日本血吸虫凋亡诱导因子sjaif的初步研究

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1、学校代码：10270分类号：Q95学号：122200862上善冲说L夫爹硕士学位论文日本血吸虫凋亡诱导因子&AIF的初步研究学院：生命与环境科学：学院专业：动物学研究方向：动物生物技术研究生姓名：骚_*指导教师：林矫矫完成日期：2015年4月本论文经答辩委员会全体委员审査，确认符合上海师范大学硕（博)士学位论文质量要求。以下答辩委员会签名主席（工作单位、职称）：翁_委员：，i/lp£/^r论文独创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研宄成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构己经发

2、表或撰写过的研宄成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表示了谢意。作者签名：诛泰日期：mH.I论文使用授权声明本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即-学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名：碎;

3、导师签名:ff巧巧日期：SchoolCode：10270CLC:Q95StudentNumber：122200862ShanghaiNormalUniversit

4、yMasterThesisAPreliminaryStudyonSjAIFofSchistosomaJaponicumDepartmentCollegeofLifeandEnvironmentScienceMajorZoologySpecialtyZoologicalbiotechnologyNameKanLuAdvisorJiao-jiaoLinDateApril,2015论文题目：日本血吸虫凋亡诱导因子SjAIF的初步研究学科专业：动物学学位申请人：陆看指导老师：林矫矫摘要日本血吸虫病（schistosomiasis）是

5、制约我国养殖业经济发展、危害我国人民健康的重要的人畜共患病之一。吡喹酮是目前唯一一种大规模使用的治疗血吸虫病的药物，但已有喹酮耐药虫株出现的报道，使治疗血吸虫病新药物研发更加紧迫。本实验室前期研究发现日本血吸虫在不同适宜性宿主体内的生长发育情况与虫体体细胞凋亡现象具有一定的相关性，这为血吸虫病新药物靶标的筛选提供了新的思路。日本血吸虫凋亡诱导因子SjAIF是位于线粒体内膜的一种蛋白，具有氧化还原酶和促凋亡功能。本课题组前期工作鉴定到了SjAIF的碱基序列，为了阐述该基因的生物学特性和功能，本文展开了以下研究。1日本血吸虫凋亡

6、诱导因子编码基因的克隆表达及生物学特性分析通过PCR扩增获得日本血吸虫凋亡诱导因子SjAIF基因的功能区片段，大小为828bp，编码276个氨基酸。生物信息学分析表明该蛋白不含信号肽，理论等电点为6.61。对目的基因的功能结构分析发现该基因片段包含一个4Lii（人线粒体凋亡诱导因子1）的功能区、一个吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族蛋白功能区及一个FAD/NAD(P)结合域超家族成员蛋白功能区。多重比对结果表明该基因所编码的氨基酸序列与埃及血吸虫的AIF相似性最高，达到68%。把扩增到的日本血吸虫凋亡诱导因子的功能区片段重组

7、到原核表达载体pET-28a，构建了重组表达质粒pET-28a-SjAIF，并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导其表达，SDS-PAGE分析表明重组蛋白分子量约为35kD。实时定量PCR分析表明SjAIF基因在童虫和成虫的各个发育阶段均有转录，其中7d、14d和21d虫体表达量较低，42d和28d虫体表达量较高，雌虫表达量高于雄虫。同时，对SjAIF在血吸虫非适宜宿主大鼠和适宜宿主小鼠来源虫体中的表达差异进行分析，结果表明，SjAIF在大、小鼠来源的14d，23d，32d，42d四个时期虫体中均有表达，且在这四个时期中大鼠来

8、源虫体的相对表达量均明显高于小鼠来源虫体。Westernblotting结果表明重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。ELISA分析表明重组蛋白免疫小鼠后诱导产生了较高水平的特异性IgG抗体。应用免疫组化分析显示该蛋白主要存在于日本血吸虫体被，少部份分布于实质组织中。2SjAIF真核重组质粒在293T细胞中的表达分析通过PCR技术扩增到SjAIF功能区片段，成功构建了真核重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SjAIF，利用脂质体转染法把重组质粒转入293T细胞。Westernblotting分析结果表明重组质粒在293T细胞中

9、成功表达，分子量大小约为31kD，流式细胞术实验结果表明，重组质粒转染细胞实验组的细胞早期凋亡比例为35.35%，而对照组为6.7%，实验组的细胞晚期凋亡比例为4.53%，对照组为0.7%。实验组的早期凋亡和晚期凋亡比例均明显高于对照组。推测日本血吸虫凋亡诱导因子SjAIF有一定的促凋亡作