《长链非编码rna tuc40-在胚胎心脏发育中作用的初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
東兩大聲硕±学位论文长链非编码ＲＮＡ７Ｘ／Ｃ￥０－在巧胎也脏发育中作用的初步研究专业名称：儿科学研巧生姓名：李慧娟导师姓名：整莖 －ＲＮＡ－Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎ７Ｔ／Ｃ￥０化ｇｅｍｂｒｏｎｉｃｈｅａｒｔｄｅｖｅｏ－ｙｌｐｍｅｎｔａｒｅｌｉｍｉｎａｒｓｔｕｄｙｐｙＡＴｈｅｓｉｓＳｕｂｍｉｔｅｄ化ＳｏｕｔｈｅａｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＦｏｒｔｈｅＡｃａｄｅｍｉｃＤｅｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｏｆＭｅｄｉｃａｌｇＳｃｉｅｎｃｅＢＹＬＩＨｕｉｕａｎｊＳｕｐｅｒｖｉｓｅｄｂｙＰｒｏｆ．ＪＩＡＮＧＬｉＭｅｄｉｃｉｎｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＳｏｕｔｈｅａｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭａｙ２０１５ 东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究王作及取得的研巧成果。尽我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研巧成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研巧所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研巧生签名；ＡＰｉ日：＞〇ｉｒ．＊．！）Ｊ期＿东南大学学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档１。，可＾＾采用影印、缩印或其他复制手段保存论文本人一电子文档的内容和纸质论文的内容相致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查闷和借阅，可公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。论文的公布（包括刊登）授权东南大学研巧生院办理。＇＾則．Ｉ研巧牛答名＾导１币签名；日期： 中文摘要中文摘要、＊长链非编码ＲＮＡ－ｒｔ／ｃｗ在化胎也脏发育中作用的初步研究硕±研究生李慧娟导师蒋舉教授东南大学医学院儿科学系目的－；探索Ｐｂｘｉ／ｒｔ／ｃｗ在脏胎必脏发育中的作用。方法，在室间隅缺损人工流产；前期应用长链非编码ＲＮＡ微阵列芯片筛查发现Ｕ－的胚胎也脏组织中，超保守片段Ｃ．４０异常高表达。采用链特异性逆转录实时定量聚合酶链反应确认ＵＣ－－－．４０的转录本任ａｎｓｃｒｉｂｅｄＵＣ．４０ｒＵＣＷ。应用生物信息（）一－－及Ｐｂｘｌ的基本信息学方法分析ＵＣ．４０，７７７ＣＷ。进步应用逆转录实时定量聚ｘ－合酶链反应，分析Ｐｂｌ／７１／Ｃ仙在小鼠胚胎发育过程中的表达谱９；在Ｐ１细胞水Ｕ－Ｃ，通平，采用质粒过表达．４０过检测也肌细胞标志物来判断过表达对分化的影响，应用流式细胞法（细胞周期）Ｗ及ＣＣＫ８法检测细胞増殖，应用流式细胞法－（细胞调亡）！＾＾及ｃａｓｐａｓｅ３法检测细胞调亡，应用实时定量聚合酶链反应检测Ｐｂｘｌ在细胞诱导过程中的变化趋势。ＵＣ－结果．４０：我们应用键特异性逆转录实时定量聚合靡链反应确认了的转录本—ＣＷ－－７Ｉ／。生物信息学分析显示ｒｔ／ＣＷ为反义长链非编码ＲＮＡ，其正义基因Ｐｂｘｌ己被证实在室间隔胚胎发育中发挥重要作用。在小鼠胚胎发育过程中，－Ｐｂｘｉ／ｒｔ／ｃｗ的表达具有时空将异性，在胚胎也脏发育中，它们的表达有反向趋势ＵＣ－９。在细胞模型中，．４０的过表达导致Ｐ１细胞分化障碍，阻碍Ｐ１９细胞的増殖．使其易于发生调亡，且导致Ｐｂｘｌ在诱导分化中丧失了上升趋势。一－－结论：ＵＣ．４０的过表达可能是导致化胎也脏发育崎形的原因之。ＵＣ．４０是否通过Ｐｂｘ一ｌ发挥作用及其深入的致病机制有待进步探讨。－－关键词，Ｕ．，ＣＷ，Ｘ，：长链非编码ＲＮＡＣ４０ＴＴ／胚胎也化扣ＩＰ１９Ｉ？本课题受国家自然科学基金资助编号：８１４７０３７６ 东南大学硕±学位论文英文摘要ｎｏ－Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｌｏｎｇｉ＞ｃｏｄｉｎＲＮＡ７Ｔ／Ｃ４０ｉｎｅｍｂｒｏｎｉｃｈｅａｒｔｇｙ＊ｄｅｖｅｌｏ－ｒｅｌｐｍｅｎｔａｉｍｉｎａｒｓｔｕｄｙｐｙＳｔｕｄｅｎｔＬＩＨｕｉｊｕａｎｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒＪＩＡＮＧＬｉＰｅｄｉａｔｒｉｃＤｅｐａｒｔｍｅｎｔＭｅｄｉｃｉｎｅＳｃｈｏｏｌｏｆＳｏｕｔｈｅａｔＵｉｖｅｒｓｉｔ，ｓｎｙ＇Ｏｂｔｉｌｒｅｔｈｅｔｔ－ｎｊｅｃｖｅ：Ｔｏｅｘｐｏｏｅｎｉａｌｒｏｌｅｏｆ？ｈｘ＼ＩＴＵＣ４０ｉｅｍｂｒｏｎｉｃｈｅａｒｔｐｙｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｉｎｐｒｅｖｉｏｕｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅａｂｅｒｒａｎｔｌｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｕｌｔｒａｃｏｎｓｅｒｖｅｄｅｌｅｍｅｎｔ－－－ＵＣ．４０ｉｎＶＳＤａｆｆｅｃｔｅｄｅｍｂｒｙｏｎｉｃｈｅａｒｔｗａｓｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｕｓｉｎｇｌｏｎｎｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡｇｇｍ４０－－ｉｃｒｏａｒｒａ．Ｉｎｔｈｅｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｔｈｅｔｒｒｉｔｕｃ．ｎａｍｅｌＴＵＣ４０ｉｉｄｔｉｆｉｙ，ａｎｓｃｏｆ，，ｓｅｎｅｄｐｙｐｙ－－ｂｙｓｔｒａｎｄｓｅｃｉｆｉｃＲＴＰＣ民ａｐｑ？Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｄａｔａｂ化ｅｓａｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ化ｃｏＵｅｃｔｂｓｉｃ－－ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｕｃ０ｅｓｅｎｓｅｒｍｒｅ．４０ＴＵＣ４ａｎｄｔｈａｒｔｎｅｒＰｂｘＬＦｕｒｔｈｅｏｔｈｅ，ｐ，ｅｘｒｅｓｓ－ｐｉｏ打ｒｏｆｉｌｅｏｆＰｂｘｌ／ｒＣ／Ｃ４０ｄｕｒｉｎｍｏｕｓｅｅｍｂｒｏｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｉｓｉｎｖｅｓｔｉａｔｅｄｐｇｇｙｐ－ｕｓｎｓｎｄ－ＦＣ民虹ｖｉｔ－ｉｔｒａｓｅｃｉｆｉｃＲＴ．ｒｏＵＣ．４Ｑ〇乂６巧义巧巧ｉｏｎｉｓａｃｈｉｅｖｅｄｕｓｉｎｇｐｑ，口ｇｌａｓｍｉｄｉｎ．ｆｄｉｆｉｉｄｂｂｉｒｋｅｒｓｐＰＩ９ｃｅｌｌｓＩｔｓｅｅｃｔｏｎ（ｅｒｅｎｔａｔｉｏｎｓｂｓｔｙｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｏｍａ．Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ｃｅｌｌｃｙｃｌｅ）ａｎｄＣＣＫ８ａｒｅａｄｏｐｔｅｄ化ｃｏｍｐａｒｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｆｌｏｗ－ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）ａｎｄｃａｓｐａｓｅ３ａｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｔｏｃｏｍｐａｒｅａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄＰｂｘｌｅｘｒｅｓｓｕ打ｓ－ｐｉｏｎｄｒｉｎｇｉｎｄｕｃｔｉｏｉｃｏｎｆｉｒｍｅ过ｂＲＴＰＣ民．ｙｑ－－ｕｔｓｆｕｃ－ｉｉｄｉｆｉｉｓｒａｎｄｉＲｅｓｌ：Ｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｔｏ．４０ＴＵＣ４０ｓｅｎｔｅｄｕｓｎｇｔｓｅｃｆｉｃｐ，，ｐ－／ｎｅ过ｎｃＲＴＰＣＲ－？虹ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｓｉｓ７ＴＣＶ０ｉｓｄｅｔｅｒｍｉａｎａｎｔｉｓｅｎｓｅＩＲＮＡｑｙ，ａｓ，ａｎｄｉｔｓｓｅｎｓｅａｒｔｎｅｒＰｂｘｌｈａｓｂｅｅ打ｃｏｎｆｉｒｍｅｄｖａｌｕａｂｌｅｉｎｎｏｒｍａｌｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｓｅｔｕｍｐｐ＇ｆｏｒｍａｉｏｎｎｘｉｌ－ａｒｅｓｍｏｒａｔ．Ｉｔｈｅｅｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｅ，？ｈｙｉ＼ＩＴＵＣ４０ｐａｔｉａｌｌｙａｎｄｔｅｐｌｌｙｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐＫＳｓｅｄａｎｄｔｈｅａｒｔｎｅｒｓｈｏｗｎｅｇａｔｉｖｅｔｒｅｎｄｄｕｒｉｎｈｅａｒｔｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．ｐｇｕｃ－Ｉｎｃｅｌｌｍｏｄｅｌ．４０ｏｖｒｅｓｓｉｌｓｄｔｈｉｔｅｔｔｉ，ｅｒｅｘｏｎｓｏｗｏｗｎｅｃａｒｄｏｍｏｃｍａｕｒａｏｎｐｙｙ，ｒｅｔａｒｄｓｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｓｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｔｏａｄｖｅｒｓｅｆａｃｔｏｒｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅｔｈｐｙ，ｅｏｖｅｒｅｘｒｅｓｓ－－ｉｏｎｏｆｕｃｌｈｌｌｉｎｈｉｎｄｅｒｓｅｐ．４０ｎａｍｅｔｅａｂｎｏｒｍａｃｒｅａｓｅｄＴＵＣ４０ｔｈ，ｙｙ，ｒｉｓｉｎｇｔｒｅｎｄｏｆＰｂｘｌｉｎｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ．Ｃｖｅｒｅｓｓ－ｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｔｈｏｓｅｒｅｓｕｌｔｓｒｅａｌｔｈａｔｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｉｏｎｏｆｕｃ．４０ｍｉｇｈｔｂｅ化－ｘｌｉｌｈａｎｉｉｒｅｓｐｏｎｓｅｆｏｒａｒｔｏｆｔｈｅｅｔｏｏｏｆＶＳＤ．Ｔｈｅｍｅｃｓｍｓｏｆｈｏｗｕｃ．４０ｅｅｒｔｓｐｇｙｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｎＰｂｘｌａｎｄｈｏｗｔｈｅｃａｕｓｅＶＳＤａｗａｉｔｆｕｒｔｈｅｒｉｎｖｅｓｔｉａｔｉｏｎ．