vwf和adamts13相互作用机制的研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY博士学位论文论文题目VWF和ADAMTS13相互作用机制的研完研究生姓名指导教师姓名专业名称内科学（血液病学）研究方向血栓与止血的基础与临床论文提交日期2015年5月苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明

2、。本人承担本声明的法律责任。••驰咖论文作者签名日期：苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检

3、索。涉密论文口本学位论文属在_____年_月解密后适用本规定。非涉密论文论文作者签名：執也B期：导师签名：曰期：VWF和ADAMTS13相互作用机制的研究中文摘要VWF和ADAMTS13相互作用机制的研究中文摘要第一部分血管性血友病因子裂解蛋白酶的真核稳定表达及其活性检测目的：本研究旨在得到重组的血管性血友病因子裂解蛋白酶（ADAMTS13），进一步研究其在血栓止血中的作用。方法：利用脂质体将编码ADAMTS13全长序列的重组质粒pSecTag-ADAMTS13转染Hela细胞，用潮霉素（hygromyc

4、in-B）筛选得到阳性克隆细胞株，并扩大培养，收集上清。利用Ni-NTA琼脂糖柱，梯度咪唑淋洗法纯化蛋白，SDS-PAGE和Westernblotting鉴定纯化产品纯度和免疫学活性，采用GST-His双抗夹心法测定蛋白剪切活性。结果：成功获得一株能恒定分泌重组ADAMTS13蛋白的细胞株ADAMTS2-4，每1L培养上清可纯化到5.8mg重组蛋白。Westernblotting结果显示，ADAMTS13多抗能与重组蛋白在190kDa处显单一条带，并且蛋白具有6.4U/mL的剪切活性（每mL正常人混合血浆

5、中ADAMTS13活性为1U）。结论：重组蛋白具有较好的免疫原活性和酶活性，为进一步研究ADAMTS13作用机理和运用奠定了良好的基础。【关键词】血管性血友病因子裂解蛋白酶，真核表达，重组蛋白第二部分2B/2M型VWD的A1区突变联合血小板膜糖蛋白GPIbα影响ADAMTS13水解VWF的功能研究目的：血浆中，血管性血友病因子（VWF）多聚体分子大小由金属蛋白酶ADAMTS13特异性调节。血小板膜糖蛋白（GP）Iα重组片段结合VWF的A1区后可以增强ADAMTS13水解VWF的能力。而2B型和2M型血管性

6、血友病（VWD）分别是由I中文摘要VWF和ADAMTS13相互作用机制的研究于GPIα与VWF亲和力增强或减弱而引起出血异常的。然而，2B/2M型VWD在A1区的突变与GPIα对ADAMTS13水解VWF的影响仍需作进一步的研究。方法：真核表达了不同类型的全长人重组VWF（rVWF），包括3个2B型突变（P1337L，H1268D，R1308C）、1个2M型突变（D1302G）和野生型（WT）。3种类型的rVWF经多聚体分析、瑞斯托霉素诱导的血小板聚集（RIPA）和VWF辅因子实验（VWF:RCo-ELI

7、SA）鉴定。经鉴定后的rVWF在静止或高剪切力条件（GPIα活性片段存在或不存在）被ADAMTS13水解。结果：静止（非变性）或高剪切力条件，相较于野生型2B型突变体表现出对ADAMTS13更高的敏感性，而2M型突变体无明显差别。在静止（变性）或高剪切力（存在GPIα活性片段）条件下，野生型rVWF表现出甚至高过2个2B型突变体对ADAMTS13的敏感性。结论：位于A1区2B型突变通过对VWF自身构象的改变，能增强VWF对ADAMTS13结合从而提高敏感性。当GPIα参与时，野生型rVWF对ADAMTS1

8、3的敏感性急剧增加，而一些2B型突变却增加不明显。【关键词】血管性血友病因子裂解蛋白酶，血管性血友病因子，血小板GPIα，血管性血友病第三部分ADAMTS13单克隆抗体的鉴定以及生物学功能的研究目的：血浆金属蛋白酶ADAMTS13通过水解VWF调节分子大小，是血小板的聚集和初期止血的关键分子蛋白。ADAMTS13-VWF轴的生理重要性主要体现在遗传或获得性ADAMTS13的缺失相关的血栓性血小板减少性紫癜（TTP）。制备鼠源性