cres蛋白抗病原微生物作用及其机制研究

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1、上海交通大学博士学位论文博士学位论文CRES蛋白主病原微生物作用及其机制研究作者姓名：学号：指导老师：申请学位：学科专业：研究方向：培养单位：答辩日期：基金资助：王莉0107109025徐晨教授博士人体解剖与组织胚胎学生殖生物学基础医学院2013年5月国家自然科学基金资助项目(编号：30800592)上海交通大学博士学位论文DOCToRALDISSERTATIONANTIMICRoBIALACTⅣITYANDTHEMoLECULARName：MECH删ISMoFCRESPRoTEINLiWangStudentID：0107109025Advisor

2、：ProfessorChenXuDegreeExpected：DoctoralDegreeDiscipline：HumanAnatomy,HistologyandEmbryologyResearchField：ReproductiveBiologyInstitute：ThesisDefenseDate：Foundationfund：CollegeofBasicMedicineMay2013NSFC(No：30800592)上海交通大学博士学位论文上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取

3、得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：瑚．．一日期：劢侈年歹月7日上海交通大学博士学位论文上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段

4、保存和汇编本学位论文。保密口，在一年解密后适用本授权书。本学位论文属于

5、不保密耐。(请在以上方框内打“√")学位论文作者签名：五韵)日期：刃7弓年歹月、7日指导教师签名：日期：3口，哆年，月7日上海交通大学博士学位论文CRES蛋白抗病原微生物作用及其机制研究摘要生殖道感染是危害男性生殖健康的主要因素之一，也是引起男性不育的重要原因。CKES蛋白一胱蛋白酶抑制剂相关的附睾精子发生蛋白(cystatin-relatedepididymalspermatogenicprotein)又称为CST8，属于胱蛋白酶抑制剂超家族中Family2即cyatatin

6、s的一个亚类。CRES蛋白特异地表达于小鼠睾丸和附睾，其表达谱具有明显的年龄变化规律，提示其可能在精子发生过程中发挥重要作用，但研究发现Cres基因敲除小鼠生育力正常。CRES蛋白具有四个保守的半胱氨酸残基，通过形成两个二硫键来维持其三维结构。近年来，陆续有文献报道CST3、CSTl1具有抗菌功能，这些报道促使我们研究该亚类中另一个成员—CI通S蛋白是否也具有抗病原微生物功能。首先，我们采用GST融合蛋白表达系统成功地表达纯化了可溶性CRES蛋白(GST-CRES)。然后采用菌落形成单位法和分光光度测定法检测CRES蛋白是否具有抗大肠杆菌(Ecol

7、i)和溶脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum，Uu)的功能。结果显示，与培养至对数生长期的Ecoli或Uu共孵育，CRES蛋白可抑制Ecoli或Uu的生长，且这种效应具有明显的时间一剂量依赖性。应用定点突变技术使CRES蛋白第105位或厂和第139位的半胱氨酸残基突变为丝氨酸残基，以分别破坏或同时破坏其两个二硫键，继而研究二硫键突变体的抗Ecoli及抗Uu功能。结果显示，与正常的GST-CRES蛋白类似，二硫键突变体同样具有明显的抗Ecoli和抗Uu功能，说明CRES蛋白的抗微生物功能不依赖于其二硫键发挥作用。进而，我们区段表达CR

8、ES蛋白并检测其活性发现，N端的30个氨基酸(N30)完全失去了抗微生物的活性，而N60与CRES全长蛋白相似，均可明显抑制Ecoli和洮的生长，表明CRES蛋白的抗微生物活性中心可能存在于其N端第31至60个氨基酸之间。最后研究了V上海交通大学博士学位论文CRES蛋白对Ecoli通透性和大分子物质(DNA、RNA、Protein)合成的影响来探讨其抗菌机制，发现CRES蛋白可以使Ecoli的通透性增加，内容物外流，并且可以抑制其基因与蛋白的合成。综上所述，本研究首次发现CRES这一特异表达于睾丸、附睾的蛋白具有抗菌及抗支原体功能，提示其在抵抗病原

9、微生物入侵，预防雄性生殖道感染以及维持生殖道内环境的稳态等方面发挥重要作用，本研究结果可能为男性生殖道感染的诊断与治疗提供