ｙｇ－－ｎｏｎ－ｕＴＵＣ４０Ｋｅｙｏｒｄｓ：ｌｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡ，ｃ．４０，，ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｈｅａｒｔ，Ｐｂｘｌ，ＰＩ９ｗｇｇＩＩ＊ＴｈｅｔｈｅｓｉｓｉｏｎｒｂａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎＥＧｒａｎｔＮｏ．８１４７０３７６ｓｓｏｅｄＮｊ巧ｙ 目录目录中文摘要１英Ｓ摘要ＩＩｉＩＩＩ录缩略ｉｆＶＩｔＴｓ１第一章综巧２第二章材輯与方法８１研究对象８２主要工具８、试剂与耗材２．１生物信息学相关网站及软件：８２．２细胞培养相关试剂与耗材８２．３细胞实验相关试剂与耗材９２．４ＲＮＡ实验相关试剂与耗材９２．５Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ相关试剂与耗材１０３主要仪器设备１０４常用试剂配制１１４１．细胞实验相关试剂１１４．２ＲＮＡ实验相关试剂１１４．３蛋白实验相关试剂１１５实验方法１２．５１生物信息学分析１２．５２表达谱构建１３５３４．细胞水平实验１５．４分子生物学实骑１６２第Ｈ章实验结果１生物信息学一ＵＣ－１．４０在不同水平的保守性分析２１１．１核巧酸序列水平２１１．２基因沮位置水平２２．１３转录因子结合位点及巧关转录因子的功能水平２３—２动物实验表达谱：２３、－２１口２３．７Ｃ４０存在于胚胎屯脏中２－．２ＵｃＰｂｘｌ２４．４０的表达量总体上低于ＩＩＩ 东南大学硕±学位论文－－、２．３化．４０的表达量具有时空特异化Ｐｂｘ／ｌｒＣ／ＣＷ在屯脏胚胎发育过程中呈现负相关２４３细胞实验２６３．１过表达验证２６３－．２Ｕｃ．４０过表达导致Ｐｂｘｌ表达量减低２７－、３．３Ｕｃ．４０过表达阻碍了Ｐ１９细跑向屯肌样细胞分化２７３．４过表达使Ｐ１９细跑发生细胞周期阻滞，进而阻碍了细胞増殖２８３．５过表达使Ｐ１９细胞易于发生细胞调ｔ巧第四章讨论３１－１ｒｔ／Ｃ４０存在，且不具有翻译成蛋白质的能力３１２－Ｕｃ．４０在物种之间有突出的保守性，提示功能的保守性３１３－Ｕｃ４０３２．的表法具有时空特异性４在证胎也脏发育过程中Ｐｂｘ呈现上升趋势ＵＣ－ｌ，．４０的表达量与其呈负相关３２５－Ｕｃ．４０在Ｐ１９细胞中过表达导致Ｐｂｘｌ失去上升趋势３３－６ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＩｎｃＲＮＡ的作用方式及ＰｂｘｌＡＴｆ／ＣＷ相互作用方式的猜测３３７过表达导致屯肌细胞分化能力减弱３４８过表达导致细胞周期阻滞３５，阻碍细胞増殖９过表达导致细胞易于发生饥饿诱导的调亡３５第五章结论３６第六章问题与展望３７参考文献３８賴４８作者简介４９ＩＶ 前言缩略词缩略词英文全称中文全称ＲＮＡ－ＩｎｃｌｏｎｎｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡ长链非编码ＲＮＡｇｇＶＳＤｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｓｅｐｔａｌｄｅｆｅｃｔ室间隔缺损－－ｑＲＴＰＣＲｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅ逆转录实时定呈聚合酶链ｐｏｌｙｍ灯ａｓｅｃｈａｉｎ化ａｃｔｉｏ打ＵＣＧｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｃａｒｄｉｏｒａｍ超声也动图ｇＵＣＥｓｕｌｔｒａｃｏｎｓｅｒｖｅｄｅｌｅｍｅｎｔｓ超保守元件－ｒａＴＵＣＲｓｔｎｓｃｒｉｂｅｄｕｌｔｒａｃｏｎｓｅｒｖｅｄ转录的超保守区域ｒｅｇｉｏｎｓＣＨＤｃｏｎｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔ先天性也脏病ｇｄｋｅａｓｅ／ｄｅｆｅｃｔＲＮＡｌｌＡＰｏｙＩＩＲＮＡｐｏｙｍｅｒａｓｅＩＩＲＮ聚合酶ＩＩＰＲＣ２ｐｏｌｙｃｏｍｅｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ多梳抑制复合物２ｃｏｍｐｌｅｘ２ｍｉＲＮＡｍｉｃｒｏＲＮＡ微小ＲＮＡＶ 前言、、／１．削胃、本课题组前期利用妊娠１７周胎儿屯脏超声（ｕ，ｌｔｒａｓｏｎｉｃｃａｒｄｉｏｒａｍＵＣＧ）ｇ发现的室间隔缺损（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｓｅｔａｌｄｅｆｅｃｔ，ＶＳＤ）人工流产标本，与同期人工ｐ－流产的正常标本，进行胚胎也脏差异表达长链非编码ＲＮＡ（ｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇ一ＲＮＡｓ：，ｃｏｎｖｅｄ，ＩｎｃＲＮＡ）的芯片研巧批超保守片段（山ｔｒａｓｅｒ。在芯片结果中ｎＮＡｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＵＣＥｓ）转录产生的ＩｃＲ转录的超保守区域（ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｕｌｔｄｉ－ｒａｃｏｎｓｅｒｖｅｒｅｇｏｎｓ，ＴＵＣＲｓ）引起了本课题姐的关注。其中ｌｎｃＲＮＡ７Ｉ／ＣＶ０在异常标本中过表达倍数最髙；其与必脏胚胎发育相关的基因Ｐｂｘｌ互为反义；Ｃ－再加上Ｕ．４０本身的髙保守性，因此本课题选择它作为研究对象。我们利用Ｐ１９－细胞这个模型，Ｕ，，在其诱导分化为必肌细胞的起始阶段将Ｃ．４０过表达观察其分化，；，、増殖及调亡的变化来判断打疋对也肌细胞的影响除此之外我们－还应用生物信息学对该，建立了２Ｔ／ＣＷＩｎｃＲＮＡ进行分析；并在动物水平及其ｂｘ。可能的範基因Ｐｌ在小鼠胚胎发育过程中的表达谱一ＲＮＡ－、７Ｉ／ＣＷ肌细胞的作为个探索性研巧，我们在细胞水平探巧了Ｉｎｃ与屯，推断了其在小鼠，关系，并结合生物信息学分析及表达谱内容乃至人的必脏化胎发育过程中发挥的作用，推测其可能在先天性也脏病（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔ出ｓｅａｓｅ，ＣＨＤ）的发病中扮演了角色，为该疾病未来的生物标志物和治疗粗点确定提供了初步的理论依据。１ 东南大学硕±学位论文第一章综述屯、血管系统发育与疾病相关的长链非编码ＲＮＡ的研巧一长链非编码ＲＮＡｎ－（ｌｏｇｎｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡ，ＩｎｃＲＮＡ）最初的定义是类长度ｇ２００ｎｕ一大于核巧酸（ｃｌｅｏｔｉｄｅ，ｎｔ），不编码蛋白质的ＲＮＡ。但是这定义己经受一一到挑战。例如最近刊登在ｃｅ／／上的篇文章，讲述了条ＩｎｃＲＮＡ编码的微化：ｍｙｏｒｅｇｕｌｉｎ（ＭｉＡＯ。是骨骼肌特异性表达的穿膜ａ螺旋体，它通过抑制２＋２＋ＳＥＲＣＡ（内质网上允许Ｃａ摄入而放松肌肉的膜泉）而调控Ｃａ的流动，ＭｉＪＶＷ敲除的小鼠表现出更好的肌肉耐力。＾兰上这个例子是众多解说ＩｎｃＲＮＡ能够翻一ＮＡ一译的实例之。因此ＩｎｃＲ是类大多数情况下不编码蛋白质的非编码ＲＮＡ一（ｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡ，ｎｃＲＮＡ）其编码能力是不能，ｎｃＲＮＡ，概而论的并且Ｉ编码一一的微肤作为种新生事物，是未来ｎｃ。ＩＲＮＡ研巧领域个重要立题分类有助于我们了解ＩｎｃＲＮＡ的功能，目前权威的根据基因姐位置的分类如－－）（）下：ａｎｄａｌｏｎｅ），増强子相关ｅｎｈａｎｃｅｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ａｎｔｉｓｅｎｓｅ，独立的（ｓｔ（反义ｍａ－－包含小ＲＮＡ的（ｓｌｌＲＮＡｃｏｎｔａｉｎｉｎ），启动子相关的（ｐｒｏｍｏｔｅｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ｇ及假基因的（ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｉｃ）。下面将对几个研究较多的类别逐个阐述。１ＩｎｃＲＮＡ的分类（图１）．＞ＭＭ？ｎｈＭＫｃｒ＞ｃｉ？ｉｅ４ＭｉｍＭｉｋｐｅ＊ｉｄｅ＜ｅｆｌｔ．—１？．＇．．＿１Ｗ■圓—户担苗巧—：ｔｔｔｔ￣ｒｔ￣ｌｄｎｅｓｅｄＭｌＭｎＭｅｒｍｉｎａｌ＊ａｎｄ＊ｋｍｔｐｏｍ〇？？＊ｕｏｃｉｉ＊Ｗ图１：基于基因姐位置的ＩｎｃＲＮＡ分类１－．１独立山ｃＲＮＡ（ｓｔａｎｄａｌｏｎｅＩｎｃＲＮＡ）这类ＩｎｃＲＮＡ的编码片段不与已知的基因重合，其中的绝大部分是ａｒｇｅＪ口１－ｉ（ｌｉｎｃＲ）。ｉｎｔｅｒｅｎｉｃ／ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇｎｏｎｃｏｄｎＲＮＡｓＮＡ它们是通过组蛋白标记被ｇｇ发现的：启动子区域有Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（组蛋白３赖氨酸４的Ｈ甲基化），转录区域有，，通常由ＲＮＡ聚合酶ＩＨ３Ｋ３６ｍｅ３。这类ＩｎｃＲＮＡ通常较长达ｌＯＯＯｎｔ左右Ｉ（ＲＮＡＰｏｌＩＩ）转录生成，有多聚腺巧尾（ｏｌＡ尾），通常发生差异剪切。其中研巧较ｐｙ口１多的有义別，饼９，侃化！＞，Ｍａｔｏ／等。１．２天然反义转录物（ｎａ化ｒａｌａｎ化ｅｎｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｔｓ，ＮＡＴｓ）ｐ，基因组中大约７０％的转录本都有其反义转录物大数据分析证实，通常聚集’，４【］或－在ｓｅｎ巧ｔｒａｎｓｃｒｉｒｔ的５３端。Ｓｅｎｓｅａｎｔｉｓｅｎ化ａｉｒｓ（ＳＡＳａｉｒｓ）有很多组成ｊｐｐ’方式，包括ｍＲＮＡ／ｍＲＮＡ，ＩｎｃＲＮＡ／ｌｎｃＲＮＡ（如义別／妨乂），｜＾＞１及最常提及的ｍＲＮＡ／ｌｎｃＲＮＡ。与ｌｉｎｃＲＮＡ不同的是，大多数ＮＡＴｓ没有差异性剪切发生，也Ａ尾Ｗ一较少含有ｏｌｙ。ＳＡＳａｉｒｓ的表达量，也如它们的位置关系样，常常具有ｐｐＷ相关性。１．３假基因ＩｎｃＲＮＡ（ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅｓｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄＩｎｃＲＮＡ）这坠ＩｎｃＲＮＡ来源于基因编码框移位等变异后产生的假基因的编码产物。假２ 综述基因ＩｎｃＲＮＡ通常被置于基因进化的进程内描述：有研巧证明，假基因ＩｎｃＲＮＡ正处在原本的蛋白编码基因废除的过程中，也有可能现在的假基因因为变异或进Ｐ１化又获得了编码蛋白质的功能。如著名的瓜沁就被认为来源于蛋白编码基因ＷＬｎｘ３的假基因化过程中，并与许多转座子来源的重复原件进行了整合。１．４内含子ＩｎｃＲＮＡ（ｉｎｔｒｏｎｉｃｌｎｃＲＮＡ）在ｎｃＲＮＡ领报许多ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ（微小ＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）是由内含子转录得来的，许多ＩｎｃＲＮＡ也是内含子来源的，目前对ｉｎｔｒｏｎｉｃＩｎｃＲＮＡ的研究较少，一个关于拟南芥春化阶段启动的ｉｎｔｒｏｎｉｃＩｎｃＲＮＡＣｏ／成的研巧中提到，ＣｏＷａ皆指引ＰＲＣ２（ｐｏｌｙｃｏｍｂｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅｃｏｍｐｌｅｘ２）到化Ｃ（抑制春化的基因），ＰＲＣ２催化ＦＬＣ的抑制子发生Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３的姐蛋白修饰变化，进而沉默ＦＬＣ的表达，＂＂Ｗ从而开启拟南芥的春天之旅。