牛mx1基因抗口蹄疫病毒作用及其抗病分子机制的研究

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1、分类号：S852.659.6单位代码：10193密级：公开学号：2011800博士学位论文牛Mx1基因抗口蹄疫病毒作用及其抗病分子机制的研究TheresearchofmechanismaboutbovineMx1inhibitingthereplicationoffoot-and-mouthdiseasevirus作者姓名：王洪梅学位类别：农学博士专业名称：预防兽医学研究方向：分子病毒学指导教师：夏咸柱研究员所在学院：动物科学技术学院2015年10月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和

2、致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日本论文由现代农业(奶牛)产业技术体系专项基金(CARS37)国家自然基金（31272586；31302095）山东省农业重大应用技术创新课题资助摘要口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，FMD)是由FMD病毒（FMDV）引起的牛、羊、猪

3、等偶蹄动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病。由于FMDV变异快、血清型多，通过疫苗免疫单一手段难以有效防控。因此，需要探索包括天然免疫在内的多种途径，综合防控口蹄疫。天然免疫特别是抗病毒基因是阻止病毒感染的第一道防线。病毒入侵宿主细胞后，病毒诱导产生干扰素（IFN），I-IFN和III-IFN在抗病毒感染的先天免疫过程中发挥重要的作用，能启动、激活Mx(Myxovirus-resistant)等抗病毒通路。研究表明，Mx蛋白可直接作用于多种RNA病毒和DNA病毒，具有天然的抗病毒功能，在天然免疫研究领域具有十分重要的地位。然而，牛Mx1抗FMDV作用尚不清楚

4、。本研究利用过表达和基因沉默技术，发现牛Mx1具有抗FMDV活性，并从牛Mx1对FMDV基因组RNA复制及其作用病毒蛋白两个层面探讨了牛Mx1抗FMDV的分子机制，主要试验结果如下:1.建立牛Mx1稳定表达细胞系BHK21-Mx1，免疫荧光技术验证牛Mx1在细胞质内表达，牛Mx1具有抗FMDV活性。利用RT-PCR方法扩增到牛Mx1基因，构建真核表达载体pcDNA3.1-Mx1，真核表达的Mx1蛋白带有Flag标签；pcDNA3.1-Mx1转染293T细胞，瞬时表达量高；再将pcDNA3.1-Mx1和空载pcDNA3.1分别转染FMDV的易感细胞BHK-21，经G

5、418筛选，获得单克隆细胞，对克隆细胞进行半跨越PCR、Westernblot鉴定，筛选出高表达牛Mx1的克隆，经传代60d以上，仍保持Mx1高表达状态，获得稳定表达牛Mx1的细胞系BHK21-Mx1及对照细胞BHK21-3.1；利用Flag单克隆抗体进行免疫荧光染色，牛Mx1蛋白表达于细胞质内；将稳定表达牛Mx1细胞系BHK21-Mx1感染FMDV，48h内能抵御FMDV100TCID50的攻击，BHK21-Mx1的细胞病毒液的TCID50比对照组BHK21-3.1降低10倍以上。结果表明，牛Mx1可抑制FMDV的复制与增殖，牛Mx1具有抗FMDV功能。2.利用

6、FMDV天然易感细胞模型，建立沉默牛Mx1的牛胎儿原代气管上皮细胞，反向验证了牛Mx1具有抗FMDV功能。针对牛Mx1基因编码区，设计、合成shRNA引物，构建慢病毒H1重组载体；将构建的shRNA重组载体分别与pcDNA3.1-Mx1载体共转染293T细胞，Westernblot检测牛Mx1的表达，筛选出对牛Mx1干扰效率最高的载体；再转染牛胎儿原代气管上皮细胞，经流式细胞分选，获得GFP阳性细胞，有限稀释法培养细胞，对培养10d以上的表达GFP的克隆细胞，进行PCR和Westernblot检测，获得沉默牛Mx1的细胞BTPE-siMx1及对照细胞BPTE-La

7、cZ；利用荧光定量RT-PCR方法，确定牛胎儿原代气管上皮细胞的α-IFN诱导终浓度1×104IU/ml、诱导时间为6h，牛Mx1表达量最高；进行100TCID50的FMDV感染，发现沉默Mx1细胞系BPTE-siMx1培养物的FMDV滴度显著高于对照细胞BPTE-LacZ。结果表明，沉默牛Mx1促进了FMDV的增殖，从反向验证了牛Mx1具有抗FMDV功能。3.建立FMDV链特异性荧光定量RT-PCR（ssqRT-PCR）检测方法，对FMDV基因组RNA定量分析，发现牛Mx1能抑制FMDV基因组RNA的复制。通过比对FMDV基因组序列，确定保守的基因序列，引入非病

8、毒的标签序