草鱼三个pi3kakt通路相关基因的克隆和表达分析

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1、学校代码：10264研究生学号：M120101051上海海洋大学硕士学位论文草鱼三个PI3K/AKT通路相关基因的克隆和题目：表达分析CloningandExpressionAnalysisofthreeGenes英文题目：involvedinPI3K/AKTPathwayfromCtenopharyngodonidella专业：水产养殖研究方向：水产动物种质资源与种苗工程姓名：于鸿燕指导教师：李家乐教授二O一五年六月上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注王群华东师范大学教授主席汪桂玲上海海洋大学副教授委员白志毅上海海洋大学副教授委员牛东红上海海洋大学副教授秘

2、书答辩地点水产与生命学C217答辩日期2015.6.4上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德,崇尚严谨学风。所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写,我对所写的内容负责,并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅或借阅。本人授权上海

3、海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□,在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文草鱼三个PI3K/AKT通路相关基因的克隆和表达分析摘要草鱼(Ctenopharyngodonidella)是世界养殖产量最高的鱼类。草鱼易受病原体感染，一旦感染又易引发大面积死亡，给养殖业带来重大损失。由于水产疫苗的匮乏和施药方式易对水体造成污染，选育抗病力强的草鱼良种，成为了防治草鱼病害的有效途径。PI3K/AKT信号通路，是一种

4、以磷酸化为基础的信号通路。有关草鱼PI3K/AKT信号通路的研究还是空白。本论文克隆了草鱼三个PI3K/AKT相关基因：AKT1、AKT3以及NFIL3，分析了基因序列和预测氨基酸序列的理化性质，根据同源氨基酸序列构建了系统进化树。用嗜水气单胞菌人工感染草鱼，检测了3个基因在4种草鱼免疫相关组织中的表达情况。选取NFIL3基因作为深化对象，研究了其超表达对于细菌入侵草鱼CIK细胞的影响。取得了以下结果：1．通过同源克隆和RACE法得到草鱼AKT1、AKT3和NFIL3基因的全长cDNA序列，分别为1554bp，2808bp，2018bp；分别含有编码384（1155bp），479（1

5、440bp），468（1407bp）个氨基酸的开放阅读框，预测出的氨基酸序列均无信号肽位点。2．BLAST分析发现，草鱼AKT1，AKT3和NFIL3都是较为保守的蛋白质家族成员，草鱼AKT3和NFIL3的开放阅读框与斑马鱼序列相似度最高，同为90%；草鱼AKT1的开放阅读框与斑马鱼序列相似度稍低，为81%；以不同物种的氨基酸序列为基础构建系统进化树发现三个基因的氨基酸序列都可以和其他硬骨鱼类的氨基酸序列聚为一束，说明草鱼与其它硬骨鱼类的亲缘关系最近，支持了传统的进化理论。3．普通组织荧光定量表达结果显示草鱼AKT1，AKT3和NFIL3三个基因在所检的8种组织中均有不同程度的表达，

6、其中AKT1和NFIL3在肝脏中表达量最高，AKT3在心脏中表达量最高。在嗜水气单胞菌感染草鱼后，AKT1基因在草鱼肝脏中的表达量出现显著上升，AKT3基因在肝脏和中肾中表达量明显提高，而NFIL3在中肾以及鱼类的免疫中心器官头肾中的基因表达量显著上升，并且通过Westernblotting验证NFIL3蛋白的表达量在感染后的头肾、中肾和肠道中也显著提高。4．构建草鱼NFIL3超表达质粒载体，将其转染入草鱼CIK细胞后，通过亚细胞定位技术，发现草鱼NFIL3主要在细胞核内表达，这与其作为转录因子的作用相吻合。I上海海洋大学硕士学位论文5．对超表达NFIL3后的草鱼CIK细胞进行嗜水气

7、单胞菌侵染，与转染空载体的对照组比较发现，超表达草鱼NFIL3的CIK细胞能有效减少细菌入侵的数量，并能抑制入侵后细胞的增殖。6.为探究NFIL3对细菌产生抑制效果的原因，利用双荧光素酶报告基因检测系统和荧光定量技术研究发现，超表达的草鱼NFIL3能够显著激活NF-κB活性，提高干扰素IFN和白介素IL10基因的表达。关键词：草鱼，AKT1，AKT3，NFIL3，嗜水气单胞菌II上海海洋大学硕士学位论文CloningandExpressionAnalysi