ＰＲＣ２是进化保守的组蛋白修饰复合物，这－ＰＲＣ２的相互作用在很多种ｌｎｃＲＮＡＩｎｃＲＮＡ的例证中都有报道。１－．５增强子相关的ＩｎｃＲＮＡ（ｅｎｈａｎｃｅｒｌｎｃＲＮＡｌ），ｅｎｃＲＮＡ増强子区域能够转录产生ＩｎｃＲＮＡ，这些ＩｎｃＲＮＡ的敲除导致增强子调控基因的表达减少Ｑｕｎｚａｉｎ等在也脏胚胎发育及也肌重塑领域发现了许多必脏特异的ｅｌｎｃＲＮＡ，这些ＩｎｃＲＮＡ对转录来源的増强子发挥作用，从而调控也脏胚胎Ｗ发育及重塑。＞上介绍ｎＩｎ通过１＾１，我们大致了解了不同ＩｃＲＮＡ的基本特点，下面蒋对ｃＲＮＡ的作用方式做出简单叙述，便于后续内容的理解。２．ＬｎｃＲＮＡ在表观遗传水平（染色质水平）的作用ＬｎｃＲＮＡ在ＤＮＡ水平发挥功能的主要方式是招募表观遗传相关的蛋白复合物，主要包括组蛋白修饰复合物及甲基化调节蛋白。研究这类作用方式的主要方－ｒｏｎ—法有解析ＲＮＡｐｔｅｉ相互作用的技术ＲＮＡ免疫共沉淀（ＲＮＡ＂ｍｍｕｎｏｒｅｃ，ＲＩＰ。ｉｐｉｐｉｔａｔｉｏｎ）及后续的蛋白质质谱分析目前研巧最多的是多梳＂家族蛋白（ｐｏｌｙｃｏｍｂｒｏｔｅｉｎｓ），如ＰＲＣ２。ＰＲＣ２包含了Ｅ，Ｓｕ（ｚｌ２，Ｅｓｃｐ材）Ｗ５５，。及Ｎｕｒｆ四个亚基，各个亚基各司其职共同发挥甲基化组蛋白的功能除＂＂多梳家族蛋白，９，了，还有许多其他蛋白复合物如Ｇ９ａ是Ｈ３Ｋ的甲基转移酶ＷＬＳＤｌ／ＣｏＲＥＳＴ／ＲＥＳＴ是拟Ｋ４的去甲基酶，ＭＬＬ是Ｈ３Ｋ４的吉甲基化酶等等。除外组蛋白调节复合物，ＩｎｃＲＮＡ还能与甲基化修饰蛋白相互作用。如从头Ｐｌ甲基转移酶Ｄｎｍｔ３ａ和Ｄｍｎｔ３ｂ，Ｗ及维持甲基化的Ｄｎｍｔｌ。２．１ＬｎｃＲＮＡ在转录过程中发挥作用ＬｎｃＲＮＡ能与转录因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ，ＴＦｓ）相互作用，有些ｎｃＲＮＡＩ＂＂ＴＦｓ，阻碍ＴＦｓ与结合区域（ＴＦｂｉｎｄｉｎｓｉｔｅ，ＴＦＢＳ）接触可Ｗ诱惑ｇ；有些可Ｗ通过竞争机制结合到ＴＦＢＳ，阻碍ＴＦｓ发挥作用；有些还可Ｗ改变ＴＦｓ的亚Ｐｏ，（细胞定位，还包ｌＩＩｃｏｍａｒｔｍｅｎｔ）。除此之外括与相互作用与细胞内微小区域ｐＷ的相互作用等等。ｍＲＮＡ２．２ＬｎｃＲＮＡ的转录后作用＾相互作用ＮＡＴＳ可Ｗ与ｓｅｎｓｅ基因的ｍＲＮＡ互补序列结合，覆盖差异剪切区域，影响ｍＲＮＡ的差异剪切；或者増加／降低相应ｍＲＮＡ的稳定性，来改变蛋白质的产出。，通过Ｗ上回顾，我们对ＩｎｃＲＮＡ的分类及作用机制有了大体的了解下面将、ｎ举例介绍与屯血管系统发育及疾病相关的ＩｃＲＮＡ。３．ＥｌｎｃＲＮＡ在也血管系统３ 东南大学梗±学位论文Ｅ一ｎｃＲＮＡｌｎｃＲＮＡ是类转录自增强子区域的Ｉ，这些转录区域的特点是高ＵＷ组里出Ｋ４ｎｉｅｌ或拟Ｋ２７ＡＣ（组蛋白３赖氨酸２７己酌化），这些白标记标志着増强子具有转录活性。－３．１Ｓｍａｄ７ｌｎｃＲＮＡ是利用ＲＮＡ－ｓｅｑ技术发现的ｓｍａｄ７增强子序列转录产生的ｅｌｎｃＲＮＡ。Ｓｍａｄ７在小鼠和人胚胎也脏发育中发挥的作用已被认同；ｓｍａｄ７（ＭＨ２ｖ、ｄｏｍａｉｎ）敲除的小鼠出现了室间隔缺损表型（ｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｓｅｐｔａｌｄｅｆｅｃｔ，ＶＳＤ），也ｔｉｌｌ经脊细胞室流出道发育睹碍，必功能不全，严重的也率失常等等；神ｓｍａｄ７ｔｎｉ过表达的小鼠出现了ＶＳＤ等异常也血管表型；在人类，ｓｍａｄ７的基因突变在流行病学水平被证明与先天性也脏病（ｃｏｎｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅ，ＣＨＤ）发生高风ｇｔＷ一险有关，化心。在项新生小鼠也脏成纤维细胞的实验中的敲除导致了ｓｍａｄ７表达量的忌著下降，结合上述基因水平的探讨，作者推测Ｗｓｗａｃ护／ｎｃ化似（通过影响ｓｍａｄ７的转录而对也脏胚胎发育发挥负性作用。３－．２Ｍｍ８５ｔｅｍｐｌａｔｅｄＩｎｃＲＮＡ一－ｎｃＲＮＡｓｗ心７ｍｍ８５ｅ，与／？ｃ化似类似的还有増强子转录产生的条ｌ暂时义Ｍ４。Ｍｍｉ、命名为如化ｄｎｃ８５ｏｃａｒｄｎ，ｍｙｏｃａｒｄｉｎ与屯／的範基因是ｍｙ＂＂ｔＷ脏发育的重要转录因子ＳＲＦ姐成了细胞骨架调节环路，ＳＲＦ与Ｎｋｘ２．５的一一相互作用激活了部分也脏特异性的基因表达，是必脏化胎发育的始动因素之＂１１ｒ，。因此化ｄ／ｎｃ瓜Ｖ／４通过ｍｙｏｃａｄｉｎ与ＳＲＦ摸系起来间接在也脏ｍ胚胎发育等生命进程中发挥作用。Ｂｒａｖｅｈｅａｒｔ（Ｂｖｈｔ）除外上述两个研巧较为浅显的ｅｌｎｃＲＮＡ，执献也是转录自也脏特异性碱■ｅｎｈａｎｃｅｒ的ｅｌｎｃＲＮＡ。敲除实验证实化在胚胎干细胞向也脏细胞分化的过程、ｅｓＰ，中是必不可少的的；它能激活屯血管分化基因网络的核也因子ＭｌＭｅｓＰｌ，执加能与Ｓｕｚｌ２，调是。血管多能始祖干细胞的标志性基因；相互作用节组蛋（）、肌细胞的分化，执、成熟。白的甲基化；在细胞模型中伽敲除阻碍了新生忙４Ｎａ化ｒａｌａｎｔｉｓｅｎｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ（ＮＡＴｓ）在也血管系统４．１ＭａｌａｔｌＭａｓｓｏｃｎａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｔｒａｎｓｃｒｉｒｔｌ）ｌ／如／（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉａｔｅｄｌｕｇ最早被发现在ｉ非小细胞肺癌病人中，，因此。高表达的肺腺癌病人更早发生肿瘤转移ｎｎｎｔＷ这条ａｔｉｓｅｓｅＩｃＲＮＡ有了这个名字。随着研巧的深入，还发现Ｍｉ／ＷＪ与差１７１’８［］［］异性剪切化及甲基化等细胞活动有关，并且与许多恶性疾病的预后呈正相一ｊ／ａ，关，在缺氧诱ｄ表达増多导致血。近期的篇报道发现导的内皮细胞中Ｍ管内皮细胞表型改变，ｉ沉默导致内皮细胞细胞出芽及迁移増多然而増殖减少！当用ＶＥＧＦ刺激血管生长时，Ｍａ／ＷＪ沉默导致缺陷的血管生成；在体实验证明Ｍｚ／ａ＂沉默抑制了内皮细胞增殖，减少新生的视网膜血管生成；药物抑制会导致血流减少，毛细血管密度降低。Ｗ上研究结果均证实，ｔＷ，与血管发生和应激改变等都有关系。那么我们有理由猜测非小细胞肺癌等肿瘤细胞的迁移，可能也与Ｍｌ／化？的上述性质有关．这些猜想还需要放大研巧一范围来进步证实。这项研巧也将会为监控肿瘤转移做出贡献。４．２ＰＵＮＩＳＨＥＲ－‘ＲＮＡ在最近发现的与脊椎动物。血管发育相关的研巧中，研巧者利用ｓ巧技术筛查出人多能干细胞分化过程中，关键时间点差异表达的ＩｎｃＲＮＡ，再利用４ 综述，选择了在物种之间高保守生物信息学技术，并且与也血管系统发育基因密切相关的Ｈ个！ｎｃＲＮＡ，其中分类为ａｎｔｉｓｅｎｓｅＩｎｃＲＮＡ的是ＰｔＷ您地：及。对它的相关口基因预测发现，？｛／＾？／／扮？与血管发育相关的基因呈表达正相关。則及蛋白质谱分析发现肥ＨＥ皮与内皮细胞发育的ＴＦｓＴＡＬＩ和Ｆ０ＸＣ１等相关。在功能学实验中，Ｍ０（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）敲除的＾前月￡及的斑马鱼出现了也血管的严重崎一形，包括血管分支障碍，、也脏胚胎发育及功能障碍等表型而挺救实验在定程度上改善了Ｗ上表型：在人和小鼠的细施水平，ＰＭＶＫ好巧？的敲除引起了广泛的一－，ＬＤＬ摄取基因异常表达，其中些与内皮细胞功能相关的Ｈ３磯酸化乙酪化■等发生了改变。＆上实验在生物信息学和功能学水平均证实了戶Ｃ／Ｍ况ｆｉｉ？与也血管系统发育的相关性一Ａ，是个新兴的私血管系统ＩｎｃＲＮ，更多的在体实验还Ｐ０ＬＰ１１有待完善。４－．３ＴｉｅＩＡＳ－ｕｅｎｃｅ７１ｅＬ４Ｓ是通过在血管特算性表达的ＥＳＴｓ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｔａｇｓ）拼接找到的，进而发现它和既往已经被证明与血管异常有关的基因ｔｅｌ呈，ｉ反义关系ＰＡＰＳｌ－－ｔ－ｉｅ１、ｔｉｅ２与ＶＥＧＦ形成的环路在血管形成中发挥调控作用。巧ＣＬ４Ｓ发挥－ｍＳｅ－作用的方式是与ｔｉｅ１ＲＮＡ通过碱基互补配对形成ＳＡ复合物，导致ｔｉＩ降解，发挥负性作用，进而导致血管内皮细胞生成障碍，并且在血管瘤等血管晴形－－上研究结果说明的标本中，７ＴｅＬ４Ｓ的表达量较正常组织髙出５１０倍。＾＾，－－ｎｓｅ－，进而影响下游ｔ、ｉ２、Ｖ通过影响它的ｓｅ基因ｔｉｅ１的转录后水平ｉｅ１ｔｅＥＧＦ环路的稳定性，从而导致血管疾病。４ＡＡＨＩＦ－－（ｈｘ－ａ是ＨＩＦ１ｙｐｏｉａｉｎｄｕｒｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１）的亚基ＨＩＦ１的ＮＡＴ。首先被证明在非乳头状透明细胞肾癌中出现髙表达此后又陆续被证明与乳腺一癌的不良预后，、低氧诱导的肺上皮细胞变化如衰及嗜络细胞瘤的类严重表型ＳＰＨＷ－等疾病有关。Ｗ上疾病中的机制都与ａ／／／Ｆ与ＨＩＦ１的反向表达关系有关，＇－－两者形成的复合物使得ＨＩＦ１ｍＲＮＡ容易发生降解，因此ａＷ化对ＨＩＦ１引发的，在Ｐｈｌｉｎ，ａｆｌＦ下游通路发挥了反向调节作用。此后ｉｌｉｐｐｓ虹ｏｂ等的研巧中将一一ＰＷ作为也血管的标志ＩｎｃＲＮＡ之。在篇验证急性也梗生物标志物（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）妊巧＇的病例对照研巧中，ａ在也梗病人中高表达．且在胸痛发生巧早的病人中，ｔＷ－，表达量更高。Ｗ上研巧说明ａＫ／Ｆ作为ＨＩＦ１的反向调控因子，在缺氧等进程的稳态中发挥了重要的作用，ａ月Ｗ具有潜在的。根据上述也梗的病例研究一ｂｉｏｍａｒｋｅｒ潜质，这也是我们研巧ＩｎｃＲＮＡ的目标之。５．ＬｉｎｃＲＮＡ在也血管系统５，１ＭＩＡＴ（ｎｔｙｏｃａｒ化ａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎａｓ…ｄａｔｅｄ化ｍｓ灯ｉｐｔ）一在上文提到的关于急性也、梗的临床病例对照研究中，还提到了条—如公了，ＩｎｃＲＮＡ。这条ＩｎｃＲＮＡ的位置分类是ｌｉｎｃＲＮＡ功能上，已经被证明是内源竞争性ＲＮＡ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＲＮＡ，ｃｅＲＮＡ）。上化也梗的研究证实，ＭＷｒ的升高，对于四个月后急性瓜梗病人随访左也功能的指标有明显的预一ＰＷ测作用，是个敏感性高的预后ｂｉｏｍａｒｋｅｒ。远条ｌｉｎｃＲＮＡ有另外两个名字化ＶＣ及２和Ｇｏｗｗ／ｋ。这条ｌｉｎｃＲＮＡ最早是在视网膜神经细胞中被发现的，ＰＵ、当时被命名为ｒｅｔｉｎａｌｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡ，即化ＶＣｉ？２。随后又陆续在神经元及也梗＾３２Ｕ３病人中被发现，分别被命名为Ｇｏｗａ典和ＭＬ４７＼在首次提到ＭＷｒ的研究ｓ，中，研巧者通过病例对照，发现５个与也肌梗死相关的ＳＮＰ并发现这些ＳＮＰｓ５ 东南大学硕±学位论文一一聚集在段基因片段上，在这个片段上，研巧者得到了个转录产物，即Ｍ＂ｒ。经过染色质标记等发现，这条转录产物的编码基因有五个外显子，并且ＳＮＰｓ导如＂＾３１厂致的表达改变可能与致病有关。