调控抗病毒天然免疫的mirna筛选及其作用机制研究

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1、华中农业大学博士学位论文调控抗病毒天然免疫的miRNA筛选及其作用机制研究姓名：徐铮申请学位级别：博士专业：基础兽医学指导教师：陈焕春201206调控抗病毒天然免疫的miRNA筛选及其作用机制研究摘要天然免疫系统是宿主抵抗病原微生物的第一道防线，也是获得性免疫的基础。干扰素信号通路作为机体抵抗病毒感染所作出的重要应答机制，一直是病毒学和免疫学领域的研究热点。miRNA作为一种转录后水平的基因调控机制，广泛参与时序发育、神经元发育、细胞凋亡、细胞分化、脂肪代谢、激素分泌等多种生命过程。近年来的研究发现，miRNA在天然免疫系统

2、中也发挥着重要的负反馈调控功能。本研究选择了抗病毒天然免疫信号通路中的几个关键信号分子作为对象，希望通过发掘靶向这些关键基因的miRNA，加深对miRNA参与的负调控机制的认识。为今后miRNA的功能研究和开发miRNA作为疾病诊断和治疗的靶标提供理论依据。具体研究内容包括以下几方面：1．筛选poly(dAT：dAT)诱导的差异表达miRNA及其功能研究dsRNA／DNA、细菌的内毒素脂多糖和细菌的鞭毛可以被宿主的免疫系统的模式识别受体识别并触发免疫反应。LPS和dsRNA触发的免疫反应所引起的miRNA差异表达及这些miR

3、NA在免疫反应过程中的功能已经被发现和确定。但是，作为病毒在感染侵入宿主细胞复制过程中产生的中间产物，dsDNA刺激诱导的miRNA的差异表达研究尚不清楚。为了筛选dsDNA诱导的显著差异表达的miRNA，本研究选用dsDNA的模拟物poly(dAT：dAT)作为刺激物，通过miRNA芯片技术，筛选了poly(dAT：dAT)束1]激HEK一293细胞后差异表达的miRNA。发现miR一518b，miR-492，miRol81a和miR-331．3p等10条miRNA的表达显著上调；miR-383，miR-618，let．7

4、a等5条miRNA的表达显著下调。利用miRNA特异一[生Real．TimePCR验证了芯片结果。通过靶基因预测和荧光素酶报告系统验证，发现其中上调表达的miR．181a可能通过靶向DAI基因负性调节干扰素信号通路。2．筛选调控IL．6基因表达的miRNA及其机制研究白细胞介素6(IL．6)是一种重要的炎性细胞因子。细胞在受到致炎性刺激时，IL．6的表达量显著上调，并促进其它炎性细胞因子或者趋化因子的分泌，从而加重炎症反应，加速外源异物的清除。但是IL一6表达的紊乱对机体是有损害的，过量的IL一6会导致持续的炎症，并可能最终

5、导致持续炎症组织发生癌变。因此，维持IL．6正常表达的负调控机制就显得至关重要。据此，本研究利用生物信息学方法，预测可能结合于IL．63’UTR区域的miRNA。利用荧光素酶报告系统，筛选到负调控IL．6表达的miR-365。通过构建IL．63’UTR突变体的报告质粒，确定了miR．365结合于IL．63’UTR的精细位点。利用ELISA方法，证实miR-365可以从蛋白水平对IL．6进行负调控，而且这种负调控是通过抑带tJlL．6蛋白的翻译而不是影响其mRNA的稳定性来实现的。对miR．365启动子区域的分析，发现NF．r

6、B和Spl两个转录因子协同调控miR一365的转录。利用MAP对ERK的抑制剂发现MAP科ERK是miR-365上游重要的信号通路。进华中农业大学2012届博士研究生学位论文一步对miR．365潜在靶基因进行分析，发现miR。365还可能通过间接途径调控IL．6的表达。3．筛选靶向TBK．1的miRNA及其机制研究TBK．1是I型干扰素信号通路中的重要信号分子，主要功能是磷酸化转录因子IRF3和IRF7，促进它们的转定位并最终启始IFN—D的转录。TLR或RIG．I／MDA5依赖的抗病毒信号通路在TBK．1／IRF3节段交汇

7、，充分说明TBK．1激酶在整个抗病毒免疫系统中不可替代的重要性。为了发掘可能通过靶向TBK．1负调控干扰素信号通路的miRNA，本研究通过生物信息学预测miR-155可能靶向TBK．1，利用TBK．1．3’UTR的报告质粒证实了miR-155对TBK．1表达的抑制作用；过表达miR．155显著抑制TBK．1蛋白的表达，而miR-155抑制剂则增强TBK．1蛋白的表达，进一步证实了miR-155对TBK一1表达的负调控作用。利用TBK．13’UTR的突变体报告质粒，确定了miR．155与TBK．13’UTR区域的精确结合位点。

8、在证实miR．155对TBK．1的负调控作用后，进一步利用IRF3、NF．rd3和IFN。D的启动子荧光素报告质粒，证实miR．155过表达显著抑制IIU3和NF．KB的活性，并最终抑锌jlJIFN—B的转录。对TBK．1的Knockdown和Gain．offunctionassay的实验