雷帕霉素对sodi转基因小鼠线粒体质量控制机制的影响

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1、河北医科大学硕士学位论文雷帕霉素对SODI转基因小鼠线粒体质量控制机制的影响姓名：韩敬哲申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：宋学琴201203中文摘要雷帕霉素对SODl转基因小鼠线粒体质量控制机制的影响摘要目的：肌萎缩侧索硬化(Amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是一种以运动神经元选择性丢失为主要特征的神经系统退行性疾病，表现为进行性肢体无力和瘫痪，并最终进展至呼吸肌，危及生命，一般发病后3—5年死亡。ALS的发病机制包括多种假说，如兴奋性氨基酸毒性，氧化应激，免疫学机制、线粒体功能障碍和异常蛋

2、白的聚集等。然而，选择性运动神经元丢失的根本原因依然不详，目前仍无特效治疗方法。随着研究进展，人们发现线粒体功能障碍在ALS发生发展过程中起着至关重要的作用，线粒体成为ALS各种病生理改变的病理交汇点，线粒体功能障碍可能成为ALS发病的始动因素，但是目前对于线粒体功能障碍的原因尚不十分清楚。线粒体作为细胞内供能的细胞器，其重要性毋庸置疑。生理状态下，机体可以通过线粒体质量控制机制修补、清除损伤、衰老的线粒体，减少ROS的产生，维持线粒体的更新。线粒体质量控制机制主要包括包括线粒体动力学和线粒体自噬两方面，是调节线粒体形态、功能的

3、主要机制。研究发现线粒体分裂、融合机制失衡会产生一种和正常线粒体大不相同的超微结构的改变，和ALS当中线粒体形态和功能的改变极其类似。除此之外，人们还发现，无论在ALS患者还是动物模型的运动神经元细胞中均存在大量形态异常的线粒体和突变蛋白的蓄积。以上发现均提示线粒体质量控制机制可能存在异常。我们前期实验已经证实在SODlG93A转基因小鼠腰髓中线粒体质量控制机制确实存在障碍(包括线粒体分裂、融合机制的失衡和线粒体自噬的障碍)。机体可以通过自噬途径清除异常蛋白和受损的细胞器，如线粒体、内质网，过氧化物酶体等，维持机体正常的生理功能

4、，损伤、衰老的线粒体被自噬途径选择性的清除即线粒体自噬。线粒体分裂、融合机制和线粒体的自噬属于一对相互作用的过程，线粒体分裂可以促进线粒体自噬，同时线粒体自噬可以调节线粒体的分裂。考虑到线粒体分裂、融合机制和线粒体自噬的相互作用，在ALS／fl鼠腰髓中，线粒体分裂、融合机制的失衡可能和线粒体自噬障碍存在某些相关性。因此我们推测，应用自噬激活剂雷中文摘要帕霉素促进线粒体自噬可能会改善线粒体分裂、融合失衡的情况。雷帕霉素，最早被用做免疫抑制剂，属于一种经典的自噬激活剂，可以通过抑制mTOR途径激活自噬，在细胞的生长、分化和能量利用密

5、切相关。早期人们认为自噬是没有选择性的，自噬泡只是随机的吞噬胞浆中的成分和细胞器，但是最近人们研究发现在自噬激活的组织中发现自噬泡包裹吞噬细胞成分的时间是不相同的，这说明白噬对“货物”的选择是具有一定的程序性的。在饥饿激活自噬的细胞，线粒体自噬占据了自噬流量的80％，而细胞其余组分仅占20％，这说明饥饿所诱导的自噬对线粒体具有一定的选择性。我们前期实验研究发现，SODl转基因小鼠模型当中，随着疾病进展，自噬流量的分布发生改变(线粒体导向的自噬流增加、蓄积，胞浆中非线粒体导向的自噬流减少)，这种白噬流量的分布异常可能和该疾病中自噬

6、途径的紊乱存在一定的相关性。SODlG93A转基因小鼠是目前研究ALS较理想的动物模型，本研究通过短期给予雷帕霉素干预，观察SODlc'93A转基Nd,鼠腰髓中调控线粒体分裂的磷酸化的动力相关蛋白1(p．Drpl)和调控线粒体融合的视神经萎缩蛋白1(OPAl)、融合蛋白1(Mfnl)的表达情况；进一步观察在自噬激活情况下，LC3II和P62在线粒体和胞浆组分中的分布情况。弄清在SODlc'93A转基因小鼠腰髓中线粒体分裂、融合机制失衡和线粒体自噬障碍的相关性，深入了解在白噬激活状态下自噬流的分配情况，探讨自噬流分布异常和胞浆中异

7、常蛋白聚集相关性，并评估应用自噬激活剂对ALS进行治疗的可行性。方法：雷帕霉素(Sigma，R0395)，用DMSO溶解成25mg／ml，进一步用生理盐水稀释成1：200(v／v)，采用腹腔注射方法给药(XiaojieZhangeta1．，2011．)。选取90天的ALS转基因小鼠(同窝雌性)随机分为2组：雷帕霉素干预组：雷帕霉素、DMSO和生理盐水混合物，2mg／kg／天，3只；安慰剂组：DMSO和生理盐水混合物，2mg／kg／天，3只。连续给药8天。处死小鼠提取总蛋白，分离腰髓线粒体、提取线粒体和胞浆(不含线粒体)蛋白，利用

8、Westernblot方法，检测给予药物干预后线粒体分裂蛋白P．Drpl和线粒体融合的OPAl、Mfnl的变化情况。同时观察自噬泡标志物LC3II和代表“自噬流”的P62在线粒体和胞浆的分布情况。并利用spssl3．0对数据进行分析。中文摘要，结果：1、给予雷帕