应用蛋白敲除技术降解ErbB家族的抗乳腺癌作用及其机制研究

《应用蛋白敲除技术降解ErbB家族的抗乳腺癌作用及其机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号：密级：学位类别：R737．9科学学位团专业学位口学校代码：学号：学科门类：10622010601042医学又亨章眚科矢辱博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：应用蛋白敲除技术降解ErbB家族的抗乳腺癌作用及其机制研究TITLE：StudyonsimultaneoustargetingoftheentireErbBreceptortyrosinekinasesfordegradationbytheproteinknockoutsysteminbreastCanCer一级学科：临床医学二级学科：肿瘤

2、学论文作者：孔凡铭指导教师：郝希山教授导师组成员：任秀宝李慧周蓬勃天津医科大学研究生院二。一三年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：圣匕盟日期：砷I弓年』月厶，日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位

3、论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在——年解密后适用本授权书。本论文属于不保密囱。(请在相对应的方框内打“√”)学位论文作者签名：虿』丝墼日期：沙B年r月落日导师签名：日期：≯I>年，月矿日天津医科大学博士研究生学位论文中文摘要目的：采用“蛋白敲除”技术一即调控SCF泛素一蛋白水解酶的底物特异性，降解乳腺癌细胞内磷酸化的ErbB家族蛋白，在细胞及动物模型中观察对乳腺癌细胞增殖、化疗敏感性以及细胞恶

4、性转化的影响；探讨、研究蛋白敲除技术降解ErbB家族的抗肿瘤机制，为开发针对ErbB家族的新型抗肿瘤靶向药物提供理论基础。方法：1、(1)为验证前期所构建peDNA3．0．F．Trcp．She和pcDNA3．0．F—Trcp．Shc(F198V)质粒的功能，瞬时转染293T细胞，免疫共沉淀(Co—IP)法检测F．Trcp—She泛素连接酶与ErbB蛋白的相互作用；Westernblotting检测F．Trcp—Shc对ErbB蛋白的降解作用；将相应质粒与His．Ub共转染293T细胞，检测F．Trcp—Shc对ErbB2泛素化

5、作用的影响；(2)将peDNA3．0．F．Trcp—Shc和pcDNA3．0一F—Trcp．She(F198V)质粒酶切，亚克隆入pBMN．GFP，构建重组逆转录病毒载体pBMN—GFP—F—Trcp．She及pBMN．GFP．F．Trcp—She(m)，将该重组质粒转化DH5a感受态大肠埃希菌，筛选阳性克隆，经酶切、测序鉴定：(3)将重组质粒与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞，包装获得携带目的基因的重组逆转录病毒；(4)逆转录病毒感染ErbB过表达乳腺癌细胞系SKBR3、BT474，流式细胞仪分选G

6、FP阳性表达细胞，Puromycin加压筛选7天，Westemblot检测Flag蛋白表达。2、(1)WesternbloRing、Real．timePCR检测筛选后乳腺癌细胞系SKBR3及BT474中ErbB家族的蛋白、mRNA表达情况；流式细胞仪检测ErbB家族膜蛋白表达情况；(2)Westernblotting检测蛋白酶体抑制剂MGl32、溶酶体抑制剂氯喹对F—TrCP—ShcE3泛素连接酶诱导ErbB家族蛋白降解的抑制作用；(3)Westernblotting检测F．TrCP．SheE3泛素连接酶降解乳腺癌细胞内Erb

7、B家族蛋白对其下游信号通路活性的影响。3、(1)在细胞模型中，通过细胞计数、AnnexinV／PI双染色法、X1vr、平板克隆形成实验等方法，观察蛋白敲除方法降解ErbB家族对细胞增殖、细胞凋亡、化疗敏感性以及细胞恶性转化的影响；(2)通过乳腺癌细胞BT474裸鼠移植瘤模型，评价ErbB家族蛋白降解对细胞恶性转化以及肿瘤的发生、发展的影响。4、逆转录病毒感染人正常乳腺上皮细胞MCF一10A，流式细胞仪分选GFP阳性表达细胞，Puromycin加压筛选7天，Westernblotting检测筛选后MCF．IOA中ErbB天津医科

8、大学博士研究生学位论文家族的蛋白表达情况：观察ErbB磷酸化蛋白降解对细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期及化疗敏感性的影响。结果：l、(1)F．Trcp—She泛素连接酶能识别、结合ErbB2，并促进ErbB2多聚泛素化，诱导其降解；(2)pBMN—GFP—F—Trep—She、p