e3泛素连接酶chip和nrdp1在免疫应答反应中的调控作用及其机制研究

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1、浙江大学博士学位论文E3泛素连接酶CHIP和Nrdp1在免疫应答反应中的调控作用及其机制研究姓名：杨明金申请学位级别：博士专业：免疫学指导教师：曹雪涛20120526淅江大学博士学位论文中文摘要E3泛素连接酶cHIP和Nrdpl在免疫应答反应中的调控作用及其机制研究浙江大学医学院博士研究生导师免疫学杨明金曹雪涛院士中文摘要泛素化修饰在机体的免疫系统中发挥着重要的调控作用，广泛参与免疫系统的发育以及免疫应答反应的各个阶段．关于E3泛素连接酶参与免疫应答反应调控，包括E3泛素连接酶新成员的发现或新调控机制的提出一直是免疫学研究领?域的前沿热点

2、．因此，本实验室进行了小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDc)和原代腹腔巨噬细胞全基因表达谱芯片的E3泛素连接酶表达谱分析．根据芯片数?据和前期研究成果，我们选择了E3泛素连接酶cHIP和Nrdpl开展了进一步的研究．CHIP(Carboxylte咖inusofHsc70-intemctingprotein，cHIP)是一个与分子伴侣相关的含有U．box功能域的E3泛素连接酶，目前关于CHIP在天然免疫中的调控’作用以及其作用机制研究尚不清楚．在此，我们探讨了CHlP在TLRs信号通路中的调控作用以及分子机制．在Raw2“．7细胞、小鼠腹腔巨

3、噬细胞、BMDc以及pDC细胞中，CHIP干扰后可以显著抑制TLR2，4／7／9信号通路触发的促炎性细胞因子和I型干扰素(IL．6、TNF-a和IFN．D)的产生．在BMDC中，CHIP干扰后显著抑制了LPs诱导的lL．12p70的产生以及BMDC的表型成熟。在APC中，CHIP干扰后能明显抑制LPS／CpG诱导的NF．1cB、IRF3和lFuF7的活化以及核转移，同时IL．6、IFN．p和CCL5的报告基因活化也显著受到抑制；相应的，CHIP过表达则产生相反的结果．通过GsTPuII．down和免疫共沉淀试验，我们发现CHIP可以结合H

4、sP70、TLIⅥ／9以及src和PKC‘，并通过共聚焦显微镜检测进一步证实该相互作用．在稳定表达CHIP．HA的Raw264．7细胞，CHIP能促进LPs／cpGIX浙江大学博士学位论文中文摘要诱导的Src和PKC‘的磷酸化；而CHIP被干扰后，Src和PKC‘的磷酸化受到明显抑制。体外激酶活性实验提示，在Raw264．7细胞中，cHIP干扰后能显著抑制II认Kl和TBKl的激酶活性，而cHIP．HA过表达能明显增强IRAKl和TBKl的激酶活性。体内和体外泛素化实验提示cHlP能够介导src和PKci；发生K63．1．nl(ed的多聚

5、泛素化并促使src和PKc‘活化．通过以上的研究，我们对CHIP参与天然免疫调控得出以下结论：经TLRs配体如LPS／CpG刺激后，CHIP可以募集Src和PKCc；并介导其发生K63．1inked的多聚泛素化而活化，进而通过NF．1出信号通路或TBKl和I凡枨l信号通路活化IRF3和lRF7并最终促使促进炎性因子和干扰素的产生．本部分研究揭示了CHIP在病原体模式识别信号通路中发挥重要调节作用的一个新功能，较深入揭示了CHIP与Src／PKC<复合体对TLR4／9的调节作用；该研究丰富了TLR信号传导的分子机制，创新性地提出Src／PK

6、C(调节TBKl和IRAKl并进而活化IRF3／7的通路，为I型干扰素的调节机制研究提出了新的角度．我们前期工作研究了E3泛素连接酶Nrdpl参与天然免疫的作用及相关机制，但是对于Nrdpl在适应性免疫中的作用尚未有报导．我们发现Nrdpl优势表达于CD8+T细胞，显示Nrdpl可能与CD8+T细胞的功能调节密切相关．同时发现NrdplE3泛素连接酶功能缺失(DN．Nrdpl)后能促进cD8+T细胞分泌IFN吖，穿孔素和颗粒酶，并且抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的发展和促进EAE的缓解．为进一步验证Nrdpl与EAE的关系，我们将

7、DN．NrdplCD8+T细胞回输，发现其可以抑制EAE的病程．这些结果提示Nrdpl可能参与调控CD8+T细胞的功能和T细胞介导的自身免疫性疾病的发生发展，但其机理又不同于目前所报道的其他E3泛素连接酶．有关Nrdpl参与CD8+T细胞功能调控的研究可能为E3泛素连接酶参与适应性免疫以及自身免疫性疾病提供新的机制解释，并可能为自身免疫性疾病治疗提出新的潜在靶点．关键词：E3泛素连接酶；CHIP：Nrdpl；11LR5；I型干扰素；天然免疫；自身免疫性疾病XReguIation0fimmuneresponsesbyE3ubiquitinl

8、igasesCHIPandNrdpl，andtheunderlyingmechanismSCollegeofMedicine，ZhejiangUniVersityImmunologyCandi