检测水貂阿留申病dot-elisa方法的建立及初步验证

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1、分类号：S858.92单位代码：10193密级：无学号：2012715硕士学位论文检测水貂阿留申病Dot-ELISA方法的建立及初步验证EstablishmentandpreliminaryverificationofDot-ELISAdetectionMethodofAleutianDiseaseofMink作者姓名：李晶学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：经济动物疫病学指导教师：杜锐所在学院：动物科学技术学院2015年6月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽

2、我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权

3、给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日导师签名：签字日期：年月日摘要水貂阿留申病（Aleutiandiseaseofmink，AD）是

4、由水貂阿留申病毒（Aleutiandiseasevirus，ADV）引起的一种持续性病毒性传染病。ADV感染幼貂后可引发严重的急性间质性肺炎，死亡率极高；而成年水貂感染ADV后则会形成持久性感染，症状表现为肾小球肾炎，浆细胞增多，高丙种球蛋白血症，动脉炎，生殖性能减退和自发性流产，给全球的水貂养殖业造成了严重的经济损失。由于该病致病机理特殊，至今未研制出有效的疫苗制剂，只能通过多种诊断方法筛选和淘汰病貂，达到根除疾病的目的。虽然该病的诊断方法较多，但大多数都不适合基层单位使用，即使是应用最广的对流免疫电泳（CIEP）法，也因

5、其耗时长和易散毒的缺点，限制了其在基层的推广应用。目前迫切需要建立一种更为安全简便，且能广泛应用于基层单位的诊断方法。Dot-ELISA方法除了具有常规ELISA的优点外，还具有用量少，操作简便，不需要任何仪器、成本低廉，结果易判断且能长期保存等优点，非常适用于现场检测。本试验应用PCR技术从ADV-G中扩增出VP2全长基因和VP2截短基因；通过重叠延伸剪接技术将VP2截短基因与本实验室已验证的，具有良好反应原性的两段NS1截短基因（NS1-2和NS1-3）进行融合，获得两段融合基因SPb和SPc；将VP2全长基因、VP2截

6、短基因以及两段融合基因SPb和SPc分别与克隆载体pMD18-T连接，构建重组克隆质粒并对重组质粒进行PCR、酶切及测序鉴定；将鉴定后的重组克隆质粒进行双酶切，并与原核表达载体pGEX-4T-1连接，构建重组表达质粒，进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序；将鉴定后的重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21，探索目的蛋白的最优表达条件，并对表达产物进行SDS-PAGE和Westernblot分析；SDS-PAGE结果显示4段表达蛋白均与预期大小相符，Westernblot结果显示每段蛋白均能被貂抗ADV阳性血请识别，具有良好反应原性；分别

7、对表达的4段蛋白和NS1全基因蛋白、NS1-2蛋白、NS1-3蛋白（实验室之前构建的NS1截短表达蛋白）进行纯化，再以7种纯化蛋白作为包被抗原分别建立Dot-ELISA方法；将所建立的Dot-ELISA方法与CIEP进行对比。通过对比分析可知，各抗原的Dot-ELISA方法敏感性均高于CIEP，而与其它抗原相比，融合抗原SPc作为包被抗原所建立的Dot-ELISA方法敏感性高，特异性强。关键词：水貂阿留申病，VP2基因，NS1基因，原核表达，Dot-ELISAIAbstractAleutiandisease（AD）isape

8、rsistentviralinfectiousdiseasecausedbyAleutiandiseasevirus(ADV).ADVinfectioninneonatalminkkitscausesacute,rapidlyprogressinginterstitialpneumonia