水貂阿留申病检测抗原的制备及间接elisa检测方法的建立

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1、水貂阿留申病检测抗原的制备及间接ELISA检测方法的建立PreparationoftheAleutianMinkDiseaseDetectAntigenandDevelopmentofIndirectELISA作者姓名：黄盼盼专业名称：兽医硕士指导教师：冯新副教授学位类别：兽医硕士答辩日期：2015年6月6日摘要水貂阿留申病（Aleutiandisease，AD）是由水貂阿留申病毒（Aleutiandiseasevirus，ADV）引起的自身免疫性、传染性疾病，水貂感染ADV产生的抗体不但不能有效清除病毒，反而通过Fc受体介导的抗体依赖性增强作用（AntibodyDependentEnhanc

2、ement,ADE）使病毒感染增强，导致水貂免疫系统功能紊乱。该病不仅导致貂群的繁殖能力下降，而且在一定程度上能引起水貂死亡，给养貂业带来了巨大的经济损失，也严重阻碍我国毛皮动物养殖业发展。目前尚无有效疫苗治疗该病，因此国内外主要通过抗体检测技术如对流免疫电泳（Counterimmuneelectrophoresis，CIEP）、酶联免疫吸附实验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）筛选并淘汰阳性水貂，从而控制和净化该病。本研究目的在于建立有效的水貂阿留申病间接ELISA检测方法。以水貂阿留申病美国株ADV-G结构蛋白VP2为主要参考，通过B细胞抗原表位

3、预测和保守序列筛选，获得保守性高的优势B细胞抗原表位SD序列。通过大肠杆菌表达系统诱导表达，获得了可溶性SD蛋白，大小为20KDa。表达产物经镍柱纯化、超滤管浓缩后获得高纯度、高浓度的SD蛋白。WesternBlot分析结果显示，SD蛋白具有良好的反应原性。将该蛋白作为CIEP检测抗原与商业CIEP抗原蛋白同时检测水貂血清，达到一致的检测结果。将获得的抗原SD蛋白和三氨丙基三乙氧基硅烷（3-Aminopropyltriethoxysilane，APTES）共同包被建立间接ELISA检测方法。通过方阵滴定法，摸索抗原SD蛋白和APTES的包被浓度，并摸索了包被和封闭时间，以及一抗和二抗的稀释度，

4、最终确定包被的抗原SD蛋白和APTES的浓度分别为10ug/mL和1%，一抗稀释度为1:100，二抗稀释度为1:3000，其中与传统间接ELISA比较，包被时间、封闭时间均缩短为30min。特异性试验表明建立的该方法的SD蛋白仅能被水貂阿留申病毒抗体识别，而与犬细小病毒、伪狂犬病毒、犬瘟热病毒、水貂肠炎病毒的阳性血清和水貂阿留申病阴性血清均无交叉反应；敏感性试验表明建立的该方法的敏感性高于CIEP；重复性试验表明批内重复性和批间重复性的变异系数分别为0.612%~5.956%和0.135%~7.614%，均小于10%；临床样I品检测结果与CIEP检测结果的符合率为93.2%。通过以上实验得出结

5、论：本实验中通过设计获得的全新的人工抗原SD蛋白具有良好的反应原性和作为检测抗原的能力。将SD蛋白作为包被抗原蛋白建立的间接ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高、重复性好、高效快捷的特点，且与CIEP检测方法比较具有较高的符合率。本研究不仅为常用检测方法CIEP提供更合适的基因工程抗原蛋白，也为开发检测水貂阿留申病的ELISA试剂盒及全自动ELISA检测方法提供基础研究。关键词：水貂阿留申病，B细胞表位，原核表达，间接ELISA检测方法IIAbstractAleutiandisease(AD)isanautoimmuneandinfectiousdiseaseinminkindustry,

6、whichiscausedbytheAleutiandiseasevirus(ADV).Invivoanti-ADVantibodiescannoteffectivelyremovethevirus.Incontrast,ADVinfectioncanbeenhancedbytheFcreceptor-mediatedADE,whichcanmakeimmunesystemdisorderinmink.Thisdiseasenotonlycancauseasharpdeclineofthereproductioninminkpopulations,butalsocanleadtodeathin

7、somesituation.Sothediseasebringahugeeconomiclossintheminkindustryandseriouslyhinderthedevelopmentofanimalfurfarminginourcountry.However,thereisnoeffectivevaccineforpreventingthisdiseaseyet.Inordertoer