细胞自噬过程中线粒体差异蛋白分析

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1、学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。作者签名：聋丝日期：丝互墨f阿弓口哥关于学位论文使用授权声明本人完全了解温州医学院有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将

2、学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。眺丛牡。日期：尘盟．，：弓o＼学位论文作者签名：导师签名：D吼咖4温州医学院硕十学位论文引言早在1962年，Ashford等就在胰高血糖素处理的小鼠肝细胞中观察到了细胞自噬(autophagy)现象【lJ。1963年，DeDuve在国际溶酶体生物学论坛上首次提出了细胞自噬的生物学概念：指细胞在缺乏营养和能量供应时，部分细胞质与细胞器被包裹进一种特异性的双层膜或者多层膜结构的自噬体(autophagosome)中，形成的自噬体再与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome)，胞

3、质和细胞器成分在这罩被降解为核苷酸、氨基酸、游离脂肪酸等小分子物质，这些小分子物质可以被重新利用合成大分子或者合成ATP【2】。自噬作为细胞生存的一种机制，在很多生理过程如清除损伤、衰老细胞器以及冗余蛋白上发挥着重要作用【3】。除营养和能量缺乏外，氧化应激、感染以及蛋白质大量聚集等因素也可以诱导细胞发生自噬14】。通过自噬，细胞可以在饥饿条件下存活数天甚至数周。但是过度激活的自噬会引起细胞发生程序性死亡，这种细胞死亡方式被定义为II型细胞程序性死亡，以电镜下出现大量双层膜结构的自噬体为形态学特征f5】。自噬在许多重大疾病的发生发展过程中扮演着重要

4、角色。研究发现，自噬与肿瘤的发生和治疗有着密切的关系。一方面，由于肿瘤细胞的生长常超越其血供应而处于营养缺乏的环境中，很可能利用自噬维持其生存。有人提出肿瘤的发生需要自噬的参与【6】。另一方面，肿瘤细胞可以通过自噬发生自发性或者化疗诱导的细胞死亡。使用自噬诱导剂使抗凋亡的肿瘤细胞发生自噬性死亡可能是对肿瘤进行化疗的一个新方向(丌。但是人们发现在乳腺癌、卵巢癌以及前列腺癌等肿瘤细胞中，重要的自噬相关基因Beclin1发生了缺失【8】，这使一些通过诱导自噬来杀伤肿瘤细胞的药物不能发挥很好的效果。因此，了解自噬在肿瘤发生发展过程的调控机制，并据此寻找新

5、的肿瘤治疗靶点正成为目前细胞生物学领域的一个新的研究热点。虽然人们很早就观察到了自噬现象的存在，但直至lJ20世纪90年代，人们才在酵母中发现并鉴定了自噬相关基因，从而对自噬的分子机制有了一定研究【9】。研究发现，在自噬及自噬性细胞死亡过程中，线粒体起着重要的作用。线粒体损伤可能是引起细胞发生自噬的重要信号。由于线粒体会产生ROS，而且线粒体DNA比较容易发生突变，因此线粒体是细胞内非常容易受到损伤的细胞器。细胞主要通过特异性自噬来清除发生损伤的线粒体，从而维持细胞内环境的稳定【l01。越来越多的研究表明，线粒体自噬是一种特异性的过程，线粒体通透

6、性孔道通透性的改变在这个过程中起着重要的作用。酵母线粒体外膜蛋白Uthlp在这个过程中起着关键作用【111。在敲除自噬相关基因At97的小鼠肝脏细胞中，异常的线粒体数目明显增岁12】。有趣的是，在细胞发生自噬时，虽然大量线粒体发生了自噬而被清除，但细胞内的ATP水平却发生了明显升高【l31。线粒体发生特异性自噬的7温州医学院硕士学位论文机制还有待进一步研究。另外，线粒体在自噬性细胞死亡过程中也起着重要作用。众所周知，BCL．2蛋白家族是细胞发生内源性凋亡通路的重要调节因子，BCL-2可以阻止线粒体跨膜电势的降低，从而抑制细胞发生凋亡【l引。研究发

7、现，BCL．2和BCL．XL等抗凋亡蛋白也可以抑制细胞发生自噬性细胞死亡，而BNIP3和Bax等促凋亡蛋白可以加速细胞发生自噬性死亡【5】。因此，线粒体与自噬性细胞死亡必然有着密切联系。在BNP3引起的自噬性细胞死亡中，没有检测到细胞色素c和AIF等促凋亡因子的释放fl51。因此，线粒体是通过与介导细胞凋亡并不相同的方式介导细胞发生自噬的，其具体机制尚不清楚，但可能与线粒体膜通透性的改变有关。综上所述，了解细胞自噬时线粒体发生的生理变化及其分子机制有助于我们更好的阐明细胞自噬的调控机制及其生物学意义。蛋白质组学是细胞生物学研究的一个有力工具，已经

8、有研究对细胞自噬进行了蛋白质组学研究，如Anders等使用双向电泳与MOLDI．TOF相结合的方法对大鼠肝细胞自噬时所产生的自噬体进行了