lrrfip2和cd11b负向调控免疫应答及其作用机制研究

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1、浙江大学博士学位论文LRRFIP2和CD11b负向调控免疫应答及其作用机制研究姓名：金晶申请学位级别：博士专业：免疫学指导教师：曹雪涛20120526浙江大学博士学位论文摘要LRRFIP2和cDllb负向调控免疫应答及其作用机制研究浙江大学医学院免疫学博士研究生金晶导师曹雪涛院士中文摘要无论是在天然免疫还是适应性免疫中，对于负向调控分子和负向调控机制的研究是近年来免疫学研究领域的前沿热点，通过开展这方面的研究既能够更好地认识免疫系统的作用方式，也能够为相关疾病的治疗提供新的思路．我们前期的研究表明，LⅪ强IP2与CDllb对于免疫应答具有负向调控作用，本课题就这两个分子发挥

2、各自免疫应答反应的调控功能与相应的作用机制开展了研究．第一部分LRRFIP2负向调控NLRP3炎性复合体的活化及其分子机制研究炎性细胞因子IL．1p在天然免疫中发挥着重要的作用，它的产生过程中既需要编码蛋白的基因转录表达产生前体，也需要一类叫做炎性复合体(inflammaSome)的分子复合物将它剪切成为成熟体．炎性复合体种类有很多，目前研究最为集中的是一类叫做NLl心3的炎性复合体(NLRP3inflammausome)，它是由模式识别受体NLl冲3与接头分子ASC以及效应分子C弱paSe．1所构成的，在一些病原体相关分子或危险信号相关分子的刺激下三者形成复合体并活化C嬲

3、p嬲e．1，使其行使剪切IL．1p的功能．为了进一步研究NLI冲3炎性复合体的活化与条件过程，我们利用免疫共沉淀技术与液相色谱联用质谱技术，寻找和NLI冲3炎性复合体相互作用的蛋白，并找到了LRRFIP2分子在LPs+ATP刺激后能够与NLl冲3炎性复合体的接头蛋白ASC结合．在本研究中，我们发现在小鼠腹腔巨噬细胞中用siIⅢA干扰L刚盱IP2表达后，NLRP3炎性复合体相关刺激引起的细胞分泌IL．1p会增加，而且这种增加是由于NLRP3炎性复合体活化水平升V浙江大学博士学位论文摘要高导致IL-lB剪切加快所引起的，而对儿-lp前体合成过程没有影响．通过免疫共沉淀实验我们发

4、现L砌珂IP2能够在活化NLl冲3炎性复合体的刺激后通过其N端氨基酸序列和Nu心3结合，进而和整个NLRP3炎性复合体相互作用。在THP．1中过表达LI沁IP2的实验表明，其N端序列和中部的Coilmotif对其负向调控NLRP3炎性复合体活化是必须的．接着我们用免疫共沉淀实验证实L鼬心IP2能够通过coilmotif与Flightless1分子结合。进一步研究FlightlessI在炎性复合体中的功能，我们发现用siRNA干扰小鼠腹腔巨噬细胞中的Fli曲tlessI后，活化炎性复合体的刺激引起的IL一1p的分泌水平与C印aSe．1的活化水平都升高．通过干扰与免疫共沉淀实验

5、，我们发现L对江IP2能够在NLl冲3炎性复合体活化之后促进FIightlessI与NLl冲3炎性复合体的结合并促进其发挥抑制炎性复合体活性的功能．最后，当我们在THP．1细胞中干扰掉FlightlessI的表达之后，再过表达LⅪ心IP2就不能抑制NLl冲3炎性复合体的活性，证明了Llu强IP2发挥抑制功能需要依赖于Fli曲tlessI．综上所述，本研究结果提示，L脚强IP2是NLI冲3炎性复合体的一个负向调控分子，能够通过N端与NLRP3相互作用并促进Fli曲tlessI与NLI冲3炎性复合体的结合来抑制NLI冲3炎性复合体的活化以及IL．1p的剪切成熟．第二部分整合素c

6、Dllb通过促进巨噬细胞产生IL．10减轻炎症反应及其机制的研究整合素在炎症反应与淋巴细胞迁移方面有重要作用，作为高表达于单核巨噬细胞上的整合素的a亚基cDllb在调控免疫反应方面的功能研究还不是很深入．在本实验室之前的工作中我们发现整合素CDllb能够通过活化syk引起肿和MyD88的降解来负向调控Toll样受体(11且)信号通路活化引起的炎症反应．．白细胞介素lO(IL-lO)是天然免疫与适应性免疫中发挥重要作用的调节性细胞因子，它能够在1rI且通路活化后上调表达从而参与炎症反应的调控过程，关于CDllb与TLR活化诱导的IL．10上调表达之问的关系还没有被报道过．在本

7、研究中我们首先发现CDllb缺陷小鼠的腹腔巨噬细胞在ToIl样受体3，4，9(TLlU，4，9)的配体Poly(I：C)，LPS和CpG．ODN刺激下lL．10的表达上升明显受到抑制．进VI浙江大学博士学位论文摘要一步利用抑制剂与过表达实验发现CDllb主要通过磷酸化巨噬细胞中的酪氨酸激酶src从而活化P13鼬通路来来增强11LR活化引起的IL．10上调表达．Src活化后，能够与P13K的p85亚基结合并使其磷酸化并促进E3泛素连接酶c．cbl介导的p85的降解，从而引起P13№信号通路的活化．P13科Akt的活化