鉴别鹿结核病野毒感染与卡介苗免疫间接elisa方法的建立及初步验证

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1、分类号：S858.92单位代码：10193密级：无学号：2012624硕士学位论文鉴别鹿结核病野毒感染与卡介苗免疫间接ELISA方法的建立及初步验证EstablishmentandPrimaryVerificationofIndirectELISADetectionforDeerTuberculosistoIdentifytheWildInfectionandBCGImmunization作者姓名：刘杨学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：经济动物疫病学指导教师：杜锐教授所在学院：动物

2、科学技术学院2015年5月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于论文使用授权的声明1、本人完全了解

3、吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学

4、术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日导师签名：签字日期：年月日摘要鹿结核病主要是由牛分枝杆菌引起的一种慢性、消耗性人畜共患病，该病程世界分布，严重威胁人类的健康和畜牧业的发展。随着鹿养殖数量的不断增加，饲养员因接触病畜而感染结核的病例也逐年攀升，因此，控制鹿结核病的蔓延不但有助于降低养鹿业的经济损失，也降低了饲养员的患病风险。目前，卡介苗（BCG）可以预防鹿结核病。动物接种BCG一段时间内结核菌素皮内试验结果呈假阳性，严重影响结核菌素的皮内试验检测结果。

5、RD1区和RD5区均在结核分枝杆菌中存在，在卡介苗中缺失。有资料证实RD5区的Rv3117基因能够区分动物结核病是自然感染还是卡介苗免疫，且其敏感性和特异性均高于ESAT-6蛋白。本研究克隆、表达并纯化了Rv3117蛋白，诱导表达了实验室保存的RD-1区基因的重组表达质粒并对其进行纯化获得Rv3117、Rv3872、Rv3873、Rv3874、Rv3875、Rv3878、Rv3874-3875和Rv3872-3874-3875蛋白。利用ELISA方法综合评价各蛋白作为鹿结核病ELISA检测方法的

6、候选抗原的敏感性和特异性，筛选出最优抗原Rv3872-3874-3875蛋白，建立一种能够鉴别鹿结核病野毒株感染与卡介苗免疫的方法，从而降低鹿结核病ELISA检测的假阳性。本研究主要包括以下几方面内容：（1）Rv3117基因的克隆与表达载体的构建以结核分枝杆菌标准菌H37Rv为模板，设计特异性引物，扩增只在结核分枝杆菌中存在，而在卡介苗中缺失的RD5区的基因Rv3117。将目的基因Rv3117与克隆载体pMD18-T连接，经鉴定结果显示已将Rv3117基因成功克隆至克隆载体上。将Rv3117基因

7、片段连接至表达载体pGEX-4T-1上并转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，筛取阳性克隆。（2）结核分枝杆菌野毒株与卡介苗差异基因的诱导表达及纯化对前期制备的pGEX-4T-1-Rv3117的菌种进行诱导表达，用Westernblot方法检验其是否具有结核分枝杆菌的反应原性。大量诱导表达Rv3117蛋白和实验室保存的结核分枝杆菌RD1区特异性基因的菌种。用亲和层析的方法对其进行纯化，并对纯化结果进行SDS-PAGE分析。（3）鉴别鹿结核病野毒感染与卡介苗免疫间接ELISA检测方法最优抗

8、原的筛选本试验制备兔人工感染结核分枝杆菌、卡介苗和副结核分枝杆菌的阳性血清，以差异基因蛋白为包被抗原，分别建立间接ELISA方法，比较各包被抗原建立的间接ELISA方法的重复性、敏感性和特异性。结果表明Rv3872-74-75蛋白具有较高的重复性、敏感性和特异性，可以区分野毒感染和卡介苗免疫，为后期建立鉴别鹿结核病野毒株与卡介苗免疫ELISA检测方法做准备。（4）鉴别鹿结核病野毒感染与卡介苗免疫间接ELISA方法的建立及初步应用建立检测鹿结核病的Rv3872-74-75-ELISA方法，并用PP