除外在视网膜及神经元中的作用，最近ＭＬ４ｒ还被证实在高糖培养基培养的血管内皮细胞中高表达，敲低的诱导糖尿病模型鼠出现了视网膜微血管形成障碍，体外实验中，一敲低导致血管内皮细胞增殖，、迁移及小管形成减少进步深入的机制研＂＂ｍ化－－－究发现，厕７能作为ｓｐｏｎｇｅ，吸附１５０５Ｐ，而ｍｉＲ１５０５ｐ能降解祀基因ＶＥＧＦ的ｍＲＮＡ。因此，通过内源竞争机制，对ＶＥＧＦ发挥了正作用，从而对血管形成发挥正性作用，，。在这个例证中通过ｍｉＲＮＡ间接发挥对４Ｐ粗基因的调控作用，是ＩｎｃＲＮＡ与ｍｉＲＮＡ相互作用的典型例证Ｌ但是本研巧的不足之处在于没有进行过表达实验。在目前早产儿视网膜病（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙｏｆ一ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ，ＲＯＰ）的治疗中，项试行疗法就是给患儿应用ＶＥＧＦ抗体眼药水（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ），然而这个疗法的安全性受到了很大质疑，因为ＶＥＧＦ的局部作Ｐｙ用Ｗ及全身作用都是难抖把握的、不明确的，那么的过表达对ＶＥＧＦ的影响如何呢？是不是会导致异常增多的血管生成呢，微血管生成的稳态是怎样？保持的呢在也梗和糖尿病这两种疾病中，ＭＷｒ均发生了改变，送是不是与血管炎症有关？送些疑问还有待更多的研巧来解决。５ＦｒＦｌ－ｅｈａｎｏｎｃｏｄｎｅｎ．２ｅｎｄｒｅｔａｌｔｌｉｇｄｅｖｅｌｏｐｍｔａｌｒｅｕｌａｔｏｒＮＡ（ｇｙＲ）ｆｅｎｄ／ｒ是通过生物信息学找到的化胎发育期间中胚层特异性表达的基因。因＂后续实验发现其敲除小鼠胚胎期即出现死亡－因此被命名为胚胎发育关键＇＂一，ｅｎ曲ｒＩｎｃＲＮＡ。进步实验採索发现／局限性表达于新生的侧板中胚层！其敲除小鼠胚胎期出现也脏、体壁发育障碍继而死ｔ；仍ｍ／ｒｒ能影响侧板中胚层相关基因的甲基化修饰；在体内实验中与ＰＲＣ２和ＴｒｘＧ／ＭＬＬ这两种组蚕白修饰复合Ｐｑｉ。物结合；在体外实验中与侧板中胚层相关基因Ｆｏｘｆｌ和Ｐｔｘ２的启动子结合上述研巧从染色质水平（甲基化修饰）和转录水平（转录因子结合），阐述了Ｆｅｎ＆ｒ发挥作用的机制，是从发现到机制研巧的典范之作。ｎｃＲＮＡ６．其他分类的ＩＭｙｈｅａｒｔ（Ｍｈｒｔ）一Ａ些一除外上分类明确的ＩｎｃＲＮ，尚有ＩｎｃＲＮＡ不能被任何种分类涵盖。（ＭＭｗｆｌｌ例如也脏衰竭相关的ＩｎｃＲＮＡＭ抑ｅａＷｌ村），它有６个转录本，Ｗ４７为例。，它的片段就涵盖了基因间、外显子反义及内含子反义这三个来源的转录Ｍｊｒｆ的作用机制主要是与应激诱导表达的Ｂｒｇｌ存在竞争。各种应激在＆脏触发Ｂｒｇｌ生成，Ｂ巧１是染色质重构因子，能激发下游导致也肌疾病状态的基因表达。在其中发挥重要作用的是Ｂｒｇｌ的螺旋作用域，这个作用域既能结合相关基因的ｉｒ片段，也能与ＭｊＷ结合，这种竞争机制导致随着ＭＵ増多，Ｂｇｌ就难Ｗ发挥原有的作用，下游通路不能激活，进而减少了也衰等私肌疾病发生的机会这项研巧结果提示我们，外源性提升的水平，能够阻断应激诱导的也脏损害发生，这对也脏肥大等也肌疾病的治疗有提示作用。Ｗ上是对也血管系统相关的经典ＩｎｃＲＮＡ的分类阐述。可发现，除外ａｎｔｉｓ畑ｓｅＩｎｃＲＮＡ通过与其化ｎｓｅｍＲＮＡ结合，影响后者的稳定性这个作用方式，ＩｎｃＲＮＡ中并没有明显的特异性外其他的作用途径与机制在某个类别的。说明现有的按照基因組位置的ＩｎｃＲＮＡ分类对其功能的判断并没有明显的提示作用，一点正是ＮＡ的这ＩｎｃＲ复杂之处。６ 综述一ｎ许多ＩｎｃＲＮＡ研究的另外个局限性就是ＩｃＲＮＡ在种属间的保守性也是令人捉摸不透的。例如公ｖｈ在人中，尚没有发现与小鼠中同源的产物，也就是说，及ｖＡｆ对也脏胚胎发育发挥的作用可能在人当中并不存在。类似的例如Ｆｅｎ油Ｔ，已经被证明与小鼠胚胎必脏发育相关，虽然它在人的同源ＩｎｃＲＮＡ己经被确定，但是功能学验证还路漫漫，，因为在人的实验目前还只能通过胚胎干细胞去模拟或者通过流行病学的病例对照研究去预测它的功能，直接的证明还需要忖出很多努力，。这重重阻力给ＩｎｃＲＮＡ覆上了层层面纱有待科学家们去慢慢揭开。我们研究ＩｎｃＲＮＡ的意义，主要是疾病的早期诊断与及时治疗。在这个领域，我们课题组己经做出了努力：在先天性也脏病的胎儿孕母血中，我们筛査出了异一ｍＲＮＡ常表达的批ｉ，利用这些ｍｉＲＮＡ，我们找出了对胎儿先天性也脏病预测ｍ、敏感性和特异性均较髙的ｉＲＮＡ组合，为先天性屯脏病早期无创诊断提供了全新的理念。与么类似的是，血液、尿液、唾液等标本中的ＩｎｃＲＮＡ理论上也可，Ｗ对疾病的早期诊断与远期预后给出提示作用。但是与ｍｉＲＮＡ研究不同的是ｎ血清中的存在一：，ＩｃＲＮＡ在直受到质疑在Ｋｕｍａｒｓｗａｍｙ的研巧中利用＾ｌ－ＲＴＰＣＲ，在血清中找到了也衰病人左也室重构相关的线粒体。ｑＩｎｃＲＮＡ然而ＰＷ在Ｖａｕｓｏｒｔ等的研究中，他们认为全血是ＩｎｃＲＮＡ更可靠的来源。因此血清是ｎ一否是ＩｃＲＮＡ的可靠来源还有待进步证实，也可能因ＩｎｃＲＮＡ的种类不同而得出不同结论，毕竟ＩｎｃＲＮＡ的长度及大小Ｗ及表达的位置都是变化多端的，不可一ｎｃ，概而论。与胎儿疾病相关的，尤其是胚胎发育异常时出现的ＩＲＮＡ是否可一Ｗ通过羊水穿刺，如检测２１Ｈ体综合征等疾病样被检测到，也有待更多的实践。除此之外，唾液、尿液中的ｎｃＲＮＡ作为疾病标志物的应用也在研巧当中４－１４３［］［］０综上所述，ＩｎｃＲＮＡ凡乎己在生命科学的每个领域崭露头角。总结规律可Ｗ发现，无论是转录前，还是转录后水平，无论是通过与各种组蛋白或甲基化、中调节复合物而调控基因的表达状态，还是作为ｃｅＲＮＡ借ｍｉＲＮＡ之手调控靴基因的表达水平，或是调节ｍＲＮＡ的转录或翻译，ＩｎｃＲＮＡ发挥作用的途径最终还是归结于对基因表达的调控，，其非编码。有大数据研巧证实随着生物的高级化ＲＮＡ的比例就越大，生物在进化过程中，保存了保守性高的基因，并且渐渐衍一生出了这些种类繁多的调控ＲＮＡ，。不同于ｍｉＲＮＡ这类长度基本固定作用方一式单的ｎｃＲＮＡ，、，ＩｎｃＲＮＡ无论从长度分类、分布、发挥作用的方式等等方面都有很大的变异性，挂就提示我们，ＩｎｃＲＮＡ是在进化上晚于基因，甚至也晚于一ｍ，ｉＲＮＡ的类调控分子，他们的多样性至今仍在进化中所越发显得难＾琢！＂＂ＮＡ磨，并且其最初的非编码的定义也受到了挑战，因此研巧ＩｎｃＲ所花费的＂＂ｍＲＮＡ时间和精力想必会比ｉ多的多，因为它是复杂而又迷人的。本综化从也血管发育和疾病的角度阐述了现在己经研究过的一些代表性的ＩｎｃＲＮＡ，并对它们的诊断和治疗价值做出了阐述。血管发生在生命进程中是无ＭＷ５１［４６］处不在的，除了也血管巧胎发育，还与肿瘤、新生儿Ｈ正、ｒ〇ｐ等疾病一，。中的血管新生密切相关，因此这是个有潜力有前景的领域７ 东南大学硕古学位讫文第二章材料与方法１研究对象小鼠：Ｃ５７／ＢＬ６ｎ；Ｐ１９细胞：购自ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎｔｙｐｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，美国模式培养物收集中也），实验室传代。２主要工具、试剂与耗材２．１生物信息学相关网站及软件；２丄１网站：（１）ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ虹ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）：美国国立生物技术信息中也０ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎ化．ｏｖ／ｇ；（２）ｕｓｅｓ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａＳａｎｔａＣｒｕｚＵＣＳＣ）；加利福尼亚大学圣克鲁兹分校网站ｈｔｔ：／／ｇｅｎｏｍｅｐ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／；－－（３）Ｕｎｉｐｒｏｔ（ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｔｅｉｎ）：整合了ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＴｒＥＭＢＬ和ＰＩＲＰＳＤＨ大数据库而成的最大的蛋白数据库ｈｔ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｒｏｔ．ｏｒ／；ｐｐｇ（４）ＣＰＣ（Ｃｏｄｉｎｇ化ｔｅｎｔｉａｌＣａｌｃ山ａｔｏｒ）：北京大学研发的编码能力计算软件网络版ｈｔｔｐ：／／ｃｐｃ．ｃｂｉ．ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｅｎ／ｏ２丄２软件：（１）ＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）：在蛋白质或ＤＮＡ数据库中ｇ进行相似性比较的分析工具，目前有很多版本，本文使用的是ＮＣＢＩ在线Ｂｌａｓｔ；（２）ＤＮＡｍａｎ：美国ＬｒｍｏｎＢｉｏｓｏｆｔ公司开发的分子生物学应用软件ｙ；（３）ＭＥＧＡ６（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＧｅｎｅｔｉｃｓＡｎａｌｙｓｉｓ６）：分子进化遗传分析软件。２．２细胞培养相关试剂与耗材ａ－（１）ＭＥＭ培养基、膜蛋白酶、青链霉素（Ｗｉｓｅｎｔ，加拿大），胎牛血清（Ｇｉｂｃｏ，美国）；（２）ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ，美国）；（３）细胞培养瓶／板／皿及冻存管（Ｃｏｍｉｎ，美国）；ｇ８ 枯巧与方法２．３细胞实验相关试剂与耗材２．３．１质粒转染相关试剂与耗材－（－１）ｕｃ：ＦＰＲＮＡ（吉．４０过表达载体ｐＧＰＵ６／ｕｃ．４０／Ｇ／Ｎｅｏｓｉ玛生物公司，中国）；（２）Ｌｉｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｅｎｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｉｅｓ．美国）ｐｇｇ；２３２．．増殖实验相关试剂与耗材（１）ＤＮＡ含量检测试剂盒（细胞周期）（凯基生物，中国）；－（２）ＣＣＫ８检测试剂盒（Ｄｏｉｎｄｏ，日本）ｊ；２３．３调亡．实验相关试剂与耗材－（ＡｎｎＶＦＩＴＣ调亡检测试剂盒（凯基生物，中国１）ｅｘｉｎ）；－）（２）Ｃａｓｐａｓｅ３分光光度计检测试剂盒（凯基生物，中国；２．４ＲＮＡ实验相关试剂与耗材（１）二乙基焦碳酸（Ｄｉｅｔｈｙｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ，ＤＥＰＣ）（Ｓｉｇｍａ，美国）；（２）ＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ化ｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，美国）：（３）Ｈ氯甲院，异丙醇，乙醇（南京宁试化学试剂有限公司，中国）；（４）引物：所有引物均由Ｐｒｉｍｅｒ３在线软件设计，上海生工公司合成，经实验，引物序列见表１验证能扩增目的基因后采用；（５）逆转录试剂盒：ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，美国）；（６）ＰＣＲ剂盒：ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ？ＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，美试（国；）（７）琼脂糖粉（Ｂｉｏｗｅｓｔ，西巧牙）（８）ＰＣ民产物电泳上样缓冲液：ＳＸＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｅｒｆｏｒＡｇａｒｏｓｅＧｅｌｓ（含核酸染料Ｇｅｌｒｅｄ）（Ｇｅｎｅｒ巧，中国）：？ｎｅ－（９）ＰＣＲＤＮＡａｅＲｕｎｒｅｓｃｂｌｍｒ；Ａｃｃｕｒｔｔａｉｎ〇ＯＩＤＮＡａｄｄｅｒ产物电泳ａｒｋｅｐｐ（Ｇｅｎｅｒａｙ，中国）；（１０）ＰＣ民产物电泳缓冲液：巧Ｅ（Ｔｒｉｓ棚酸）缓冲液（碧云天，中国）；９ 东南大学硕±学位论文－表：Ｓｔｒａｎｄ巧ｅｉｆｉｃＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｔｉｏ打ｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ引物序列１ｐｐ及民基因名称链特＾性引物＊上游引物下游引物Ｕ－ＡＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＴＴＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＡＡＧＴＣＴＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＧＧＣＴＣ．４０ＧＴＴＡＧＣＡＧＰｂｘｌＧＴＣＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＴＣＡＴＣＧＧＧＧＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＧＣＴＣＣＣＴｃｒｒＧＣＡＮｋｘ２－．５ＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＣＣＡＴＡＧＧＣＡＴＴＧＡＧＡＣＣＣＡＡＣＴＣＧＡＴＡ４－ＡＣＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＡＧＴＧＡＧＴＧ■ＧＡＴＣＣＴＣＡＣＡＧＣＡＡｃＴｎＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＧＡＴＡＴＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＴＡＡＧＴＧＡＰＤＨＴＣＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＧＧＡＣＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＧＧＧＡＴＡＧＧＧＣＣＴＣＴＣＧＧＧＣＴＡＣＴ＊ＵＣ－在逆转录中应用链特异性引物．４ｘｌＡＰＤＨＤＮＡ。，分别生成０，Ｐｂ及Ｇ的ｃ２．５Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ相关试剂与耗材（（，１）蛋白提取试剂盒碧云天中国）；（２）ＢＣＡ蛋白定量检测试剂盒（碧云天，中国）；（３）浓缩胶及分寓胶巧制试剂盒（碧云天，中国）：一－－－（Ａ－４）抗：Ｐｂｘｌ（ＳＣ８８９）１、ＧＡＴ４（ＳＣ２３７）、ｃＴｎＴ（泌８１２１）、Ｎｋｘ２．５（ＳＣ８的７）（－ＳａｎｔａＣｍｚ，美国），ａｃｔｐｉｎ（中杉金桥，中国）；（５）二抗：抗兔，抗山羊（中杉金桥，中国）；（６）ＮＣ膜（ＷｈａｔｍａｎＧｍｂＨ，德国）；（７）ＥＣＬ显色试剂盒（碧云天，中国）；３主要仪器设备（１）Ｃ０２：ＴｈｅｒｍｏＳｃ细胞培养箱ｉｅｎｔｉｆｉｃ公司，美国；－工作台（２）ＹＪ８７５净化：苏州净化设备公司，中国；（３）巧光显微镜：Ｏｌｍｓ公司日本ｙｐｕ，；（４）倒置显；Ｎｎ微镜ｉｃｏ公司，日本；（５）上下光源显微镜：江西凤凰光学仪器有限公司，中国；（６）水浴箱；Ｇｒａｎｔ仪器设备公司，英国；（７）隔水式恒温解箱：上海精宏仪器厂，中国；（８）：Ｔｈｅｒｅｎｔｉｆｉｃ髙速冰冻离也机ｍｏＳｃｉ，美国；（９）梯度ＰＣＲ仪：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，德国；（１０）ＡＢＩ７５００巧光定量ＰＣＲ化ＡＢＩ公司，美国；－（１１）：Ｂｉｏｒａｄ电泳仪，美、电泳槽、凝胶成像系统国；（２：１）流式细胞仪ＢＤ公司，美国；（１３）酶标仪：ＢｉｏＴｅｋ公司，美国；１０ 材料与方法（１４）超声匀浆机：Ｕｉｂｒａｃｅｌｌ，Ｓｏｎｉｃｓａｎｄｍａｔｅｒｉａｌｓ公司，美国；（１５）ＯｎｅＤｒｏ计：南京五义科技有限公司，中国ｐ分光光度；４常用试剂配制４．１细胞实验相关试剂－（１）ａ－ＭＥＭ完全培养基ａ；９０ｍｌＭＥＭ不完全培养液＋１０ｍｌ１０％胎牛血清（ＦＢＳ）＋ｌｍｌ青链霉素；２ａ－ＭＥＭ不完全培养液二甲（）细胞冻存液：ＦＢＳＳＯ）：！基亚讽（ＤＭ６：体积比为：３１丽制；（３）细胞诱导液：１００ｍｌ完全培养基＋ｌｍｌＤＭＳＯ；（４）质粒转染后稳定株筛选培养基：１００ｍｌ完全培养基＋５０ｍｇ新霉素（Ｇ４１８）；４．２ＲＮＡ实验相关试剂（１）ＤＥＰＣ水：ＩｍＬＤＥＰＣ加入２００ｍＬ双蒸水，剧烈震荡后定容至ｌＯＯＯｍＬ，室温静置进夜，髙压灭活；〇（〇乙－２）提取ＲＮＡ７５／醇：无水己醇与０：，２０用．１％ＤＥＰＣ水按３１配制‘Ｃ保存；４．３蛋白实验相关试剂（１）ＰＢＳ（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｅｒｅｄＳ址ｎｅ，磯酸盐缓冲液）：将ＰＢＳ粉按比例溶解于双蒸水中配制，用于姐织提取后冲洗的ＰＢＳＷＤＥＰＣ水配制；（２）ｌ〇ｘ电泳缓冲液：称取Ｔｒｉｓ碱３０ｇ、甘氨酸１４４ｇ、犯ＳｌＯｇ，置于１０００ｍｌ，烧杯，加入卵０ｍｌ双蒸水并充分攪拌溶解定容至１０００ｍｌ；（３）ｘ：３９００００ｍｌ，ｌ〇转替缓冲液称取１９．ｇＴｒｉｓ、ｇ甘氨酸，置于１烧杯力口入９００ｍｌ双蒸水并充分揽拌溶解，定容至１０００ｍｌ；（４）抗体稀释液及洗腹液：１０００ｍｌＰＢＳ＋ｌｍｌＴｗｅｅｎ；（５）封闲液：１００ｍＬＰＢＳ＋５脱脂奶粉；ｇ（６）浓缩胶：按表２所示，配制浓缩胶（分离胶百、分离胶配制及分离胶分比已根据本实验涉及蛋白的分子量经过选择）。１１ 东南大学硕±学位论文表２：５％浓缩胶和１０％分离胶配方５％＾缩胶／ｍｌ（６ｍｌ例）凝胶成分１０％分离胶／ｍｌ（＂ｍｌ例）１３０％Ａｃｒ／Ｂｉｓ５－ＩＭＴｒｉｓＨＣｌ（ＰＨ８．８）５．７０．７５ＩＭＴｒｉＨＣ－ｌ（閒６．８）ｓ〇０．０６〇．！０／犯Ｓ０１５４．１双蒸水４０．０６１０％ＡＰＳ０．１５０．００６ＴＥＭＥＤ０．００６５实验方法５．１生物信息学分析５丄Ｃ如？－１７Ｉ／编码里白质能力预－将ｒｕｃｗ序列输入ＣＰＣ网站，如图１，然后运行即可。＂－ａｓａｕｅｎｃｅａｎｔｓｅａｕｆｑｄｔｉｐｔＰａｓｔｅｔｈｅｆａｓｔａｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｈｅｒｅｅｘａｍｐｌｅ：ｄｅｍｏ（）Ａ庶图１；ＣＰＣ网站输入界面５丄２序列比对及进化树构建４０－化格式保存于（）Ｕ．，［ｉＵｔｘｔ文档中１在ＵＣＳＣ数据库中找到人的Ｃ序列ａｓ，－：ＵＣ．４０序列如下ＣＴＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＡＡＧＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＣＧＧＡＴＴＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＣＣＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＡＴＡＴＴ１２ 材料与方法ＡＣＴＣＣＧＣＡＧＡＴＴＣＣＧＣＡＡＡＴＣＴＣＴＣＴＴＡＡＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＣＧＧＣＣＣＡＴＴＣＡＡＧＧＡＴＡＴＴＴＡＣＡＴＡＴＣＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＣＧＧＣＡＣＡＴＴＣＴＴＴＣＡＧＴＣＴＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧＣＧＣＧＡＧＧＡＧＣＣ。（２）确定感兴趣的物种：聚焦脊柱类动物，选择了常用的构建进化树的物种，包括：灵长类（人，，、黑猩猩）咱齿类（大鼠、小鼠）其他哺乳动物类（牛、猪、大象），其他脊柱类（鸡），两栖类（非洲爪蜡、热带爪檐）Ｗ及鱼类（斑马鱼、大长须餘）共口个物种，详见表７。（３）在ＳｔａｎｄａｒｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＢｌａｓｔ中的比对流程如下：在比对框中贴入人的ＵＣ－．４０的ｆａｓｔａ序列ｌｔｉ化ｃｌｌｔｉ，比，比对数据库选择ｎｕｃｅｏｏｅｃｏｎ对方法选择ｄｉｓｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓｍｅｇ沈ｌａｓｔ（适用于物种间比较），其他选项均采用缺省设置，结果发现不能显示感兴趣的全部物种，巧采用了逐个物种基因组比对的方法。将逐个比对得到的目标序列（ｓｕｂｊｅｃｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）Ｗｆａｓｔａ格式保存在相应的ｔｘｔ文档当中。（４）通过；１上，，导入１＾６０４！＾操作我们获得了所有感兴趣物种的同源序列６后，利用ＣＬＵＳＴＡＬＸ进行多重比对（ｍｕｌｔｉｐｌｅａｌｉｇｎｍｅｎｔ），比对结果导入ＤＮＡｍａｎ盾制图。－（５）最后，将比对结果构建进化树，选择ＭＰ法构建ＵＣ．４０的进化树，采用ｂｏｏｔｓｔｒａ检验法，次数为１０００次。ｐ５丄３Ｕｃ．俗在不同基因姐中位置比较－利用ＵＣ．４０的序列信息，在ＮＣＢＩＢｌａｓｔ中获得其在人和小鼠基因组中的位置。ｔｌ－．４Ｕｃ．４０在不同基因组中转录因子结合位点比较（ＥＮＣＯＤＥＨＭＲ１）在ＵＣＳＣ数据库中，利用中的ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｂｉｎｄｉｎｓｉｔｅ数据库，査找在人、小鼠中保守的转录因子结合位点及相应的ｇ转录因子．（２）在Ｕｎｉｒｏｔ数据库中，根据转录因子的名称，查找相应的功能ｐ。５．２表达谱构建由于本实验需要准确孕期的雌鼠Ｗ获取小鼠巧胎，因此于每日晚间临近凌晨时合笼，次日早上九点前进行阴道检栓（检栓时间若推后，可能因阴道栓子脱落造成漏检）。雌鼠孕期从合笼次日零点算起，例如５月１日晚间合笼，若雌鼠受，孕贝！Ｉ怀孕时间从５月２日零点算起，至５月１２日中午１２点，为怀孕１０．５天，即Ｅ１０．５。于Ｅ８－．５巧．５左右，可Ｗ于怀孕的雌鼠下腹部触及绿豆大小成串分布的子宫（注意排除膀脱的干扰），至Ｅ１４．５天，子宫逐渐増大为黄豆大小。分别于Ｅ１０．５或Ｅ１４．５，将怀孕的雌鼠处死，取出串形分布的小鼠子宫，利用显微器械，在有、上下光源的显微镜下，分别取出胚胎小鼠的屯、、脑巧、肺及胃这五个脏器（由０，于Ｅ１．５胚胎的肝、肺及胃在实验用显微镜下不可见即使在更高倍数显微镜下１３ 东南大学硕±学位论义取材，也难Ｗ满足后续实验要求，因此该时间点只取了也、脑这两个脏器）。此夕ｈ新生小鼠于生后立即取化肉眼下即可获取。动物标本取材后，用ＤＥＰＣ水溶解的ＰＢＳ清洗后，立即放入Ｔｒｉｚｏｌ中，放置在冰上备后续实验；ＲＮＡ提取，逆转录及ＰＣＲ步骤见分子生物学实验部分。５．３细胞水平实验５．３１．