20(s)-原人参二醇通过抑制pi3kaktmtor信号途径诱导人乳腺癌mcf-7细胞凋亡

20(s)-原人参二醇通过抑制pi3kaktmtor信号途径诱导人乳腺癌mcf-7细胞凋亡

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时间:2019-03-15

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1、提要20(S)-原人参二醇(Protopanxadiol,PPD)是从西洋参(PanaxquinquefoliumL.)茎叶总皂苷中提取、分离、转化而得到的人参二醇组皂苷元,分子式为C30H52O3,相对分子质量为460.70,具有广谱的抗肿瘤作用。本研究选用人乳腺癌MCF-7细胞作为研究对象,探讨PPD通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号途径诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用机制。本研究通过MTT法、荧光染色法、流式细胞术、蛋白免疫印迹、QPCR、细胞转染、siRNA干扰技术及免疫组化等多种方法,从形态学、蛋白及基因水平探讨PPD诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡作用

2、及体外、体内诱导MCF-7细胞凋亡的作用机制。结果表明,PPD可明显抑制MCF-7细胞增殖,呈剂量依赖关系;PPD可诱导MCF-7细胞凋亡,提示PPD抑制MCF-7细胞增殖可能是通过诱导细胞凋亡实现的;PPD从蛋白和基因水平下调Bcl-2的表达,上调Bax的表达,通过上调Bax/Bcl-2的比率使MCF-7细胞的线粒体膜电位下降,激活Caspase蛋白家族,促使PARP剪切,通过线粒体途径诱导MCF-7细胞凋亡;PPD通过上调p53的kip1表达和下调p27、C-myc、CyclinD1和CDK4的表达诱导MCF-7细胞G0/G1期阻滞。PPD对MCF-7细胞PI3K/

3、AKT/mTOR信号途径及其下游靶蛋白磷酸化具有抑制作用;mTOR过表达能抑制PPD诱导的MCF-7细胞凋亡;体外瞬时转染mTORsiRNA可增强PPD诱导的MCF-7细胞凋亡。PPD对裸鼠体内MCF-7细胞移植瘤具有抑制作用并可诱导肿瘤细胞凋亡;免疫组化结果显示PPD可使P-AKT、P-mTOR、Bcl-2表达降低,Bax表达升高。综上所述,PPD是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号途径诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡。I中文摘要20(S)-原人参二醇通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号途径诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡研究目的:基于PI3K/AKT/mTOR信号

4、途径探讨20(S)-原人参二醇(PPD)诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用及分子机制。研究方法:采用MTT法检测PPD对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用,计算24h的IC50值;荧光倒置显微镜观察PPD对MCF-7细胞生长状态、AO/EB、DAPI染色后细胞形态的影响;流式细胞术检测PPD对AnnexinV/PI染色后细胞凋亡率、线粒体膜电位变化及细胞周期的影响;分光光度法检测PPD对Caspase-3和Caspase-9活性的影响;检测加入Caspase家族广泛抑制剂z-VAD-fmk后,PPD对细胞凋亡率的影响;WesternBlot检测PPD对Caspase

5、-3、Caspase-9、PARP、kip1Bcl-2、Bax及G0/G1期相关周期蛋白p53、p27、C-myc、CDK4、CyclinD1蛋白表达的影响;QPCR检测PPD对Bcl-2及Bax基因水平的影响。WesternBlot检测PPD对MCF-7细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白AKT、P-AKT(Thr308)、P-AKT(Ser473)、PTEN、P-PTEN(Ser380)、GSK-3β、P-GSK-3β(Ser9)、mTOR、P-mTOR(Ser2448)表达及下游靶蛋白P-FoxO1(Ser256)、P-MDM2(Ser166)、P-NF

6、-κBp65(Ser536)的影响;检测体外瞬时转染mTOR过表达及mTORsiRNA质粒对PPD作用MCF-7细胞24h后,细胞存活率及凋亡率的变化,WesternBlot检测mTOR磷酸化水平及Bcl-2和Bax蛋白表达的变化。制备裸鼠体内MCF-7细胞移植瘤模型,观察PPD对肿瘤抑制率、脏器系数、肿瘤组织HE染色及TUNEL染色的影响;免疫组化法检测PPD对P-mTOR、P-AKT、Bax及Bcl-2的表达的影响。III研究结果:1.PPD通过线粒体途径诱导MCF-7细胞凋亡PPD对MCF-7细胞增殖有明显的抑制作用,呈剂量依赖关系,24hIC50值为33.33μ

7、M;PPD(0、15、30和60μM)作用于MCF-7细胞24h后,光镜下观察,可见随着PPD浓度的增加,MCF-7细胞数量显著减少、逐渐出现悬浮细胞且折光性越来越差;经AO/EB染色后荧光倒置显微镜下观察,可见随着PPD浓度的增加,越来越多的凋亡细胞被EB染色,发出橙黄色或橙红色荧光;经DAPI染色后荧光倒置显微镜观察,可见随着PPD浓度的增加,核染色质凝集,蓝色荧光增强,且细胞核固缩;AnnexinV/PI染色后流式细胞术检测,可见随着PPD浓度的增加,细胞凋亡率增大,呈剂量依赖关系;流式细胞术检测,随着PPD浓度的增加,明显观察到∆

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