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《猪t细胞受体α、β链基因的克隆、多态性分析及α链基因的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、猪T细胞受体α、β链基因的克隆、多态性分析及α链基因的表达【中文】T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)作为T细胞识别内/外源性抗原的分子,在免疫应答和免疫调节中发挥着重要的作用。自20世纪80年代T细胞受体基因被先后发现和克隆以来,关于T细胞受体与机体获得性免疫、自身免疫性疾病、淋巴系统肿瘤以及与病原分子相互识别的关系得到了广泛的研究,由此引发了T细胞疫苗、T细胞受体肽疫苗和核酸疫苗研究的兴起,为人类疾病的预防和有效控制带来了新的曙光。目前,人和鼠的T细胞受体的研究较多,而对猪等动物TCR分子结构与功能研究较少,影响了
2、兽医免疫学的发展,使动物疫病预防控制实践缺乏深入的现代免疫学理论指导。本研究以GenBank上登载的猪T细胞受体α链、β链为参考序列首次在国内开展了猪T细胞受体α、β链基因的分子克隆,并运用相关的生物信息学软件对其结构与功能进行深入的预测分析,结合国外已克隆的T细胞受体基因,探讨猪TCR基因的同源性、多态性及分类方法。同时,在克隆的猪TCRα链基因中选择有代表性的基因,构建其原核重组表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,获得高纯度的结构正确的重组蛋白,为其结构和功能的进一步研究奠定基础。取得的主要进展如下:1、依据TCR基因谱系
3、发育和基因重排特征设计引物,采用RT-PCR技术,在国内首次成功的从合作猪肠系膜淋巴细胞中扩增到猪TCRα、β链基因转录本cDNA。选择猪TCRα(AB087988)和(AB087990)为参考序列,在其开放阅读框内各设计一对引物,前者参考序列引物RT-PCR扩增克隆到了12个猪TCRα基因序列(pTRAV4～15),基因间序列同源性高达91.5%～98.5%;后者扩增得到3个猪TCRα基因序列(pTRAV1～3),基因间序列同源性高达98.5%～99.6%。选择猪TCRβ链(AB079529)为参考序列,在其开放阅读框外设计一对
4、引物,扩增克隆到16个猪β链基因序列,基因间序列同源性达到92%～96.8%。克隆所得的序列经与参考链序列的比对以及BLAST的同源性搜索后,确定为猪T细胞受体α、β链等位基因家族,并将其全部提交GenBank,15个猪TCRαcDNA序列pTRA1～15获得的登录号为FJ944028～FJ944042,16个猪TCRβcDNA序列pTRB1～16获得的登录号为FJ944043～FJ944058。2、利用生物信息学软件,系统地对猪TCRα、β链基因序列及其编码蛋白的基本结构、同源性和多态性进行了预测分析。利用生物信息学软件如Clu
5、stalEGA、DNAMAN及X站NCBI(.ncbi.nlm.nih.gov/)、EXPASY(.expasy.ch/)和IMGT/V-QUEST(imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest)等对克隆到的猪TCRα、β链基因进行了一系列生物信息学及等位基因多态性的分析,分析发现猪TCRα、β链分子是一种跨膜糖蛋白,主要由胞外区、跨膜区和胞内区组成,基本结构为信号肽、FR1区、CDR1区、FR2区、CDR2区、FR3区、CDR3区、D/J区和C区,其序列位置和分布大致相同,其中TCRα链缺乏D区。猪TCRα、
6、β基因序列具有等位基因多态性现象,其多态性区域主要在V区及J区,其中CDR3区具有高度的多态性;与参考序列及国外已克隆的猪T细胞受体α链基因相比对,发现V区的多态性变化具有一定的规律性。本实验室克隆的猪TCRα基因序列之间进行比对发现,pTRA1与pTRA2和pTRA3同源性分别为98.5%和99.6%,可归为同一类等位基因;pTRA5与pTRA7、pTRA9和pTRA13同源性分别为97.7%、99.6%和98.5%,归为一类等位基因;pTRA4与pTRA12同源性为98.9%,归为一类等位基因;pTRA6与pTRA10同源性为
7、98.9%,归为一类等位基因;pTRA11与pTRA14同源性为99.3%,归为一类等位基因;pTRA8独自归为一类等位基因。与国外克隆的猪T细胞受体α基因相比,V区之间的氨基酸序列变化较大,同源性较低,说明我们克隆的基因序列应为新的猪T细胞受体α等位基因。而15个猪TCRβ链基因氨基酸序列pTRBV1～15之间同源性比较发现,在CDR3区其多态性明显,这可能与其识别和结合多样性的抗原有关;pTRBV16与pTRBV1～15进行核苷酸同源性比对发现,在第50～302位发生缺失,此区域为可变区,有可能为假基因。3、根据RyujiYa
8、mamoto等人的分类方法,将克隆到的猪T细胞受体α链等位基因V区与X站IMGT/V-QUEST中人类TCRα链基因V区进行同源性分析发现,pTRAV1、pTRAV2和pTRAV3与人TRAV16*01等位基因同源性超过80%,可归为一类;但其他的
