PTEN基因抗白血病作用及其机制的研究

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1、中文摘要PTEN基因抗白血病作用及其机制的研究摘要背景：与张力蛋白同源的10号染色体缺失的磷酸酶基因(phosphataseandtensinhemologydeletedonchromosometengene，PTEN)是磷酸酶家族中发现的首个抑癌基因，PTEN蛋白具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶双重活性，其脂质磷酸酶活性可以将3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)3位上的磷酸基团去掉，使PIP3转化为4，5二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，此功能在于调控细胞的增殖与凋亡。其蛋白磷酸酶活性可以抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、黏着斑激酶(FAK)的磷酸化，调节细胞的迁移及黏附。PTEN通

2、过上述多种信号传导通路影响细胞生长、分化、黏附及细胞周期进程，抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移，并促进肿瘤细胞凋亡。研究发现在多种实体瘤中存在PTEN基因的突变、等位基因的缺失或低表达，从而影响其肿瘤抑制功能，并与部分肿瘤的预后不良密切相关。近年来PTEN在造血系统肿瘤，如白血病发病中的作用逐渐受到重视，研究表明PTEN基因在白血病中存在不同程度的缺失、低表达、甲基化，而突变罕见。造血细胞PTEN基因突变或缺失的小鼠最初可以出现类似于人类骨髓增殖性疾病(MPD)表现，随后转化为急性髓系或淋巴细胞白血病，把PTEN基因突变或缺失的小鼠造血祖细胞移植到SCID鼠后，受体鼠亦发生白血病，并伴

3、有白血病细胞髓外浸润。同时PTEN基因的表达水平对区分白血病干细胞和正常造血干细胞发挥了关键作用。国内外研究表明PTEN基因的异常可能参与了白血病的发病、多药耐药、血管新生及髓外浸润。PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡的作用在多种实体肿瘤细胞中已经得到证实，而在造血系统肿瘤如白血病中的作用及其机制尚不完全清楚。K562细胞系为人慢性粒细胞白血病急性红白血病变细胞系，具有较高的P13K／Akt活性，同时低表达PTEN基因及蛋白，为我们将外源性野生型PTEN基因进行转染提供了条件。因此我们将腺病毒介导的PTEN基因转染人白血病原代细胞及K562细胞系，观察野生型PTEN对白

4、血病细胞增殖、凋亡、侵袭、细胞周期进程、多药耐药及血管新生的影响，并中文摘要检测其可能的作用机制，为基因治疗白血病提供理论依据。研究分以下三部分：第一部分腺病毒介导的野生型PTEN基因对人慢性粒细胞白血病细胞系K562及原代白血病细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响目的探讨肿瘤抑制基因PTEN对人原代白血病细胞及K562细胞系增殖、凋亡及细胞周期的影响，并对其可能的作用机制进行初步探讨。方法将携带有野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad．PTEN—GFP)或空载体腺病毒(Ad．GFP)转染人原代白血病细胞及K562细胞系。MTT检测细胞生长曲线；流式细胞仪检测腺病毒转染细胞的转染效率

5、、细胞凋亡率和细胞周期分布；光镜下检测细胞形态变化，DNAladder，Hoechst33342荧光染色检测、细胞集落形成等实验检测细胞增殖及凋亡。荧光定量PCR(FQ．PCR)检测PTEN、Bcl．2、Bcl．xL、Bax、Survivin、Xiap、Smac、Caspase-3、一7、一9、CyclinD1、CyclinD2、CDK4、P27¨叫mRNA水平变化，WesternBlot检测PTEN、Bcl．2、Akt、P．Akt水平变化。Caspase活性检测试剂盒检测Caspase．3／7、Caspase．9蛋白活性。结果1当MOI为200时，转染第三天用流式细胞仪检测腺病毒

6、转染K562细胞效率最高为81．2+5．4％。通过计数绿色荧光细胞数量检测转染原代细胞效率较低，选取了5例原代白血病细胞，平均转染效率为7．32+6．41％。2当MOI为200时在转染第3天PTENmRNA及蛋白表达水平达到最高。转染后d3，Ad．PTEN．GFP组PTEN表达mRNA水平(23．58士4．52)及蛋白表达水平(0．912士0．102)高于Ad．GFP组的mRNA(0．650士0．516)及蛋白(0．117士0．028)表达水平和未转染对照组的mRNA(O．575士0．226)及蛋白(O．086+0．021)表达水平，均P<0．01。3Ad．PTEN．GFP以感染复

7、数为200转染细胞后第5天与空载体腺病毒(Ad．GFP)相比，Ad．PTEN．GFP转染人原代白血病细胞后，细胞增殖受抑，对转染的5例原代细胞增殖抑制率为33．8-+-10．4％。Ad．PTEN．GFP以感染复数为200转染K562细胞后第5天，细胞最大生长抑制率为38．67％，明显高于Ad．GFP组的抑制率5．34％。Ad．PTEN．GFP组细胞凋亡率为22．4士2．11％，明显高于Ad．GFP组的2．8+0．67％和未转染组的0．2士0．02％，均P<0．05。4