反应条件：94~C变性4min；94~C变性30s，1．0mg／L)IBA生根培养基(1．5％蔗糖)中诱导生55℃退火30s，72~C延伸30s，35个循环；72延伸根。8min。PCR扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳，得以黑农37子叶节为外植体接种于添加不同浓到凝胶电泳图谱。度(0、100、300、500、700、900mg／L)头孢霉素的不2结果与分析定芽诱导培养基(MSB+6-BA1．6mg／L)上培养15d。2．16一BA浓度对大豆子叶节不定芽诱导的影响以黑农37