对虾抗病微生物的筛选及其作用机制的研究

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1、中国海洋大学硕士学位论文对虾抗病微生物的筛选及其作用机制的研究姓名：孙艳申请学位级别：硕士专业：水产养殖指导教师：宋晓玲；麦康森201206对虾抗病微生物的筛选及其作用机制的研究捅要益生菌是公认的安全有效的对虾免疫增强物质，同时也是控制对虾病害的主要策略之一，目前欠缺的是对新型高效的功能性菌株的筛选和应用研究。本研究是以分离自健康对虾消化道和养殖环境的几株优势菌为研究对象，在考察它们抗WSSV感染效果的基础上，进一步分析了坚强芽孢杆菌PC024和溶藻胶弧菌LV463添加到对虾饲料中，对养殖对虾免疫酶活性、免疫相关分子表达水平以

2、及对WSSV在对虾体内的增殖速率的影响。本研究取得了坚强芽孢杆菌活菌与溶藻弧菌活菌配合使用可显著提高凡纳滨对虾抗WSSV感染的能力；抗病菌株通过提高对虾免疫水平和抗病基因表达来减缓病毒在对虾体内的增殖，从而发挥抗病毒保护作用等重要结果。本研究筛选的菌株可望以饲料添加剂的方式应用于对虾养殖生产，成为对虾白斑病生态防治的有效途径之一。主要研究内容和结果分以下几方面：1、海水细菌主要鉴定方法的应用与比较．为了寻求快速准确地鉴定细菌的方法，本实验同时采用16Sr心蛆基因序列分析法、细菌脂肪酸气相色谱法、ATB微生物鉴定系统、Biolo

3、g微生物自动鉴定系统4种方法对分离自健康对虾肠道和养殖海水的。16株海水细菌进行鉴定。结果显示：16S枞序列分析和细菌脂肪酸气相色谱法比A飓法和Biolog法鉴定步骤简单，且鉴定成本低；16Sr】心IA序列分析和A阳法鉴定到种的准确率远高于Biolog法和细菌脂肪酸气相色谱法。在具体的实践中可根据实验要求和设备条件选择合适的细菌鉴定方法，也可以将不同的方法结合起来得到更加准确的鉴定结果。2、一株海水芽孢杆菌的鉴定与生物学特性分析。从健康中国对虾养殖海水中分离纯化一株优势菌，编号为PC024，形态学观察和革兰氏染色说明该菌株为革

4、兰氏阳性菌，2216E培养基培养24h的菌落呈圆形、中间略微凸起，直径约为2mm，细胞呈杆状，端生芽孢，周生鞭毛。经Biolog碳源利用反应、脂肪酸气相色谱分析得出该菌株与坚强芽孢杆菌的生理生化特性最相近；16S枞序列测定表明与芽孢杆菌属中几株菌的同源性均达到100％以上，在分子进化树中该菌株与坚强芽孢杆菌(觑讲淞力翩淞)的进化地位最接近。综合16Sr】卧lA基因序列分析、Am微生物自动鉴定系统、BIOLOG微生物自动鉴定系统和细菌脂肪酸气相色谱四种方法的鉴定结果，将该菌株鉴定为坚强芽孢杆菌。3、4株共生菌单一或复合菌株对凡纳

5、滨对虾抗wSsv感染力的影响。将坚强芽孢杆菌pc024，蜡样芽孢杆菌PC465，溶藻弧菌Lv463和PC773活菌／灭活菌单一或组合后分别包裹于饲料中应用到凡纳滨对虾亿打D胛以口P螂’，册疗口mPf)的养殖，投喂20d后，用WSSV进行肌肉注射攻毒，感染14d后统计每个实验组的累积死亡率。从感染实验结果看出：坚强芽孢杆菌／溶藻弧菌复合组(B／V组)的累积死亡率显著低于其他各实验组和对照组(p<0．05)。饲喂含有坚强芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、两株溶藻弧菌的饲料均可显著提高凡纳滨对虾抗WSSV感染的能力，且坚强芽孢杆菌与溶藻弧菌配

6、合使用的效果最佳。4、饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾免疫相关酶活性的影响。以两种实验饲料(芽孢杆菌单一菌组、芽孢杆菌／灭活溶藻弧菌组)和基础饲料，对凡纳滨对虾进行了为期35d的养殖实验。养殖期间每5d取样，分析益生菌对对虾血清和肝胰腺主要免疫酶活性的影响。结果显示：免疫期间和感染WSSV期间各实验组对虾血清和肝胰腺的酸性磷酸酶活性(ACP)、总超氧化物歧化酶(sOD)、溶菌酶(LzM)、过氧化氢酶(POD)、酚氧化酶(PO)等相关免疫酶活性和蛋白含量较对照组显著增加(P<0．05)。结果提示：益生菌的补充可增强对虾免疫功能，从而

7、提高对虾抗WSSV感染的能力。5、饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾血淋巴免疫相关分子表达水平的影响。饲料的制备与对虾的养殖同第3章，养殖期间每5d取样，分析益生菌对对虾血淋巴酚氧化酶原(pr0PO)、超氧化物歧化酶(SoD)、溶菌酶(L删)、热休克蛋白70(HSP70)、脂多糖．p．1，3．葡聚糖结合蛋白(LGBP)、信号传导及转录激活因子(S仉订)和p．1，3．葡聚糖结合蛋白(pGBP)七种免疫相关基因的111】[斟A的表达量的影响。Real．timePCR的结果显示：免疫期间各基因总体上均显著高于对照组(P

8、染期间7种基因均呈先上调达到最大值后在下降的趋势。结果提示：益生菌的补充可激活对虾血淋巴免疫相关分子的表达，从而提高对虾抗WSSV感染的能力。6、饲料中添加益生茵对凡纳滨对虾类淋巴免疫相关分子表达水平的影响。饲料的制备与对虾的养殖同第3章，分析芽孢杆菌／溶藻弧菌组免疫期间和攻