细胞培养及传代’Ｐ１９细胞培养于上述完全培养液中，置于巧Ｃ、５％Ｃ０２培养箱中培养。细￣胞融合度达８０％９０％时，用化２５％膜酶消化并接种于培养瓶或板中继续培养。５．３．２细胞冻存，〇〇〇５１１１１，弃上清，如上述消化细胞，移入无菌离私管内室温１§离也１１，标记细施种类２ｍ，，旋紧管日ｌ冻存液将细胞重悬后将细胞悬液吸入冻存管中‘－及冻存日期７０Ｃ冰箱过夜，然后移入液氮罐内。将冻存管置于梯度降温盒中于冻存。５．３．３细胞复苏‘自液氮罐中将冻存管取出，快速置于３７Ｃ水浴箱中轻摇，保持冻存管上部／３，于超净台内将细胞转移至１在水面上，！＾；遥免污染。当细胞悬液完全解冻后ｍｎ，离也管中，室温１００化离屯５ｉ。弃上清后用新鲜培养液将细胞重悬于接种在培养瓶中，放入培养箱中培养。５．３．４细胞诱导将消化吹散后的细胞予诱导液培养细胞于培养皿中，皿底提前铺好琼脂，防止细胞贴壁导致诱导失败；细胞在诱导过程中逐渐抱团形成胚胎样小体，Ｈ天后（Ｄ３）替换７０％的诱导液继续诱导，于诱导第四天（Ｄ４）将胚胎样小体接种至－，９Ｄ１０左右，在显微镜下培养板中贴壁生长．此时替换为完全培养基诱导至Ｄ、肌细跑诱导成功观察，，细胞诱导各个时间点照，可看见跳动的梭形细胞提示屯片见图２。诱导ＤＯ，６，８，１０四个时间点分别提取的ＲＮＡ及蛋白质备实验，提取方法见下述。５．３．５质粒转染及稳定株筛选巧‘（１）转染前准备：Ｐ１９细胞均匀种于六孔板中，置于Ｃ５％Ｃ０２培养箱￣７０％，中，种植密度为经过２４ｈ生长后，细胞长至５０％融合度为宜。质粒转染前细胞培养基用不含有抗生素的完全培养基替换。（２）转染：下用量每孔计）首先用５Ｕ１无血清培养基，稀释２ｕｇ质。Ｌｉｔａｍｉｎｅ２０００粒（过表达／空载对照），轻轻振摇使之混合均匀然后将５ｕｇｐｏｆｅｃ１４ 材糾与方法稀释到５０Ｈｉ无血清培养基中，轻轻吹打混匀，室温脾育５ｍｉｎ。之后将稀擇的质粒和Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００混合，轻轻吹打混匀，室温下解育２５ｍｉｎ。最后？点状ｗ，均匀地每孔加入６０ｌ质粒转染混合液，轻轻旋转培养板使其分布均匀置于培养箱中生长４－６。小时后换液。（３）转染后观察：２４ｈ后，细胞融合度达到９０％左右，消化转移至瓶中缝续生长，待细胞贴壁后利用巧光倒置显微镜观察緑色巧光，辅助了解质粒转染效率，细胞巧光照片见图３。（４）稳定株筛选：待细胞融合度达到５０％左右，开始用新霉素（０．５ｍｇ／ｍｌ一－完全培养基）进行筛选（该浓度经过摸索，般在５７天将没有转染成功的细胞－全部杀死），筛选５７，，取其中部分进行天后，得到稳定株将稳定株冻存备用过表达验证，具体步骤如下述ＲＮＡ实验，。（ＲＮＡ提取、逆转录、ＰＣＲ蛋白提取、浓度测定及ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ步骤见分子生物学实验部分）５３６．．细胞増殖实验５．３．６．１流式细胞仪细胞周期实验本实验采用视化丙巧染色Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｓｔａｉｎｉｎ，即ＰＩｓｔａｉｎｉｎ法进行检测。（ｇｇ）（：，１）饥饿同步化处理将事先接种于孔板内生长的细胞（融合度１０％左右该融合度经过摸索，保证细胞收集结束时尚未进入接触抑制期）于实验时替换成不含有胎牛的培养基进行饥饿处理，饥饿２４ｈ（饥饿时间经过摸索，尽量达到组间周期同步化，并避免细胞状态过差致后续生长失败）。（２）：恢复血清，收集细胞饥饿２４小时后，在替换，替换成完全培养基前（化）及替换完培后２４ｈ、４化分别收集细胞收集细胞时，先弃去培养基，ＰＢＳ；１５ｍ洗两遍，膜蛋白酶销化细胞，完全培养基吹打至单细胞悬液，并转移到．ｌ离也管内－，１０００ｇ离必３５分钟，沉淀细胞。小也吸除上清，可；＾残留约５０微升左右的培养液，Ｗ避免吸走细胞Ｓ，，。加入约１ｍｌ冰浴预冷的ＰＢ重悬细胞并转楼、、到５ｍｌ流式细胞仪检测离屯管内，，可。再次离也沉淀细胞小屯吸除上清Ｗ残留约５０山左右的ＰＢＳ，Ｗ避免吸走细胞。轻轻弹击离也管底适当分散细胞，避免细胞成团。‘ｍ－（３）：乙醇中，轻轻吹打泡匀，Ｃ固定。细胞固定加入１ｌ冰浴预冷７０％２０（４）染色：每管细胞样品中加入０．５ｍｌＰＩ，缓慢并充分重悬细胞沉淀，３７‘Ｃ遁光温浴３０分钟。（５）流式检测和分析：用流式细胞仪在４８８ｍｎ波长处检测红色巧光，采用分析软件Ｍｏｄｆｉｔ进行细胞ＤＮＡ含量分析。Ｓ．３．６．２ＣＣＫ８实验‘３于９６孔板中接种细胞悬液，每孔约２Ｘ１０个细胞，将培养板置于３７Ｃ，５％Ｃ〇２４小时，随后每天（Ｄ１，２，３，４）相同时间点按２的培养箱中培养１：１００比１５ 东南大学硕±学位论文’例－，将相应体积的ＣＣＫ８溶液中加入孔板中，每组设置６个复孔，置于３７Ｃ培养箱中解育２小时后，用酶标仪测定在４５０ｎｍ处的吸光度。５．３．７细胞调ｔ实验５．３．７．１流式细胞仪细胞调亡实验ｍ－－－ｎｏ－本实验采用ＡｉｅｘｉｎＶＦＩＴＣ和７ＡＡＤ（７ＡｍｉａｃｔｉｎｏｍｃｉｎＤ）双染法检测ｙ细胞调亡。（１）饥饿处理，收集细施：将事先接种于孔板内生长的细胞（融合度７０％左右）于实验时替换成不含有胎牛的培养基进巧饥饿处理，饥饿１化后（饥饿时间经过摸索，避免了时间过短因代偿尚未造成差异，或时间过长导致过多细胞死亡而检测失败），弃去培养基，ＰＢＳ洗两遍，膀蛋白酶消化细胞，完全培养基吹打细胞至单细胞悬液，并转移到５ｌ流式细胞仪检测离也管内ｍ。、（２）１５００ｒｐｍ离屯５ｍｉｎ，弃培养基，ＰＢＳ吹打至单细胞悬液，重复２次。－（３）加入４０〇４１结合缓冲液重悬细施，在细胞悬液中加入５１１＾（＼＾１６义１１１乂｜打Ｃ和１０ｌｌ－，混匀后于室温避光脾育Ｆ７ＡＡＤ１５１１１；１１。＾（４）流式细胞仪检测细胞调ｔ，在散点图中，根据左上象限是死亡细胞，左下象限是活细胞，右上象限是晚期调亡细胞，右下象限是早期洞亡细胞，计算调亡细胞所占比值。５３７２－Ｃａ３．．．ｓｐａｓｅ测Ｊ定（１）收集细胞，加入５０ｌｌ裂解液（１ｍｌ裂解液＋ＳｊｉｌｌＯＯｍＭＰＭＳＦ＋ｌＯｊｉｌＤＴＴ，＾现用现配），吹打均匀。上裂解°（２）冰６０ｍｉｎ，期间祸旋振荡４次，每次１化，裂解完成后４Ｃ１００００，ｍ＇、ｌｍｒｐ离巳ｉｎ〇（３）小私吸取上清至新的ＥＰ管中，冰上待用，应用ＢＣＡ法测定蛋白浓度（详见下述）。（４）吸取５〇ｎｌ含１０〇ｎｇ蛋白的细胞裂解上清，体积不足５０叫时用裂解液补足。（５）加入５０ｘｘ，，＾１的２反应液（５〇ｎｌ２反应液＋０却１ＤＴＴ现用现配）然后°加入５叫Ｃａｓｐａｓｅ３底物，３７Ｃ脖箱中避光巧育４ｈ。（６）酶标仪于４０５ｎｍ测定吸光值。５．４分子生物学实验５．４．Ａ提取１ＲＮ应用ＴＲＩｚｏｌ法提取总ＲＮＡ。（１）动物标本或细胞取材后，立即加入１ｍｌＴｒｉｚｏｌ，超声匀浆（组织需要，细胞不需超声匀浆）后加入２００山Ｈ氯甲烧，剧烈摇晃震动１５秒Ｗ上，室温静’止１５ｍｉｎ后，１２０００，４Ｃ离也１５ｍｉｎ．ｇ（２）小如吸出上清，加入等体积于上清的异丙醇，翻转混匀，稍静置后予１６ 材料与方法’Ｃ离必１２０００ｇ，４ｌＯｍｉｎ，倒弃上清．入‘（３）加１１１１１７５％乙醉，尽量吹散团块，７５０〇３，４（：离也５如１１（该步骤重复两次）。（４）倒掉上清，纸上空干后，加入适量去ＲＮＡａｓｅ水溶解，应用ＯｎｅＤｒｏｐ－分光光度计测定ＲＮＡ浓度及纯度，ＷＯＤ２６０／ＯＤ２８０读数在．２．１１８之间为准。５．４．２逆转录°°根据表３所示，将反应物混匀，根据反应流程：４２Ｃ６０ｍｉｎ，７０ＣｌＯｍｉｎ，上机进行逆转录反应。表３Ａ：链特异性逆转录反应体系成分体积／ｕｌ（反应体系共２０ｕｌ）ＲＮＡ１ｕｇ链特异性引物－（Ｓｔｒａｎｄｅｃｉｆｉｃｒｉｍｅｒ）２巧ｐＤＥＰＣ水将上述补齐至口反应缓冲液（ｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｅｒ）４ＲＮＡ酶抑制剂（ＲＮＡａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）１脱氧核糖核巧Ｈ踞糜混合物（ｄＮＴＰｍｉｘ）２聚合酶（ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）１表３Ｂ；随机引物逆转录反应体系成分体积Ａｌｌ（反应体系共２０山）ＲＮＡ１ｕｇ随机引物（ｒａｎｄｏｍｐｒｉｍｅｒ）１ＤＥＰＣ水将上述补齐至口反应缓冲液（ｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｅｒ）４ＲＮＡｉｉｂｉｔｒ１酶抑制剂（ＲＮＡａｓｅｎｈｏ）脱氧核糖核昔Ｈ巧酸混合物（ｄＮＴＰｍｉｘ）２聚合酶（氏ｅｖｅｒｔＡｉｄ民ｅｖｅ＾ｓｅＴ＾処ｓｃｒｉｐｔａｓｅ）Ｉ５．４．３ＰＣ民°°４，：，，根据表所示，将反应物混勻反应流程为９５ＣｌＯｍｉｎ；随后Ｗ９５Ｃ°１５３化及６０（：，Ｉｍ。通过炼解曲线及电泳结果（详见下述）确认产ｉｎ循环４０次一Ｔ（ｃｃｅ物是否单、正确。相对表达直通过扩增产物所需的循环次数Ｃ值ｙｌ＆ＧＴ＝－ｔｈｒ，。ｅｓｈｏｌｄ）计算，应用ｒ法其中ＡＣＴＣＴｓａｍｌｅＣＴＧＡＰＤＨｐ表４：ＰＣＲ反应体系成分体积／山（反应体系共２扣１）预混巧（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣ民ＭａｓｔｅｒＭｉｘ）１２．５上游引物（ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ０５）．ｅｖｅｒｓｅｒｉｍｅｒ．下游引物）０５（ｒｐｃＤＮＡ模板１ＤＥＰＣ水＾１７ 东南大学硕±学位论文文４．４ＰＣ民产物琼脂糖凝胶电泳％－（１）用琼脂糖粉制成浓度为１．５（ＤＮＡ分离范围为０．２４化）的凝胶。（２）４山上，将１山ＰＣＲ产物与样缓冲液混匀后，加入凝胶的点样孔中并同时上样ＤＮＡｍａｒｋｅｒＷ指示条带的分子量大小。（３）电泳电压为６０Ｖ，时间为４５ｍｉｎ，根据具体倩况微调。（４）电泳完毕后在紫外灯下显影，结果见图７。图中的第１，２，３泳道分／ＣＷ－ｍ别为ｒＣ，Ｐｂｘｌ及ＧＡＰＤＨ的产物，第四泳道为ａｒｋｅｒ。５．４，ｗｅ．５蛋白提取浓度测定及ｓｔｅｍｂｋｒｔ（１）细胞蛋白提取和制备于六孔板每个孔中加入１ｍｌＰＢＳ洗絡２遍，弃尽ＰＢＳ，置于冰上。５，按表所示配制方法，制备蛋白裂解液取适量加入孔板中，置于四度摇床上缓慢震荡，，１５ｍｉｎ。震荡完全后，用细胞刮反复刮下细胞移入ＥＰ管中冰上静置’、１５ｍｉｎ。４Ｃ，１５０００ｇ离屯２５ｍｉｎ，取上清至新的ＥＰ管中。表５：蛋白裂解液配方成分体积／ｕｌ蛋白裂解液（ｌｓｉｓｂｕｆｅｒ１０００ｙ）蛋白巧抑制剂１ＰＭＳＦ５雜酸度抑制剂＾（２）虽白变性’：＾上样缓冲液为４：１的比例，按蛋白上清，制备蛋白样品ｌＯＯＣ水浴变’Ｏｍｉｎ－２０Ｃ保存。在该步骤前性，取，ｌ，分装后２叫蛋白上清用于浓度测定详见下述。（３）蛋白浓度测定（ＢＣＡ法）根据样品数量所需，按５０：１比例（５０体积ＢＣＡ试剂Ａ＋１体积试剂Ｂ）配制ＢＣＡ工作液，充分混匀后冰上待用，现配现用。按表６所示，配制梯度浓度蛋白标准品，在％孔板中，先加入１８ｕｌ双蒸水，再依次加入上述蛋白样品，每孔２山。°每孔加入２００叫ＢＣＡ工作液，３７Ｃ避光解育３０ｍｉｎ，于５６２ｒａｎ波松检测ＯＤ值，绘制标准曲线。标准曲线绘制后，按照上述２山蛋白样品＋１８山双蒸水＋２００山ＢＣＡ工作液的配比加入％孔板，脾育，、测定后根据标准曲线计算蛋白浓度备用于电泳时蛋白上样量汁算。１８ 材料与方法表６；蛋白标准品梯度浓度配制蛋白标准０１２４８１２１６２０品ｕｌ（）双蒸水２０１９１８１６１２８４０（山）蛋白含里００．