泛素连接酶rnf6在恶性血液肿瘤中的功能及其机制研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY博士学位论文论文题目__________泛素连接酶RNF6在恶性血液肿瘤_______________中的功能及其机制研究研究生姓名_________韩昆昆__________指导教师姓名毛新良药理学_________肿瘤药理学2015年5月苏州天学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体

2、，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：鮮睞日期：-的-苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位

3、论文属在____年_月解密后适用本规定。非涉密论文0论文作者签名：咳4^%$日期：斤-导师签名：^M(a曰期：筒令以泛素连接酶RNF6在恶性血液肿瘤中的功能及其机制研究中文摘要泛素连接酶RNF6在恶性血液肿瘤中的功能及其机制研究中文摘要第一部分RNF6在恶性血液肿瘤中功能的初步分析目的：目前，环指蛋白RNF6在恶性血液肿瘤中的功能及其分子机制尚未报道。本项目首先检测了RNF6在多发性骨髓瘤和白血病病人样本以及细胞株中的表达情况，并利用慢病毒过表达系统和shRNA干扰技术分析RNF6在多发性骨髓瘤和白血病细胞中的作用，以期阐述RNF6在恶性血液肿瘤中的相关

4、功能。方法：(1)通过q-RT-PCR和RT-PCR方法检测了病人样本以及正常骨髓（NBM）样本中RNF6的mRNA表达水平；(2)利用Immunoblotting技术检测了RNF6在6种多发性骨髓瘤细胞株（H929、KMS11、LP1、OCI-My5、OPM2和RPMI-8226）以及7种白血病细胞株（AML2、HL60、NB4、THP1、K562、Jurkat和697）中的表达丰度；(3)通过生长曲线和集落形成实验检测过表达RNF6对白血病细胞增殖以及集落形成能力的影响；(4)利用shRNA干扰技术检测沉默RNF6对白血病细胞增殖的影响；(5)通过台

5、盼蓝染色计数法检测白血病细胞中过表达RNF6对硼替佐米敏感性的影响。结果：(1)采用q-RT-PCR和RT-PCR对病人样本和正常骨髓样本中RNF6的表达进行分析，发现RNF6的mRNA水平在恶性血液病病人样本中存在高表达；(2)与正常骨髓样本相比，RNF6在多发性骨髓瘤和白血病细胞株中蛋白质水平比较高；(3)生长曲线和集落生成实验表明，过表达RNF6能够显著促进白血病细胞生长I中文摘要泛素连接酶RNF6在恶性血液肿瘤中的功能及其机制研究和集落形成能力；(4)shRNA沉默RNF6能够明显抑制白血病细胞的生长；(5)利用慢病毒介导RNF6，使之在白血病细

6、胞中高表达，可以显著减弱K562对硼替佐米的药物敏感性。小结：RNF6在多种多发性骨髓瘤和白血病的病人样本和细胞株中均存在异常高表达。同时，过表达或者沉默RNF6以后，都能显著地促进或者抑制癌细胞增殖。以上这些结果表明，RNF6可能与恶性血液肿瘤的发生发展密切相关。另外，过表达RNF6可以减弱K562细胞对硼替佐米的药物敏感性，这提示，RNF6还可能与癌细胞的耐药性相关。第二部分5AHQ对RNF6的转录调控机制分析目的：已有研究发现，喹啉类似物5AHQ具有很强的抗多发性骨髓瘤和抗白血病活性。同时，前期通过DNAMicroarray发现，5AHQ可以显著影

7、响RNF6的mRNA水平。本项目将进一步阐述RNF6的转录调控机制，从而进一步揭示5AHQ抗肿瘤的相关分子机制。方法:(1)多发性骨髓瘤和白血病细胞株经5AHQ加药处理24小时后，利用MTT法检测药物的细胞毒活性；(2)5AHQ分别处理多发性骨髓瘤细胞株（OCI-My5和RPMI-8226）和白血病细胞株（AML2和K562）24小时后，提取细胞总蛋白和总RNA，分别经Immunoblotting或者RT-PCR检测RNF6的蛋白或mRNA水平；(3)UCSC网站预测RNF6的启动子序列，并构建RNF6的启动子截断体，然后利用荧光素酶双基因报告系统检测R

8、NF6启动子截断体的荧光素酶活性；(4)利用TFSearch软件预测RNF6核心