抑癌基因PTEN在人白血病细胞株内异常表达及其机制的初步研究

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1、上海交通大学硕士学位论文抑癌基因PTEN在人白血病细胞株内异常表达及其机制的初步研究姓名：许伟榕申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：卢健20080501上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导

2、教师签名：日期：年月日日期：年月日医学分子生物学杂志，2007，4（2）：158-161JMedMolBiol抑癌基因PTEN在人白血病细胞株内异常表达及其机制的初步研究摘要人PTEN基因是一种抑癌基因，于1997年由三个研究小组同时克隆，该基因定位于第十号染色体，具有双重特异性磷酸酶活性，通过负调控多种信号通路包括三磷酸肌醇激酶(PI3K／AKT)途径、灶性粘连激酶(FAK)途径和丝裂酶原蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)途径来调节细胞的周期进展、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖与转移。在血液系统肿瘤中PTEN的研究较少，已有

3、报道认为PTEN对维持多能血液干细胞的稳定非常重要，丧失PTEN表达的小鼠血液干细胞会异常增殖从而导致其发生白血病，在70%的白血病人中发现有PI3K／AKT途径的过度活化。因此，本研究将对PTEN在白血病细胞株中的表达是否异常、表达异常的机制以及恢复其表达对白血病细胞的生长有何影响进行了初步的研究。本研究的第一部分检测了PTEN及其下游473位磷酸化（活化）的Akt蛋白在四种血液肿瘤细胞株以及正常人外周血白细胞中的表达。通过RT-PCR发现在四种不同类型造血系肿瘤细胞株（U937、K562、NB4、JurkatT）中PTEN的mRNA表达水平与正常人外周血细胞相比无明显

4、差异，而在蛋白水平，四种细胞株均呈现出表达水平的低或无，与此相对应的活化的Akt表达水平在NB4及K562细胞中均显著高于正常。上述现象表明，导致PTEN在白血病细胞株中表达缺失的机制值得深究。首先寻找在四种白血1上海交通大学医学院生物化学与分子生物学专业硕士学位论文病细胞株中有无PTEN的直接突变，发现仅在U937细胞中其磷酸酶活性的核心区域有4个碱基（CCCG）的插入，而在其他细胞株内未发现有突变。该突变国外已有研究报道，并认为其导致了在U937细胞中PTEN翻译的提前终止，接着用DNA甲基化酶抑制剂5’-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶以及蛋白酶体抑制剂MG132对细胞分别进

5、行处理，分别观察对PTEN表达的影响，发现在甲基化酶抑制剂处理后PTENmRNA的表达水平并未发生改变；而在MG132处理后，NB4、K562和JurkartT细胞中PTEN的蛋白表达水平均有上调，而在K562细胞中最为显著，说明在K562细胞中可能存在对PTEN的泛素化修饰，从而调控蛋白质的稳定性。Co-IP的方法进一步验证了在NB4及K562细胞中均存在PTEN与E3连接酶NEDD4-1直接相互作用，而在K562细胞株中NEDD4-1的表达明显高于正常人外周血细胞。我们以此初步认为在K562细胞中PTEN的不稳定表达是由于其泛素连接酶的高表达所致。为了进一步了解PTE

6、N在白血病发生发展中的作用，根据第一部分实验结果，选择在PTEN低表达而磷酸化Akt高表达的K562细胞中进行PTEN的过表达，研究其对细胞生物学行为影响的研究。利用电转的方法将受强力霉素调控的PTEN基因真核质粒表达系统转染K562细胞，同时以转染pTet-splice空载体和未转染质粒的K562细胞为对照组，G418筛选获得阳性克隆，RT-PCR和Westernblot验证过表达情况；收集细胞经MTT法检测细胞增殖情况；流式细胞仪检测细胞周期分布、细胞凋亡和细胞分化状态；利用软琼脂集落生成实验检测细胞致瘤能力。Westernblot结果验证了筛得PTEN高表达多克隆细

7、胞系；K562-PTEN细胞与对照组比较，实验组细胞生长速度减慢，出现细胞周期阻滞；而对细胞分化、凋亡无明2上海交通大学医学院生物化学与分子生物学专业硕士学位论文显影响；软琼脂集落生成实验结果表明：在过表达PTEN后，K562的致瘤能力显著下降，克隆生成率明显低于对照组（p<0.01）。综上所述，本研究以抑癌基因PTEN为研究对象，对其在白血病细胞株中的表达水平及异常表达的机制作了初步探索。我们证实在四种白血病细胞株中均存在PTEN的低表达，并且其异常表达的机制是多样的，PTEN的高表达会造成K562细胞细胞周期发生阻滞、细胞