猪伪狂犬病野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断方法的建立及初步临床应用

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1、猪伪狂犬病野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断方法的建立及初步临床应用DevelopmentandInitialApplicationofanImmunoassayfortheDiscriminationbetweenPRV-infectedandVaccinatedAnimals作者姓名：王寅彪专业名称：预防兽医学研究方向：病原微生物与分子免疫学指导教师：张改平教授学位类别：农学博士培养单位：吉林大学动物医学学院论文答辩日期：2015年06月06日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位罗满林教授华南农业大学主席王笑梅研究员中国农业科

2、学院方六荣教授华中农业大学委员涂长春研究员军事医学科学院姜平教授南京农业大学丁壮教授吉林大学张彦明教授西北农业科技大学钱爱东教授吉林农业大学徐镔蕊教授中国农业大学欧阳红生教授吉林大学王春凤教授吉林农业大学张乃生教授吉林大学本研究受国家自然科学基金(No.31172348)、国家生猪产业技术体系（No.CARS36-36）及河南省生猪产业技术体系创新团队（No.S2012-06）的资助，在此表示感谢！ThisworkwassupportedbyNationalNaturalScienceFoundation(No.31172348),ChinaAgricultureR

3、esearchSystem(No.CARS-36),andthePigIndustryTechnologySystemInnovationTeamProjectofHenanProvince(No.S2012-06).中文摘要猪伪狂犬病野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断方法的建立及初步临床应用伪狂犬病（PR）是多种动物共患的传染病；其病原体伪狂犬病病毒（PRV）是一种猪的疱疹病毒，分类学命名为猪疱疹病毒I型（Suidherpesvirus1）。猪是PRV的传染源和自然贮存宿主，感染后表现为发热、仔猪神经症状和高死亡率、大中猪出现呼吸道症状等临床特征。消化道、呼吸道、精液、胎

4、盘及空气等是PRV的主要传播途径。PRV对于口鼻部呼吸道的上皮细胞具有非常强的嗜性；其基因组是大小约为150kb的线性双链DNA，编码70-100余种蛋白。2011年底，在河北、河南、山东、山西等多个省份许多使用Bartha-K61疫苗免疫猪场爆发了疑似PR的疫病，发病猪出现高温(40-42°C）、食欲不振、咳嗽、腹泻并伴随有系统性神经症状，新生仔猪死亡率高；病毒分离等实验证实引起这场疫病爆发的源头是变异的PRV病毒，这对PR的防控提出了严峻挑战。因此本研究对河南省及周边部分省份PRV的流行进行了血清学调查和分子进化分析；表达了PRV新流行毒株的gE蛋白和gB蛋白并

5、制备了单抗，以期建立的PRV抗原抗体ELISA检测方法和制备的胶体金快速检测试纸能在PRV鉴别诊断和免疫抗体水平评价等方面发挥作用。血清流行病学分析结果表明河南省PRVgE抗体阳性率在2012年升高至38.0%，2013年仍居高不下（31.3%）。种猪群阳性率为36.3%，育肥后期（19-25周龄）阳性率高达59.3%，后备种猪阳性率为23.8%。在2013年检测的347个猪场中，猪场阳性率为83.6%，其中豫北猪场阳性率最高为93.8%。这些数据表明PR在河南省呈严重流行态势。基于分离的12株PRV新流行株的gE、gB和gC基因开展的分子进化分析显示新流行株处于独

6、立的进化分支，与国内早期PRV分离株和其它新流行株进化关系较近，与Bartha疫苗株进化关系较远。为建立针对PRV新流行毒株抗体检测的ELISA方法，我们表达了PRV新流行株（汤阴株）的gE蛋白和gB蛋白。其中gE蛋白为可溶表达，gB蛋白为包涵体表达；利用Ni-NTA亲和层析和离子交换纯化的gE蛋白和gB蛋白分别建立了gE抗体检测的间接ELISA（gE-ELISA）和gB抗体检测的间接ELISA（gB-ELISA）方法。gE-ELISA与商品化试剂盒gpI-ELISA（IDEXX）的符合率I为88.76%；特异性（DSP）为79.15%；敏感性（DSN）为94.03

7、%。gB-ELISA与商品化试剂盒gB-ELISA（IDEXX）的符合率为93.14%；DSP为77.78%；DSN为93.64%。在检测的66个阳性场中，阳性活跃场占95.5%，阳性稳定场占4.5%。在PRVgE抗体阴性样品中，gB抗体阳性率占到了94.9%。制备了针对gE蛋白和gB蛋白上具有免疫优势的表位的单抗并建立了单抗阻断ELISA检测方法。gE单抗阻断ELISA（blockinggE-ELISA）与商品化试剂盒gpI-ELISA的符合率为94.10%；DSP为89.90%；DSN为96.18%。gB单抗阻断ELISA（blockinggB-ELISA）