抗凋亡蛋白c-flip泛素化降解机制的研究分析

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1、原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：壶灶日期：逊垂丛霉．印园关于学位论文使用授权的声明本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文论文作者签名期：逖蚴凹司山

2、东大学硕士学位论文目录摘{要“1符号说明一6前言一8】肿瘤81．1肿瘤及肿瘤治疗一81．2肺癌一82细胞凋亡92．1细胞凋亡概念·‘92．2生物学特征102．3分子机制102．4细胞凋亡与肿瘤‘122．5caspase与细胞凋亡133c-FLIP···-153．1肿瘤细胞中的c-FLIP‘153．2c．FLIP的作用机制163．3c-FLIP的泛素化降解’163．4靶向c．FLIP的抗肿瘤药物’174蛋白质泛素化降解’184．1泛素蛋白酶体途径’185泛素连接酶’205．1含有HECT结构域的E3s‘215．2含有RING指状结构域的E3s～2l5．3含有U．box结构域的E3

3、s‘216Cullin蛋白家族一226．】Cullin蛋白复合体的结构一226．2Neddlation化的cullin家族蛋白236．3Cullin蛋白对底物的识别·‘23i山东大学硕士学位论文7BTB蛋白家族·237．1BTB结构域237．2BACK结构域·247．3BTB蛋白的分类247．4BBP蛋白家族25实验捌科和方法26l实验材料·262试剂和耗材·263仪器设备·274溶液和试剂配方·294．1细胞培养所用试剂和配方294．2蛋白裂解所用试剂和配方·294．3蛋白免疫印迹所用试剂和配方304．4质粒转化所用试剂和配方334．5免疫共沉淀所用试剂和配方335实验方法·

4、345．1．细胞培养345．2免疫共沉淀实验·355．3WesternBlot检测蛋白变化365．4RNAi抑制基因表达··385。5质粒构建395．6质粒转染细胞·44实验结果46lCisplatin促进c-FLIP—L的降解并升高BTBD6．462BTBD6和c．FLIP．L相互结合462．1免疫共沉淀验证c．FLIP．L与BTBD6结合在一起··462．2BTBD6和c．FLIP在细胞内共定位··473．BTBD6能够诱导c．FLIP的降解-·483．1过表达BTBD6能够诱导c．FLIP的降解483．2siRNA抑制BTBD6表达，诱导c．FLIP升高·494．BTBD

5、6促进c．FLIP的泛素化降解··························-·-494．1BTBD6促进c．FLIP蛋白的泛素化，‘‘‘49山东大学硕士学位论文4．2BTBD6与c-FLIP·L的caspaSe—like结构域相结合·505．Cullin3与BTBD6促进c—FLIP的泛素化降解及caSpaSe8的切割515．1BTBD6通过BTB结构域与c．FLIP蛋白结合．5l5．2Cullin3与BTBD6相互结合525．3Cullin3能促进caSpase8蛋白的切割活化··53讨论s4附录S9剿醯山东大学硕士学位论文抗凋亡蛋白c．FLIP泛素化降解机制的研究摘

6、要研究目的全球癌症发病率和死亡人数迅猛上升，癌症是目前威胁人类生命健康的主要病因。化学药物是治疗癌症的重要手段之一，因此寻找安全高效的化疗药物显得尤为重要。但现有化疗药物的肿瘤靶向性差，对机体正常细胞的毒副作用强等特点极大地限制了化学疗法的发展，因此寻找特异性抗肿瘤的药物作用靶点是化疗发展的关键，也是科学界关注的热点。其中，死亡受体信号转导通路中的c．FLIP是很有潜力的肿瘤治疗的新靶标。肿瘤细胞过度表达凋亡抑制蛋白而耐受凋亡是肿瘤发生、发展的标志之一。最近的研究表明c．FLIP是一种重要的凋亡抑制蛋白，在许多不同类型的肿瘤细胞FLIP过度表达。c．FLIP过度表达抑制死亡配体

7、如FasL和TRAIL与DISC的结合而抑制caspase．8的活化，从而阻止肿瘤细胞凋亡，同时c．FLIP的下游调节能敏化肿瘤细胞的凋亡。研究表明，众多小分子抗肿瘤药物主通过泛素一蛋白酶体途径降解c．FLIP从而促进肿瘤细胞凋亡的。泛素蛋白酶体主要通过E3泛素连接酶特异性识别底物蛋白从而精确地调控蛋白的降解。因此，鉴定凋亡抑制蛋白c—FLIP的降解过程中起重要作用的E3泛素连接酶，对于确定新的肿瘤治疗靶标、了解肿瘤细胞凋亡信号通路的调控机制及抗肿瘤药物的作用机制都至关重要。研究方法1．肿瘤