e3泛素连接酶nrdp1和socs-1对布鲁氏菌胞内生存以及布鲁氏菌所引起的细胞凋亡的影响

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1、分类号：密级：学号:2012103044单位代码：10759石河子大学硕士学位论文E3泛素连接酶Nrdp1和SOCS-1对布鲁氏菌胞内生存以及布鲁氏菌所引起的细胞凋亡的影响学位申请人车召堂指导教师陈创夫教授申请学位门类级别理学硕士学科、专业名称生物化学与分子生物学研究方向功能基因与分子免疫所在学院生命科学学院中国·新疆·石河子2015年6月StudyontheinfluenceofNrdp1andSOCS-1forbrucellaintracellularsurvivalandmacrophagea

2、poptosisinducedbybrucellainfectingADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofNatureScienceByChezhaotang(BiochemistryandMolecularBiology)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuJune,2015石河子大学学位论文独

3、创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务

4、。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。课题来源国家自然科学基金项目名称：与Nrdp1和SOCS-1互作的布鲁氏菌蛋白的筛选及其作用的分子机制研究项目编号：31260596中文摘要布鲁氏菌(Brucella)是一种强致病性人兽共染致病菌。布鲁氏菌侵染的主要目标是专业和非专业的巨噬细胞，于其内生存和繁殖。致病菌与宿主之间互作的分子机制错综复杂，也是布鲁氏菌病的病因。因此，对布鲁氏菌的胞内生存以及与宿主之间的分子互作机制的研究是有重要意义的。以泛素为主导的泛素-蛋白酶途径

5、参与了胞内多种生理生化反应的调节，本研究对小鼠E3泛素连接酶Nrdp1和SOCS-1在布鲁氏菌侵染中的影响作了初步探讨。目的：本实验以布鲁氏菌宿主细胞小鼠巨噬细胞E3泛素连接酶Nrdp1和SOCS-1基因为研究对象，分别构建干扰和过表达Nrdp1和SOCS-1基因的小鼠巨噬细胞转染模型；羊种布鲁氏菌16M侵染小鼠巨噬细胞，探究其对布鲁氏菌胞内生存和布鲁氏菌诱导的巨噬细胞凋亡的影响。方法：（1）羊种布鲁氏菌16M侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7，实时荧光定量PCR检测在侵染发生0h、2h、4h、8h、

6、12h和24h时Nrdp1和SOCS-1基因相对表达量的变化。（2）在小鼠巨噬细胞RAW264.7中，构建两个基因的干扰模型PLL3.7-Nrdp1、PLL3.7-SOCS-1和过表达模型Plex-Nrdp1、Plex-SOCS-1。羊种布鲁氏菌16M侵染干扰和过表达Nrdp1和SOCS-1基因的小鼠巨噬细胞，分别进行CFU计数，细胞凋亡率流式细胞仪分析，以及实时荧光定量PCR检测凋亡相关因子Bax和Bcl-2、肿瘤坏死因子TNF-α的相对表达量变化。(3)羊种布鲁氏菌16M侵染巨噬细胞模型，在侵染

7、发生的不同时间对JAK1、JAK2、JAK3、STAT1、STAT2、STAT3六个基因的转录水平进行实时荧光定量PCR检测，观察其表达量变化。结果：（1）随着侵染时间的变化，Nrdp1和SOCS-1的表达都分别出现了两次有规律的变化。布鲁氏菌进入细胞之后，这两个基因的表达量迅速上升，两小时后增加停止，开始下降；4h后达到最低，而后上升；8h时上升停止，开始下降，一直到24h时，都是表达下调的。2h和8h左右时，表达量是超出正常水平的。每个基因在不同侵染时间的各组中差异性显著（P<0.05）。（2）

8、分别构建Nrdp1和SOCS-1基因的两个干扰模型PLL3.7-N1、PLL3.7-N2和PLL3.7-S1、PLL3.7-S2，干扰效果分别为：66%、25%和54%、8%，选取干扰效果最好的PLL3.7-N1和PLL3.7-S1干扰模型进行侵染实验；过表达模型Plex-Nrdp1和Plex-SOCS-1两个基因的表达量分别升高了228%和332%。CFU实验显示，Plex-SOCS-1和Plex-Nrdp1组logCFU值显著低于对照组，PLL3.7-S1和PLL