５１２４６８１０Ｃｕｇ）－（４）ＳＤＳＰＡＧＥａ将干净、干燥的两块玻璃平板置于平板夹中，固定在灌胶支架上。按表２配制适量分离胶，加入两块玻璃板的间隙，然后沿玻璃板边缘小也缓慢加入双蒸°水封胶，Ｗ防氧气抑制凝胶聚合３７Ｃ赔育２０ｍｉｎ。，ｂ弃去双蒸水，，，并用滤纸吸净残留。配制浓绵胶如上述加到玻璃板之间°立即插入合适的梳子，３７Ｃ脖育１５ｍｉｉｉ。ＩＸＣ浓缩胶聚合完全后，小也拔除梳子，置于电泳植中，并加入电缓。每孔加入等质量、适量的各个时间点的蛋白，加样时注意避免样品溢出，空泳道于加入相应体积，ａｒｋｅｒ。ＩＸ上样缓冲液Ｗ平衡并根据目的蛋白大小选择合适的ｍｄ浓缩胶恒皮６５Ｖ，比；分离胶恒皮１８０Ｖ，电泳至漠酪蓝指示剤跑至分离胶底部为止。ｅ电泳结束后巧下玻璃板，根据ｍａｒｋｅｒ所示和目的爱白分子量大小切胶。切下的胶做好标记，于ＩＸ转缓中平衡１５ｍｉｎ。期间裁剪大小造宜的８张滤纸、１张ＮＣ膜，二者置于ＩＸ转缓中平衡ｌＯｍｉｎ。，制作凝胶，玻棒赶置于、膜、滤纸Ｈ明治走气泡后夹于多孔海绵与塑料板之间电泳槽中，使凝胶朝向阴极，ＮＣ膜朝向阳极。３００ｍＡ恒流电转移。１小时，双蒸水略漂洗，进入下述步骤ｆ取出ＮＣ膜。（４）免疫印迹ａ牛奶封闲：将ＮＣ膜放入培养皿中，加入封闭液，室温下缓慢轻摇１小时。一—ｂ抗解育：将膜放入大小合适的塑封胶膜中，加入稀释好的抗，去除气泡’，封好膜口，摇床上室温缓慢晃动，脖育４ｈ，然后４Ｃ过夜。一ｍＣ洗涂：弃去抗，用洗膜液洗涂条带４次，ｌＯｉｎ／次。ｄ二抗膊育：将膜放入大小合适的塑封胶膜中，加入稀释好的二抗，去除气泡，封好膜口，摇床上室温缓慢晃动，解育比。ｅ洗冻：弃去二抗，洗膜步骤如上。（５）显影（ＥＣＬ化学发光法）将检测试剂１和２等体积混合，取制成显色工作液（现用现配，注意避光），将ＮＣ膜放在曝光台上，蛋白面朝上，将显色工作液均匀滴在条带上并曝光。６统计方法：１９ 东南大学硕±学位论文ＳＰＳＳ２０，采用．０软件处理数据Ｗｉ±ＳＤ表示。两样本均数比较用ｔ检验，多组比较采用单因素方差分析（ＯｎｅＷａＡｎｏｖａ），Ｐ＜０．０５或ＰＯ．Ｏｌ表示有ｙ统计学差异。２０ 实驗结果第Ｈ章实验结果－１一－生物信息学ＵＣ．４０在不同水平的保守性分析１１．核巧酸序列水平－１（ｕｅ如表７所示，ＵＣ．４０序列在人与其他２个物种中，序列重合度ｑｒｙｃｏｖｅｒ）—－－达到６６１００％，致性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）达到９２１００％，ＤＮＡｍａｎ软件计算得出这１２个物种的比对序列。。，核昔酸排列保守性达到６５．４１％序列比对及进化树见图４７－表：Ｕｃ．４０在口个物种中的比对结果Ｓ－ｉ．ｕｅｒＩｄｔｉｔ／％ＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｌｏｃｔｉｏｎＧｅｎｅｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅ物种ｐｅｃｅｓＵｃ４０Ｑｙｅｎｙａ（ｃｃｏｖｅｒ／％ｓｅｑｕｅｎｃｅＩＤ）ｏｍｏ－－－人Ｈｓａｉｅｎｓ成ａｈｓａｕｃ．４〇１００１０Ｃｈｒｌ：１６１松５３３９１６１８２５５ｒｅｆＮＧ）２於ｐ（０）｜Ｊ８５ａｎ任ｏｏｄｅｓｒ－－－ｕｃ，４０００００Ｃｈｒｌ：１４２９８７８８６１４２９８８１ｒｅｆＮＣ００６４６８．３黑猩猩Ｐｌｔｔ１１ｇｙｐｌ＿｜Ｐ３２（的－－－．ｒ：ｒｅ－猪Ｓｕｓｓｃｒｏｆｅ（Ｓｓｃ）ＳＳＣＵＣ４０１００１００Ｃｈ４９巧６５９７６９３７６６２２２ｆＮＣ０１０４４６４ｌ｜＿ａｕｒｕｓａ－ｕｃ－－牛Ｂｏｓ．４０１００９９Ｃｈｒ：ｒｅｆ．ＴＢｔｂｔａ３５１０６８２９５１０７０７５ｌＮＣ００７３０１５｜（）—＊Ｅ－－．大象ｌｅｈａｓｍａｘｉｍｕ＃ｕ１００９９ＣｈｒＵｎｄｂｊＡＢ５８４４８３１ｐｓｅｍａｃ．４０｜］巧ｍａ）ａｔ州ｓｍｏ－－－ｔｕｓｎｏｒｖｅｕｃ．４〇０ｈｒ：８０８巧８０１８巧６ｒｅｆＡＣ００００８Ｕ大鼠Ｒｉ１００１０Ｃｌ３１１９ｉｇｌ＿Ｒｎｏ５（）小鼠Ｍｕｍｕ－ｕｃ－－２ｓｓｃｕｌｕｓｍｍｕ．４０１００１００Ｃｈｒｌ：１７０７５１０１４１７０７５１ＣＵ２１巧．４卵Ａ｜Ｍｍｕ６０（）－－９－鸡ＧａＵｕｓｇａＵｕｓ（Ｇｇａａｕｃ．４０３９７Ｃｈｒ８：５２４６３１２５２４６５４１ｒｅＮＣ００６０％．３）ｇｇｆｌ＿｜－－＊－ｅｎｏｕｓｘ．ｒｅＮＷ非洲爪巧Ｘｌａｕｃ４〇６９９２ＣｈｒＵｎ：１０８７７３７１０８７９０８００３Ｉ６３４ＩＬｌｐｆｌ＿｜ｌａｅｖｉｓｌａＡｆｒｉｃａｎ（Ｘ，ｃａｗｅｄｆｒｏｌｇ）＊－ｒｎ＊－热带爪晚Ｘｅｎｏｕｓｘ－６９９２Ｃｈ：ｒｅｆ１１．１ｔｒｕｃ．４０Ｕ１０８７７３７１０８７９０８ＮＷ００３１６３４］ｐｌ＿ｔｒｏｉｃａｌｉｓｔｒｗｅｓｅｒｎｐ（Ｘｔ，ｃｌａｗｅｄｆｒｏｇ）ａｅｎｏ－－＊：．ｒｎｄｂ大长须餘Ｂａｌｔｅｒａ化〇出４０１００９９ＣｈＵＡＢ巧５２％．１ｐｊ｜ｂｏｎａｅｒｅｎｓｉｓ＃Ｂｂｏ（）－－－６６９２Ｃｈｒ２斑马鱼Ｄａｎｉｏｅｒｉｏｄｒｅｕｃ．４０：ｌ％９０５８４９５９０７４８ｒｃｆＮＣ００７１１３．５Ｒ１］＿｜Ｏｒｅ（）＾？Ｕｎ表示染色体位置不明确；＃代表比对结果反馈为ｕｃ．４０，说明ｕｃ．４０的注释在大象和大长须館这两个物种中已经存在。２１ 东南大学硕’±学位论文ＨｓａＣＴＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣｅＡＪ？ＡＧＡＣＧＣＴＡＡＴＴｆｃＣＧＧｆｌＴｆｃｆＧＣＣＡＧＡｆＧＡＨｌｃＣＡＴ３７５＾＾｜｜｜｜＾＾｜｜ＰｔｒＣＩＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＫ＾Ａｉ＾ＡＧＡＣＧＣ；ＴｃＧＧＡＩ：ｉｃｉＧＣＣＡＧＧ１Ｃ础ｋｉＧ站ＡＩＣ知ＴＪ７５＾＾小牛｜ＭＥｍａＣＩＴＣＣＴＡＣＧＡＧＡＣｌｇＡｉ＾ＡＧＡＣＣ〔ｃＧＧＡｒｉ［ＩＧ［［ＡＧ日ＩＧＡＡ＾了ＧＡＡＡＩＣＣＡｉｎ７５＾＾伞小！中｜ＢｂＯＣＩＴＣＣＴＡＣＣａＧＡＣＩｃＢｆｌｉＢＡＧＡＣＧｉＴＯ｜ｃＴｆｃａｌｌ｜ＴＭａ｜ｃＧＧａＴＴＣＴＧＣＣｆｔＧＧｌＧＡ＾ＩＧＡＡＡＴＣＣＡＴｌＩ７５Ｄｒｅ．．．ＴＩｉｇＣＣ占Ｇ日ｉｓＡＩ７ｉ＾ＴＧＡＡＡＩＣＣＡＴｌ２ＸｌａＩｔＧＣ乙ＡＧ白ｐＡ＜Ｓ碱ＴＧＡＡＡＣ占己ＡＴｌ２７｜亡ｒＳｊＳＪ占ＣＪ２７ＸｒＣｔＡｌＧＡＡｆｔｌａｒＪ巧巧＾ＭｍｕＧＧＣｌ＊ＴＣ＊ＧＣＣＡＡＢＧｃＧＣ（ｌｃｃＧＣＣＣ？３ＫｌｌＴＢ８ＧＧＡｆｔＡＧＡＡＩＧＩＧＣＣ£４｜Ｊ｜｜｜｜｜ｇＲｎｏＧＧＣｌｌＴｃｆｌＧＣＣＡＡＨＧｃｌＧｃ（ＪｃｌｃｌＧＣＣＣｃｌｊ；ｌＴｌｌｌｌＢｃｌＧＡＡＡＧＡＡＴＧＸＧＣＣ£４＾｜｜Ｓ３ＣＧＧＣｌｆｌｌｃｆｌＧＣＣＡ；ｔＨＧｃＧｃｌＪｃｌｃｌＧＣＣＣｃｌＡＢＴＴＴＴＨＣＫＡＡＡＧＡ；ｉ７ＧＴＧＣＣ６４＾｜｜＾Ｂ亡ａＧＧＣｔ｜ｔｃ｜ｇＣＣＡ；｜｜ｇｃｇｃｇＣＣＣｃ；）ｔｉｔｃＢｊＵＧＡＡＩＧＩＧＣＣ£４｜｜４４４｜｜｜邏｜Ｊ｜Ｇｇａ０ＣｏｏｓｅｎｓｕｓＰｔｒＴＴＴＴＡ＆ＴＴＡＪ．ｔＴＣＣＴ：ＥＡ占ＴＴＡ占５占了占ｒＡＴ：：：二二Ｇ：：；：ｒ：：：：：；；；ｒＳＣＳ１５。：Ｗ＾ｙｐＩ小ＳＳｊ！ｊｊＪＳＩＥｍａ；ＴＣＧ：Ｉ：７：７７；＊Ｍ；ｒ３Ｃ：■：：ＴＴＴＴＡＡＴＴＭＴＣＣｌＩＡＳＴＩＡＡＡＡＩ；ｉＩｉｒｇＣＣｉＧＡＩ：Ｃ＼ｍ＊ＪＢ１５０ＪｊｊｊｊｊｊＪ｜Ｂｂｏ：ＴＴＩＴＡＡＴＩＡＡＴＣＣＴＩＡＳＴｒＡＡ＊ＡＴＡｉＡＴＩＣｉＣＣＧＬｇＡＩｃｃＢ；．：ｒ：ｒ：ｒ７；：！ＩｊＬｗＩＧＣ：？ＩＭ１５０ｇｙｊＪｊｊＤｒｅｉ：Ｃ－ＡＧ＆ｒＳ＊：ＴＴＴＴＡＡＴＴＡｉＴＣＣ：ｔＡ５ＴＴＡＪ５ＡＴＡｒ；＊ＴｒＫＣ．Ｔ＼ｚｚＳ；：ｒ：ｒ：ｒ？Ｌ；！ｌＧＣ；Ｍ１０２ｊＪｙｊｊＪ｜Ｘｌａ：ＴＴＴＴＡＡＴＴＡＳＴＣＣＴＩＳｉＴＴＡＡａａＴＡＴｒｉＴ：ＣｃＣＧｉＧｉｌ＼ｚ２ｉＳ；；ｉ：ｒ：ｒｃｒｒｉ：）ｈｉＡｌｌｌＪ：ｌ１０２ｇｊｐＪｊｊｊ｜ｊＸｔｒＴＴｌＴＡ＾ＴＴＡＪｉＴＣＣＴＴＡＡＴＴｆｔＡａＡＴＪｋＴａＴＴＣｔＳｉｆｔＧｔ＼ｚｊ＾ＳｉＲｗＳａＪ＊Ｍ１０２ｆｇＣＣＪｌＩＣＩＣＩＩｉｐａｉ｜ｉＪＭｎｎｉＧｍｉＡＡＴＴＡＡＩＧ平ＴＧＴＡｆｔｆｌＴ巧ＣＣＴｔＧＯＴＯＳＣＪｉＴｌＰｔ：ＡＡＧＡＧＡＣ；：６１ＧＧ１３９杏ＩＥ狂小｜巧ＲｎｏＧｉｒｉＸＡＡＴＴＡＡＩＧ夺ＩＧＸＡＡＡ鴻ｔＣＣｌｆＯＴＣｆＣ：！Ｗｔ：ＡＡＧＡＧ占；ＳＩｇｔ？ＧＧ１３９屯和屯Ｓ＾Ｊ屯｜Ｓｓｃ畔ｍＸＡＡＴ；！站ＩＧＴＧＡＡＡＴＣＣｌ〇｜〇１１Ｉ站Ｇｌ？ＧＧ１３９夺ｆ髮｜屯屯却＾田中｜Ｂ亡ａＧ＾ＴＴＡａｉＴＡａＴＧＡｔａＴＣ＾ＪＪＵｉＴＨｃＣＴｊＪＪＧｄＪｃＡｃＪＴＴＴＪ＾ＧＡｉｌＡ：ＳｌＧ。。１３９ｇ＾＾私中碰ＧｇａｃｉＣｊ屯讀ｒＪＵＧＡＧＡ巧４６ｆ屯远Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓａｔｅｔｇｃａａｃａ二ｔｇｃａｇｃＨｓａ巧ｃＪｉｉ．ＭｇＭｇｃｇ２２４巧暫ｍ；｛ｍ￡ｇｙ增｜Ｐｅｒ－＾Ｅ：：．＝；：ｒ：ＶＭＧＣ＾Ｃ；ｂＸＴ：Ｒｇ２２４ｈ１ｇｇｇ｜｜Ｊ＞ＫｒＰ：ｔＣＩＧｉＢＥｍａ：ｃｊ；ｚｒ：ｆｌｊｉｃｉＣＡｔＴＣｗＨｇｇＢｇｃＩｇ２２５｜｜Ｉ１＾Ｑ｜ＵＩＱＪ＾＾｜｜：；Ｂｂｏ；￡；Ｅ－二－：二Ｓ■。巧了了ＶＴＩｖＧｃｌＧ２２４峰ｊ取寺Ｉ３中巧２巧ｆｒｅｃ．ＴＡｌｒＧ１ＤＩＧ＾Ｂ：：ｉ：ｆ７：ＴｈＣｉｌｌ：Ｒ：（ＭｉｆｌＧｆＴＴ１６５［ｇＪＪ１２ＸｌａｈＲａ马１＞；：：函ＳＸ巧ｚｒ：Ｒ》Ｓｃ—１ｊｆ２和宅：＾哪＾ｌ■ｇ＊ｘｃｒ＾｜＾：＆和巧巧沁學睡〔：幽《曼！１．．．．１＾２［｜＾５省３｜２画４｜ＭｍｕＧＴ：Ｊ：ＱＳ￡｜ｊｋＩＡｌＧＧＧＡ；ｉＲ：ｉＸＣＧＣＩＪｍｌＣＣｌＴＴ；ｌ；＾ｌＴ２１４ｐ｜＾ｊＩ｜｜｜Ｊ｜｜｜ＲｎｏＧ二Ｔ若Ｔ；Ｂ屯了４三；因占ＴＣＧ（７３ＪｉＢＩＩｔＣｃＩｔＩｔ＾ｉＩｔ２１４ＳＩＪｊ＾：ＳｓｃＧ；Ｔ＊：巧名：１屯；ＨＪＵＩ；ｉＴＧＧＧＡ；ｉ：ＴＣＧＣＴＪ２１４ＪｊＳ！｜２Ｊ夺中ａｃＡＩ；ｆｌ；：ｆｉｔ斗。ＡＡＴ４ＴＧＧＧＡｉ：ＴＣＧＣＩｊｔＣｃｔｔｉｔ２１４ｇ巧名屯＊Ｓ：Ｓ｜！｜＾ＱＳ间｜｜｜小Ｌ了ＧＩｔ＾ＴＢｌＢＪＴ如ｆｌＩ＾＾ａａＴＪＴＧＧｇＡＪＢＢＢｌＢＴＣＧＪｔ品ｉＪＳＵｔｄＪｉＩｔＪ占ＴＣＴ１２１ｇａＣｏｎｓｅｎａｕｃａａｔｔｔａａａｔＬａａｃｔａａａｃ亡ｔｅａｔｃｇｃｇ＾ＨａａＣＴ．；ｌＧＧＣ；ＧＡｃ２４７｜｜巧｜｜｜｜ｆｌＰｒＣ．ｊＪｔｇＢｇｃＩａＩｇＪ４７：：Ｋ＾Ｂａｃ２？ＨｕＥａＣｌ．ｍＡｌ４ｍＳ＾ｘＧｃＡｌＧＡａＣ２８ＲｈＢｔ＞ＱＣｌ｜．区｜｜ＣＩｇ｜ｇｃ｜ａ｜ｇＪ；去：２４７ＰｔＯｒｅ１６５ｒ［１７２ＥｔａＸｌａ７Ｘｒｒ１２Ｉｔ■ＩＭｍｕＴＡＴ师ＧＧＴ五Ｇ祉Ａ２４£１ｆ甲中呵，３＆Ｒｎ。Ｔａａ？ＣＳＣｌＴｌＧＡＧ：ｌＴＧＧ：ｒＡＧＧｆｌＡ２４６＿＾ＪＪ｜ｆ§｜Ｓｓ。Ｔａａ：＊Ｃ：ｌＴＧＡＣｎＴＧＧＸＡＧ站Ａ２４６ＩＪ巧ｊ｜｜｜Ｇｅ＊ＢｔａＴａａＣｔｔ（ＧＣＳ１：Ａ４Ｊ进如Ｈｔ｜＾ＡＧｉ｜ｔＧＧＡＡ２６｜ＳｋＧｇａｌ：４ｌ４｜｜ｃｉＢＴＣＴ（ｊＡ（ｎ｜ＴＧＧ：Ｉ１４８Ｈ动ＢｉＪｓｅｎｕＣｏｎｓｓ图４；序列比对及进化树１．２基因组位置水平－－化Ｕｃ４０．：１６８７７８６５１ｌｌｌ（Ｇ民Ｃｍ３８３，５７ＢＬＪ）。．位于小鼠ｃｈｒｌ３６８３２８Ｃ，，，，ｐ’’ｃ－Ｐｂｘｌ５）Ｕ．４０在两个物种中全长均为２４７ｂｐ，对应着（转录方向为到３的第二’’５（５）ｎｃＲ个内含子，转录方向为３到比对图及示意图见图；根据ＩＮＡ分类原－－ＮＡｉ。贝ｊＵＣ．４０化心４０ｉｎｔｒｏｎｉｃｎｉｎＩｎｃＲ，的转录产物属ａｔｓｅｓｅ２２ 实验结果＊ＵＣ４（ｋｈｕｍａｎ？■ｉ？■＞■ＩＩ＞■ＨＩ１＞？？■Ｉ，？■？：ＷＪＢＳＫ３＞？ｒ＞？ｉＩＩＪ＞ａＫ＞ｔｌＪＭ４ｌｈ■＞■■？■■■■？？？