猪ttv1-orf1和ttv2-orf1基因的克隆、表达及生物信息学分析

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1、分类号：密级：学号：2013408016单位代码：10759石河子大学碩士#像铪式猪TTV1-ORF1和TTV2-ORF1基因的克隆、表达及生物信息学分析学位申请人杨蓓指导教师屈勇刚副教授李岩研究员中请学位卖^别-专业硕士专业名称兽医研究领域兽医技术服务所在学院动物科技学院中国•新疆•石河子2015年5月分类号：密级：学号：2013408016单位代码：10759石河子大学硕士学位论文猪TTV1-ORF1和TTV2-ORF1基因的克隆、表达及生物信息学分析学位申请人杨蓓指导教师屈勇刚副教授李岩研究员申请学位类

2、别专业硕士专业名称兽医研究领域兽医技术服务所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2015年5月Cloning,ExpressionandBioinformaticsAnalysisofSwineTTV1-ORF1andTTV2-ORF1GeneADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofVeterinarianByYangBeiVeterinarytech

3、nicalservicesDissertationSupervisor:Associateprofessor.QuYonggangMAY,2015石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：备时间：X)/上年6月f日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保

4、留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名:时间：>仏~年4月/曰导师签名：时间：*2^7以年6月文曰摘要Torquetenovirus(TTV)是日本科学家Nishizawa等在1997年运用代表性差异分析（Representationaldifferenceanalysis,

5、RDA)技术从不明原因的输血后肝炎患者血清中发现的一种新的环状单链DNA病毒，又名输血传播病毒、细环病毒。国内外学者先后在世界各地进行了不同动物源的TTV流行病学调查及病原学研究，发现TTV1和TTV2是仔猪多系统衰竭综合征的潜在致病病毒，ORF1可能编码该病毒的核衣壳蛋白。目前国内外通常采用PCR方法检测该病毒，该方法虽具有准确性高的优点，但难以快速广泛应用于各养殖场。血清ELISA的检测方法可以快速批量进行动物疾病的流行病调查。因此，本研究通过巢式PCR方法扩增获得猪TTV1-ORF1和TTV2-ORF1

6、全长基因，分别克隆至克隆载体pEASY-T1,验证正确后，利用生物信息学软件及在线分析软件对测序结果进行生物信息学分析,将验证正确的猪TTV1-ORF1-XJ和TTV2-ORF1-XJ亚克隆至表达载体pEASY-E1，使用工程菌菌株Transetta(DE3)、菌株BL21（DE），Trans1-T1PhageResistant化学感受态细胞进行原核诱导表达。本研究为构建猪TTV重组蛋白间接ELISA诊断方法奠定了基础。主要结果如下：1、根据Genbank上已发表的猪TTV1和TTV2全长基因序列分别设计两对

7、上下游引物，通过巢式PCR方法扩增到1917bp、1878bp的TTV1-ORF1-XJ、TTV2-ORF1-XJ目的片段，并将这两个PCR产物分别插入克隆载体pEASY-T1，测序并验证。2、利用生物信息学软件及在线分析网站对其理化性质、功能结构域及蛋白质二级结构、3D结构等信息进行了分析。结果表明TTV1-ORF1-XJ翻译得638个氨基酸，具有亲水性，磷酸化位点主要分布于丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，预测发现其N端附近有大量精氨酸，翻译得到的蛋白存在于细胞膜内外，未见信号肽序列，存在1个跨膜区以及31个B细胞

8、线性抗原表位。氨基酸稳定性分析预测该蛋白中间有一段不稳定区域。TTV2-ORF1-XJ翻译得到625个氨基酸。其他信息与TTV1-ORF1-XJ预测结果相似。3、将测序验证正确的猪TTV1-ORF1-XJ和TTV2-ORF1-XJ基因亚克隆至表达载体，转入大肠杆菌BL21（DE），和Transetta(DE3)后转入Trans1-T1PhageResistant化学感受态细胞，用IPTG在37℃和2