泛素连接酶hoil-1l在线粒体自噬中的功能与机制分析

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1、万方数据键分子一直是领域内的热点问题。在本研究中，我们建立了CCCP刺激诱导线粒体自噬的模型以及评价体系，并对RBR家族蛋白进行深度调研，筛选出一个与Parkin结构非常相似的泛素化连接酶HOtL一1L(heme—oxidizedIRP2ubiquitinligase1like)参与线粒体自噬的调节。主要研究结果如下：1．建立线粒体自噬的模型及其检测体系1)通过使用特异性抗体对多种肿瘤细胞系裂解液中Parkin及HOIL一1L蛋白表达水平进行检测，发现Parkin在不同肿瘤细胞系中表达不尽相同，而HOIL一1L表达较为广泛

2、。因此，选取了没有Parkin表达的HeLa细胞进行模型建立。2)利用线粒体呼吸链解偶联剂CCCP和寡霉素Oligomycin联合处理HeLa细胞，通过破坏线粒体膜电势诱导细胞线粒体损伤的发生。利用免疫荧光的手段，在CCCP刺激24h时，观测到线粒体外膜蛋白TOM20所指示的线粒体由正常的丝网状结构分裂为片段化。3)在诱导细胞线粒体损伤模型时，通过外源过表达己知调控分子Parkin，验证了在CCCP刺激24h时，可以造成线粒体的清除。4)完善自噬检测体系，在CCCP刺激条件下，验证自噬标志物LC3会在线粒体定位及累积。2．

3、泛素连接酶HOIL．1L介导Parkin非依赖线粒体自噬的发生1)通过已建立的线粒体自噬模型，过表达RBR家族蛋白HOIL．1L可以一定程度上介导Parkin非依赖线粒体自噬的发生。2)通过已建立的线粒体自噬模型，过表达RBR家族蛋白HOIP无法介导Parkin非依赖线粒体自噬的发生。3)建立稳定过表达mitoKeima细胞的线粒体自噬模型。4)在稳定过表达mitoKeima细胞中对上述现象进行验证，证明在过表达HOIL．1L时，线粒体自噬指数上升。5)此外，利用AnnexinV-FITC／PI凋亡试剂盒排除了诱导细胞线粒

4、体自噬模型早期会产生细胞凋亡的影响。万方数据3．泛素连接酶HOIL一1L促进Parkin依赖线粒体自噬的发生11通过敲低HOIL。1L发现，在过表达Parkin的细胞中，刺激依赖的线粒体降解被抑制，而表现出Parkin突变体产生的表型。．21在过表达Parkin且同时分别过表达HOIL．1L、HO口以及二者的组合进行相互作用实验，结果显示，Parkin与HOIL一1L存在相互作用。当HOIL．1L与HOIP共表达时，相互作用增强。提示我们，HOIL．1L可能通过帮助Parkin解除自抑制来参与线粒体自噬调控。综上，我们的研

5、究主要发现了一个RBR家族的泛素化连接酶HOIL．1L可以介导Parkin非依赖途径细胞线粒体自噬的发生。而在Parkin依赖线粒体自噬中，HOIL一1L可与Parkin相互作用，从而促进Parkin依赖线粒体自噬的发生。关键词：线粒体自噬泛素连接酶HOIL．1LRBR家族4万方数据NovelFunctionofE3UbiquitinLigaseHOIL—ILInMitophagyABSTRACTAutophagyisakindofself-protectionandstressresponsemechanismwhene

6、nergynutritiondeficiency．Broadlyspeaking，autophagymeanstotakeaggregatedproteinsincytoplasmordamagedorganelles，whichenclosedinautophagosome，tolysosomefordegradation．Thisprocesscannotonlyproduceaminoacids，nucleotides，freefattyacidnutrientsandothersmallmoleculesofnut

7、rientstocompensateforthelackofexternalnutrientsupply,alsocaneffectivelyremoveaginganddamagedorganelles，suchasperoxisomes，endoplasmicreticulum，mitochondriaandribosomesandSOon，inordertomaintaincellularhomeostasisandachievetheorganellesupdate．Mitochondriaarethe”power

8、plant”ofenergyconversionineukaryoticcells．Accompaniedbytheoccurrenceofoxidativephosphorylation，theycouldinevitablyproducealargenumberofreactiveoxygenspe