20(s)-原人参二醇通过抑制pi3kaktmtor信号途径诱导人乳腺癌mcf-7细胞凋亡

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1、提要20(S)-原人参二醇（Protopanxadiol,PPD）是从西洋参（PanaxquinquefoliumL.）茎叶总皂苷中提取、分离、转化而得到的人参二醇组皂苷元，分子式为C30H52O3，相对分子质量为460.70，具有广谱的抗肿瘤作用。本研究选用人乳腺癌MCF-7细胞作为研究对象，探讨PPD通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号途径诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用机制。本研究通过MTT法、荧光染色法、流式细胞术、蛋白免疫印迹、QPCR、细胞转染、siRNA干扰技术及免疫组化等多种方法，从形态学、蛋白及基因水平探讨PPD诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡作用

2、及体外、体内诱导MCF-7细胞凋亡的作用机制。结果表明，PPD可明显抑制MCF-7细胞增殖，呈剂量依赖关系；PPD可诱导MCF-7细胞凋亡，提示PPD抑制MCF-7细胞增殖可能是通过诱导细胞凋亡实现的；PPD从蛋白和基因水平下调Bcl-2的表达，上调Bax的表达，通过上调Bax/Bcl-2的比率使MCF-7细胞的线粒体膜电位下降，激活Caspase蛋白家族，促使PARP剪切，通过线粒体途径诱导MCF-7细胞凋亡；PPD通过上调p53的kip1表达和下调p27、C-myc、CyclinD1和CDK4的表达诱导MCF-7细胞G0/G1期阻滞。PPD对MCF-7细胞PI3K/

3、AKT/mTOR信号途径及其下游靶蛋白磷酸化具有抑制作用；mTOR过表达能抑制PPD诱导的MCF-7细胞凋亡；体外瞬时转染mTORsiRNA可增强PPD诱导的MCF-7细胞凋亡。PPD对裸鼠体内MCF-7细胞移植瘤具有抑制作用并可诱导肿瘤细胞凋亡；免疫组化结果显示PPD可使P-AKT、P-mTOR、Bcl-2表达降低，Bax表达升高。综上所述，PPD是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号途径诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡。I中文摘要20(S)-原人参二醇通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号途径诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡研究目的：基于PI3K/AKT/mTOR信号

4、途径探讨20(S)-原人参二醇（PPD）诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用及分子机制。研究方法：采用MTT法检测PPD对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用，计算24h的IC50值；荧光倒置显微镜观察PPD对MCF-7细胞生长状态、AO/EB、DAPI染色后细胞形态的影响；流式细胞术检测PPD对AnnexinV/PI染色后细胞凋亡率、线粒体膜电位变化及细胞周期的影响；分光光度法检测PPD对Caspase-3和Caspase-9活性的影响；检测加入Caspase家族广泛抑制剂z-VAD-fmk后，PPD对细胞凋亡率的影响；WesternBlot检测PPD对Caspase

5、-3、Caspase-9、PARP、kip1Bcl-2、Bax及G0/G1期相关周期蛋白p53、p27、C-myc、CDK4、CyclinD1蛋白表达的影响；QPCR检测PPD对Bcl-2及Bax基因水平的影响。WesternBlot检测PPD对MCF-7细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白AKT、P-AKT（Thr308）、P-AKT（Ser473）、PTEN、P-PTEN（Ser380）、GSK-3β、P-GSK-3β（Ser9）、mTOR、P-mTOR（Ser2448）表达及下游靶蛋白P-FoxO1（Ser256）、P-MDM2（Ser166）、P-NF

6、-κBp65（Ser536）的影响；检测体外瞬时转染mTOR过表达及mTORsiRNA质粒对PPD作用MCF-7细胞24h后，细胞存活率及凋亡率的变化，WesternBlot检测mTOR磷酸化水平及Bcl-2和Bax蛋白表达的变化。制备裸鼠体内MCF-7细胞移植瘤模型，观察PPD对肿瘤抑制率、脏器系数、肿瘤组织HE染色及TUNEL染色的影响；免疫组化法检测PPD对P-mTOR、P-AKT、Bax及Bcl-2的表达的影响。III研究结果：1.PPD通过线粒体途径诱导MCF-7细胞凋亡PPD对MCF-7细胞增殖有明显的抑制作用，呈剂量依赖关系，24hIC50值为33.33μ

7、M；PPD（0、15、30和60μM）作用于MCF-7细胞24h后，光镜下观察，可见随着PPD浓度的增加，MCF-7细胞数量显著减少、逐渐出现悬浮细胞且折光性越来越差；经AO/EB染色后荧光倒置显微镜下观察，可见随着PPD浓度的增加，越来越多的凋亡细胞被EB染色，发出橙黄色或橙红色荧光；经DAPI染色后荧光倒置显微镜观察，可见随着PPD浓度的增加，核染色质凝集，蓝色荧光增强，且细胞核固缩；AnnexinV/PI染色后流式细胞术检测，可见随着PPD浓度的增加，细胞凋亡率增大，呈剂量依赖关系；流式细胞术检测，随着PPD浓度的增加，明显观察到∆