ampk和sirt-1参与定时高脂饮食对小鼠肝脏生物钟基因的影响研究

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1、fiMASOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论文苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：1也日期S滅一苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学

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3、观察定时高脂饮食对高脂性脂肪肝小鼠肝脏生物钟基因及其脂质代谢相关基因表达的影响，并探讨其可能的机制。方法：选用雄性昆明种小鼠，严格控制明/暗条件（8:00-20:00/20:00-次日8:00），以晚上（19:00）定时给予高脂饮食6周复制高脂性脂肪肝小鼠模型，然后分别在不同授时时相（8:00、12:00、16:00、20:00、24:00和4:00）处置实验动物，用比色法测定肝组织中总胆固醇（totalcholesterol，TC）、甘油三酯(triglycerides，TG)、游离脂肪酸(freefattyacids，FFA

4、)和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine+dinucleotide，NAD)含量；用光镜检查肝组织的形态学变化；用ELISA法测定肝组织中AMP依赖的蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）含量；用Real-timePCR法检测肝组织中生物钟基因Clock、Bmal1、Per1-2和Cry1-2，以及过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferator-activatedreceptor，PPAR)α、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子-1(p

5、eroxisomeproliferator-activatedreceptorgammacoactivator-1，PGC-1)α、脂蛋白脂酶（lipoproteinlipase，LPL）、二脂酰甘油酰基转移酶(diacylglycerolacyltransferase，DGAT)2、乙酰辅酶A羧化酶-1(acetyl-CoAcarboxylase-1，ACC-1)α、肉毒碱棕榈酰转移酶-1(carnitinepalmitoyltransferase-1，CPT-1)和烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamidephospho

6、ribosyltransferase，NAMPT）mRNA表达的情况；用Westernblot法测定肝组织中AMPK、p-AMPK、沉默信息调节因子-1(silentinformationregulatoroftranscription1，SIRT-1)、Cry2和Per2的蛋白表达情况。结果：在晚上定时给予高脂饮食6周后，可见小鼠肝组织中有大量的脂质空泡形成，测得的肝组织中TC、TG和FFA含量在不同时间点均有不同程度的升高，而且与正常对照组相比，TC含量的变化较平缓，但在光照期间有明显的幅度增加；TG含量亦以光照期间升高幅度

7、更为明显，于12:00达到峰值；FFA含量则未见有明显的节律改变。Real-timePCR测定结果显示，脂质代谢相关基因PPARα、PGC-1α、LPL、DGAT2、ACC-1α和CPT-1mRNA表达在节律和/或振幅上有明显改变，而肝脏生物I中文摘要AMPK和SIRT-1参与定时高脂饮食对小鼠肝脏生物钟基因的影响研究钟基因Clock、Bmal1、Per1-2和Cry2mRNA表达的量也有明显的改变。Westernblot测得Per2和Cry2蛋白表达在振幅上也发生了明显的变化。进一步的研究发现，晚上定时给予高脂饮食6周后，小鼠

8、肝组织中平均AMPK和p-AMPK蛋白表达均降低。与正常对照组相比，高脂饮食组的AMPK峰值延迟了8h，振幅在12:00和20:00有明显的统计学差异；而p-AMPK在这两个时间点，与正常对照组比较，则在12:00明显降低，在20:00显著增加。晚上定时高脂饮食