线粒体自噬在sodi转基因小鼠中的研究

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1、河北医科大学硕士学位论文线粒体自噬在SODI转基因小鼠中的研究姓名：张欣申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：宋学琴201203中文摘要线粒体自噬在SODl转基因小鼠中的研究摘要目的：肌萎缩侧索硬化(Amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是一种进行性加重的神经系统变性疾病，累及上下运动神经元，主要临床表现为进行性加重的肌肉萎缩、肌无力，其感觉系统一般不受累，缺乏有效的治疗方法，病人常在发病后3．5年因呼吸肌麻痹而死亡。90％～95％的ALS为散发性，5％～10％的ALS为家族性，其中约20％的家

2、族性肌萎缩侧索硬化被证实由Cu／Zn超氧化物歧化酶(SODl)基因突变所致。目前ALS的发病机制尚不清楚，可能是多元的，包括氧化应激、谷氨酸兴奋毒性、线粒体功能障碍、异常的蛋白质聚集、轴索运输障碍和凋亡等。近年来线粒体功能障碍在ALS的发生发展中所起的作用越来越受到人们的重视。线粒体是细胞内最重要细胞器之一，提供细胞生存所需能量，传递细胞信息，介导细胞凋亡，调节钙离子浓度等。运动神经元的线粒体功能是否正常至关重要。在生理条件下，机体可以通过自噬途径清除异常的蛋白质和受损的细胞器，如线粒体、内质网、过氧化物酶体等，以实现细胞器

3、的更新，维持细胞稳态，保持旺盛的生理状态，自噬障碍可导致很多神经变性病，过多的或过少的自噬都是有害的。线粒体经自噬途径被选择性的清除，即线粒体自噬。线粒体不断的进行增殖和自噬，来维持线粒体的正常形态、数目和功能等。LC3II(Microtubule—associatedprotein1lightchain3-II，LC3II)特异地参与自噬泡形成，被认为是自噬泡的“标志物”。P62是一种LC3／At98连接蛋白，在自噬过程中绝大多数被清除，常被人们作为自噬途径通畅与否的标志物。有研究报道自噬相关基因7(Autophagy—r

4、elatedgene7，At97)缺陷的小鼠骨骼肌中出现线粒体肿胀、嵴断裂、呼吸链活性下降等。在ALS中，人们也已发现：线粒体嵴断裂、消失、空泡化、呼吸链活性下降等改变。那么，ALS中线粒体自噬是否存在障碍，这和SODl蓄积是否存在相关性，仍需进一步研究。SODl．G93A转基因小鼠是目前研究ALS最为理想的动物模型之一。本实验旨在研究线粒体自噬在SODl．G93A转基因小鼠中的情况，探讨其中文摘要在ALS的发生和发展中所起的作用。方法：选取SODl．G93A转基因雌性小鼠为实验组，根据病程分为60天组、症状早期组、终末期组

5、，选取90天的雌性阴性小鼠作为对照组，各组12只。以10％水合氯醛(350mg／Kg体重)腹腔注射麻醉，处死小鼠，取腰髓迅速投入液氮冷冻，之后保存于．80。C冰箱；采用Pereoll密度梯度离心法分离得到小鼠脊髓线粒体组分和去线粒体胞浆组分；枞多聚甲醛经心脏灌注，之后剥离小鼠腰髓，用4％多聚甲醛浸泡或用2．5％戊二醛固定组织。利用电镜技术、Westernblot技术和激光共聚焦技术观察SODl．G93A转基因小鼠腰髓运动神经元的形态并检测LC3II和P62在小鼠腰髓各组分中的含量。结果：1．SODl．G93A转基因小鼠腰髓总

6、的LC3II的含量：利用Westernblot技术检测SODl．G93A转基因小鼠腰髓总的LC3II表达量，示症状早期组和终末期组较对照组增加，60天组较对照组无明显变化。利用激光共聚焦技术检测LC3II与SMl32共定位隋况，发现在症状早期和终末期出现荧光斑点状聚集，60天组和阴性对照组均无斑点状聚集。SODl．G93A转基因小鼠腰髓前角细胞形态学变化：利用电镜我们观察到，症状早期组及终末期组SODl．G93A转基因小鼠腰髓前角细胞中出现大量空泡聚集，60天组和阴性对照组无明显空泡。。2．线粒体组分和去线粒体胞浆组分中LC

7、3II的含量：利用Percoll密度梯度离心法分离得到线粒体组分和去线粒体胞浆组分，利用Westernblot技术分别检测两组分中LC3II的蛋白含量，发现症状早期组和终末期组线粒体组分中LC3II的含量较对照组明显增多，去线粒体胞浆组分中LC3II的含量较对照组明显减少。利用激光共聚焦技术检测LC3II与线粒体标记物VDAC共定位情况，示在症状早期组和终末期组VDAC与LC3II共定位增加。3．线粒体组分中P62的含量：利用Percoll密度梯度离心法提取线粒体，利用Westernblot技术检测线粒体组分中P62含量，发

8、现随着疾病的进展，症状早期组和终末期组P62的含量较阴性对照组明显增加，60天组较对照组无明显变化。结论：通过对SODl．G93A转基因小鼠腰髓前角细胞的形态学观察及中文摘要对LC3II和P62的测定，本实验结果表明，随着疾病的进展，SODl．G93A转基因小鼠腰髓总LC3II的蛋白水平是