ｔｕＲＷｊ２Ｍｅ３？＞？Ｊ—－－■？Ｉ？■？ｈ＊■ｔ＞＞＞ＩＩ４？ｊｕｎｉｗｉＩ４－Ｉ？ＯＪＭ２Ｓ２Ｓ９Ｉ—＊？ＩＩＩＩｉ｜｜■Ｊｆｗｍｉ？Ｉ■４■？ｔ？■￣■？＾＂Ｊ（ＵＵ３ｔ｜今ＭＩｊｗｕｓａ＂？■ｌ？—－＿—■．－化ＷＩ？＊４４４４Ｈ－，》ｕｃ４ｍｏｕ．０＾ｓｅＨ．■－－■■，＿■■■■■■■■ＩＩ￣？ｆｔ＇——＞？？（ＩＩ＞？Ｉｊｍｔｊｔ＞＂ＪＨ■＞■■＂■■ＩＩ？？■４？ＷＩ？ＩＩ，４、ＪＭＫ＂■＊■■一ＩＩ■？—１．■Ｉ■＇？■？＞１Ｉ■＇■？！？■＞■ＶＪｔＭＷＵＩｆ－■■■－■？？？■Ｉ■■．■ｉｉＴＭｉＩ？ｅｗｒｔｅｉ、ＡＰｂｘｌ＾ＶｍｏｕｓｅＢ＾ＵＣ－．４０目－５．、（图：ＵＣ４０在人小鼠基因组的位置比对图及示意图）１．３转录因子结合位点及相关转录因子的功能水平通过生物信息学预测４０－，查找到巧个在人及小鼠ＵＣ．片段中保守的，且与也脏胚胎发育密切相关的转录因子结合位点；（。（图６）位点Ｖ化１１？：和￥￥畑〇？０１＿＿位点Ｖ化扣（：能够与转录因子ＳＲＦ结合，ＳＲＦ在人ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＩＤ：Ｐ１１８３０（与＿屯、、脏发育的＾个方面有相关性：，如也脏环化，＆血管平滑肌细胞分化Ｗ及屯化纤维形成等方面。么小鼠（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＩＤ：Ｑ９ＪＭ７３）中也与心脏的分化与成熟相－。ＶＣＨＯＰ０１ＤＤＩＴ３ＤＤＩＴ－ｒｔ阻关位点￥能够与转录因子结合，３在人（ＳｗｉｓｓＰｏ：＿一、Ｐ３５６３８）与屯脏发育的个关键信号通路ｗｎｔ通路相关。在小鼠（ＳｗｉｓｓＰｒｏＵＤ；Ｐ３５６３９）中也有类似的研究报道。ＴｉｔｉＦｔｉｎｄｉｎ＞ｓＭＭＲＣｏｎｓｅｒｖＭｒａｎｓｃｒｐｏｎａｃｏｒＢｓＳｉｆｖＲＭ２ｅｉ＜Ｂ＿ｖ＜ＣＨ〇ｐｅｉＤＤ１Ｔ－３：＾＾ＨＶｉ〇ＣＴｌ９７＿＂，ＯＣＴＣ＿ｙｇｓＲＦｃＳＲ：！ＶＳＨＦＨ３＿０１ｗｏｃＴｉ＿＂ｂｂＨＢＢｂ３？Ｖ￥ＬＫＸ＿１图６：保守的巧录因子结合位点４０－综上所述，ＵＣ．在人和小鼠之间不仅具有序列保守性，还具有基因组位置保巧及相关转录因子保守的特性，Ｗ上均提示它们在不同物种中功能上的保守性。２动物实验—表达谱２１－．ｍｅｗ存在于胚胎也脏中７－，／４０，如图，ＰＣＲ产物电泳结果提示ｒ［Ｃ存在于发育中的屯脏中说明本ｕｃｗ－是可靠的１ｒｗ－２Ｐｂｘｌ文中通过该方法检测ｒ，图中各泳道分别代表：ｔ／ｃ，，－ＡＰＤＨ）３（ｓｔｒａｓｅｃ，ｎｄｐｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒ）Ｇ，４（ｒａｎｄｏｍｐｒｉｍ灯ＧＡＰＤＨ，５空白泳道６ＤＮＡｍａｒｋｅｒｏ２３ 东南大学硕±学位论文Ｌａｎｅ１２３４５６６００５００２００１００Ｈｍａｒｋｅｒ／ｂｐ－图７：拓胎必脏ＲＮＡ经ｑＲＴＰＣＲ后的电泳产物－２．．２Ｕｃ４０的表达量总体上低于Ｐｂｘｌ－如图８所示．Ｐｂｘｌ，ＵＣ４０在各个脏器，各个时间点的表达量均低于。－、２－．３Ｕｃ．４０的表达量具有时空特异性，Ｐｂｘｌ／ＴＸＫＷ在也脏化胎发育过程中呈现负相关－如图８Ａ：，从不同时间点来看在Ｅ０．５，ＵＣ．４０和Ｐｂｘｌ在也脏及脑中的表１－．０５）Ｅ１．５ｎｅｏ，ＵＣ．４０和Ｐｌ达量没有统计学差异（Ｐ＞０；在４及ｂｘ在五个脏器中的－．表达量有差别，且有统计学意义（ＰＯ．Ｏｌ）。上结果说明，ＵＣ４０在不同空间的表达量是有差异的。８Ｂ、－如图，从不同脏器来看：在小鼠也脏发育过程中，ＵＣ４０４ｎｅｏ．在Ｅ１．５和＜０ＵＣ－的表达有统计学差别（Ｐ．０５），呈下降趋势，随着．４０表达量的下降，Ｐｂｘｌ呈上升庭势（Ｅ１０．５与Ｅ１４．５及ｎｅｏ均有统计学差异，Ｐ＜００１），．说明前者可能对ＵＣ－后者有着负性调节作用，，尽管４０呈负相关；在脑中．的表达量在三个时间点（Ｐ＜０．０５），且化ｘｌＥ１０．５Ｅ１４．５（Ｐ＜０．０５）及Ｅ０．５ｎｅｏ有差异在与之间１与之间均有统计学差异（Ｐ＜０．０１），但并没有出现如私脏发育过程中的负性关系；在其他脏器，仅在肺中，Ｐｂｘｌ的表法量有差异（Ｐ＜０．０５）；此外由于时间点有－限，无法观察变化趋势的相关性ＵＣ．４０；Ｗ上结果说明了在不间时间点的表达量是有差异的，且在如脏中与Ｐｂｘｌ存在负性关系。Ｗ上表达谱结果不仅说明ＲＮＡ－－‘ｌｎｃｕｃ．４０的时空表达特异化还说明ｕｃ．４０／Ｐｂｘｌ与。脏发育有潜在关系。、图８ｃ为小鼠胚胎屯脏发育关键时间点的形态示意图。２４ 实验结巧ＡＢａｒｔｈｅ１０．５ｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌａｎｄｓｃａｐｅｎ＊〇．０－化１□ＵＣ－．４０ｎ；！，—＊ｂｘｉｏｓ－ｉＩａｍＰｌ．ｄ〇■■■：－０．０４ｎ＊ｏ’ＨＢ｝ＵＣ￣口．４０—Ｉ＾ｊ－０－．的１４，Ｌ■．Ｍ７Ｊ—化＂Ｉ１０－—ＨＢ．５ｄＩ｜｛－０．０２肝ＷＷ！胜１ｒＦ１，ＩＳ．１０．．．０．００化０．０２００３００４０的Ｉ＾＾９。。－１Ｔ円Ｉ闕ｌＩｉ—ｉＪｍｃ＾－．ｏｏＭ■ｂ。＊ｈｅａｒｔｂｒａｉｎｈｅａｒｔｂｒａｉｎ〇？〇＇１４５ｄｅｘｉｌ＊．ｐｒｅｓｓｏｎａｎｄｓｃａｐｅｔ－ＩＩ＂Ｍ—’＇ＯＷ口ＵＣ－．４０，，］＂Ｐｂｘ１－—肪化Ｈ＇３口０－．２０＂＇＇－１０．１５叶＇■Ｉ０．．ｍ．００．１０２０３－Ｂ０．１０－０—．０５Ｉ１■Ｂ薩＂…ｒ〇．〇〇Ｕ〇Ｐ顚甲圈覃々片ＶＶ＞Ｖ片Ｗ＞＾…。——………扣欠公去沪去＂Ｍ圓々９却－ＣＪｕＣｎｃｏｈ．似｜ｎｅｏ一瞧ｐｂｗｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌａｎｄｓｃａｐｅｉ＂。０．３ＵＣ．４０．０．００〇０．００２０．００４０．００６０．００８０，０１０］＊＊ｘａｍＰｂｉｉ１０－．２台■画ｐｕｌｍｏｎａｒｙ‘０－．１’ＩｌｉＩＩ＇■！ＩＩ□ｕｃ￣Ｉ…－４〇０￣￣－甲琴…。．－０了口Ｔ。ｎｒ甲準ｒ３乂於式４一八４兴－－ｐ＾５＾＾０．０口０前化１０化巧０．２００－２Ｓ＜—Ｌ：祕；巧—ｉ—己３ＩＴ２，｛。，―．扇嫂―——Ｔ．Ｊ＊．／ｒ＾在化ｆ／％＾＇＾。：＾播纷１：互＜１－Ｗ．Ｍ：０．？０．０２０．０４０，０＊０．０８０．１０岭图８：表达谱及也脏胚胎发育示意图２５ 东南大学硕七学位论文３细胞实验３１．过表达验证＇组细胞转染质粒后如图９，为巧光显微镜及普通光镜下两１２ｈ的照片，示两ｒａｎｄ－－沮的转染效率类似，；如图１０，利用ｓｔｓｐｅｃｉｆｉｃＲＴＰＣＲ法证明了质粒转染ｑｉｌｉＭｏｖｅｒ—ＭＵｃｏｎｔｒｏｌ图９：质粒转染１２ｈ后照片２６ 实验结果ＵＣ－．４０ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ０－０４ＬＵｏｖｅｒ］■ｃｏｎｔｒｏｌ＊＊Ｉ１０－．０３ｗｆ；ｒ瞧：巧国圍００－１．－１—０．００１ｏｖｅｒｃｏｎｔｒｏｌ图１０：过表达验证３－．２Ｕｃ４０．过表达导致Ｐｂｘｌ表达量减低如图１１Ａ，在ｍＲＮＡ水平，尽管在四个时间点，两组Ｐｂｘｌ的表达量均无明＞０．Ｍ）显差异（ｐ，但是在对照沮，Ｐｂｘｌ随着时间迁移有明显的上升趋势，在过－过表达阻碍了细胞分化过程中上升表达姐则无该趋势，说明ＵＣ４０．Ｐｂｘｌ的；图１１Ｂ所示的蛋白水平结果与ｍＲＮＡ水平类似。ＡＰｂｘｌＲＮＡＢＰｂｘｌＰｒｏｔｅｉｎ０－．０４１ＩＩ？？＾－ｏｖｅｒ？０．０３－纖ＭＪｆｃ麵Ｍ，ｖｅｒ＇…ｃｏｎｔｒｏｌｘ■Ｐｂｌ成巾。。了——占＇儀龙＾南一地＾９ｆｌＨｃｏｎｔｒｏｌＩｉ■＾－０．０２—－一一由■Ｈ■■ｏｖｅｒ醒■－ａ＂Ｐｉｎ－―一一ｗｍｍｌ－。．。１画１Ｉ■■關Ｄ（）！）６１…）ｌ〇Ｉ１１：ＩＩＩ０ｊＩ，１）０Ｄ６［）Ｓ１）Ｋ）ＰｌＰ图：ｂｘ１９１１在细胞诱导分化过程中的变化趋势３－．３Ｕｃ．仙过表达阻碍了Ｐ１９细胞向必肌样细胞分化ＧＡＴＡ４ＴｎＴＮＫ、２Ａｘ２．５如图１，Ｗ，ｃ，作为屯肌样细胞分化成功的标志物，２７ 东南大学硕±学位论文在ｍＲＮＡ水平：ＧＡＴＡ４在对照組有明显的上升趋势（ｐ＜０．０５），而在过表达组，ｃ－Ｄ，却没有明显的上升趋势；ＴｎＴ在过表达沮的Ｄ０８虽然有明显的上升趋势但是在Ｄ１０相对于对照组却出现了明显的下降（＜０．０５），提示诱导不完善．５ｐ；Ｎｋｘ２一中，两组没有显著性差异。图１２Ｂ蛋白水平的结果与上述致。ＡＣＮｋｘ２．５ｃＴｎＴＤ‘０００３！！？１，！Ｈｉ肌ｅｒ１户？Ｉ１＊－０－．０００８Ｉ１■ｃｏｎｔｒｏｌ下：：：：ＩＩ１１ｉｉｌ’ｊＩｊｌＩ．，ｌＪＤＯＤｆｔＤ８１）１０ＤＯＤ６Ｄ８Ｄ１０ＢＤＧ藤ｍｉＫ■…ｅｒ＂＇＂ｍｌ－０．００１０．！ＩＩｏｖｅｒｎ０ｎｎｎａ’？胃ＴＴＧＡＴＡ４ｃｏｎｔｒｏｌ０－丄．０００６■了０．０００４－ＩＩＩ〇、ｅｒ。口了…＇ｗｍｍｉ０－．０００２ｒＩＩ—届圓圈ｍＭ１１—〇．〇〇〇〇，，ｃｌｉｎ）〇６【ＤＤＳＤ，０Ｍ—側＂〇，ＤＯＤ（，Ｌ）８Ｄ］０图１２：细胞诱导过程中标志基因的变化趋势３．４过表达使Ｐ１９细胞发生细胞周期阻滞，进而阻碍了细胞増殖细胞増殖的检测采用了流式细胞仪检测细胞周期及ＣＣＫ８法检测细胞増殖活性３Ａ），饥饿处理后的细胞在细胞周期期别同步化。在细胞周期检测中（图１后，于回复血清４８ｈ后的检测显示，Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期的细胞在过表达组均显著多于对照组的细胞（ｐＯ．Ｏｌ，ｐ＜０．０５），提示处于ＤＮＡ复制期及分裂前期的细胞较对照组多，王。然而在ＣＣＫ８检测中（图１３Ｂ）次实验重复均提示对照组的细施，于Ｏ较过表达组增殖活性最强检测第Ｈ天及第四天有显著性差异（ｐ．０５，＜０。ｐ．０１）这竖结果提示我们过表达组的细胞虽然更多的处于ＤＮＡ复制期及分裂，，进而导致增殖活性的下降前期但可能发生了细胞周期阻滞。２８ 实验结果ＡＯｈ２４ｈ－与＊１＇。ｔｒｌ＂圆量？樹Ｍ－－兰宣ＷＢｍｎＬ；，論…ＳＳ－心Ｉｇ§．．．０．５．５門Ｅ３Ｓ言ｍｓ＾＂，Ｉ■ｆ：－？ｙ納輪－？，＂■，，刪！！Ｉ刷化■—■；ｉｒ—￣￣Ｊ＿ｊＬ口。口Ｇｉ１ｉＩ０—ｊ．０ｎ＾，＾ｏｖｅｒｃｏｎｔｒｏｌｏｖｅｒｃｏｎｔｒｏｌＷｈＢＣＣＫ８ａｃｔｉｖｉｔｙ－Ｇ２／Ｍ１５００．＇、■■＊＇ＨＢＨｏｖｅｒ＊＊ｉＷ｜ｕｏｉ—－１０００＋ｃｏｎ沁！Ｉ厂ｊ．ＰＯ咖．口。．ＬＪ－．－．－Ｉ＿＿＿＿＿０．０ｏＵ，，．ｖｔｄ１ｄ２ｄ３ｄ４ｏｅｒｃｏｎｒｏｌ图１３：细胞増殖检测：细胞周期及ＣＣＫ８３．５过表达使Ｐ１９细胞易于发生细胞调亡ａ－化饿诱导细胞调亡后，在流式细胞仪检测细胞调亡（图１４Ａ，Ｂ）及Ｃａｓｐｓｅ３（图１４Ｃ）检测中，均提示过表达沮较对照组更易发生调亡（，＜０．０５，ｐ＜０．０／），。说明过表达组的细胞对于饥饿等外界刺激更敏感，代偿机制不及对照组的细胞２９ 东南大学硕±学位论文——＞—￣—１１ｒｎ１ｒｎ１１ｉｉｉｒｎｉｉ：ｉＥＺ］産ｎ產１〇，４Ｏ，４１４０１２４，＊０１０ｊ１０１０００１０１０１０１共１卢１Ｋ１沪如１护１１占１典１１〇１０１（Ｊ１片１〇１茄１声１片－－ＡＶ６４７Ｍ＾７ＡＶ－６４７ＡＶ－６４７ＡＶＷ２ｏｖｅｒＳＡｏｖｅｒ１ｏｖｅｒｒ３ｏｖｅｒ４ｏｖｅ＇Ｓ＇１１１１！ＩｊＩＩＩ］ＩＩＩ５ｓ１，；＾＿＿＿；＿．过Ｌ—．ｉ，…ｔｉＷＩ獨拉…」ＷＪ释罚４？＾２？＾？＾＾？＾°＾２＾＾＾＾？＊？ｉ１０１０ｉ〇ｔｏ０１０１０１０１０１０１１０ｉ〇１０１０ｉｉ１０ｉ（ｉ＜ｒｉｏｉｏｉｏｉ（ｒ〇ｉ（Ｔ１０ｒｒＡＶ－６４７ＡＶ＊６４７ＡＶ－６４７ＡＶ－６４７ＡＶ－６４７ｃｏｎｔｒｏｌ１ｃｏｎｔｒｏｌ！ｃｏｎｔｒｏＢｃｏｎｔｒｏｌ＊ｃＯＱｔｆＯｌＳ－ＢＡｏｔｏｓｉｓＣＣａｓｐａｓｅ３ａｃｔｉｖｉｔｙｐｐ￣巧ｎ３０〇＇ｏｖｅｒ］＊ｉ｜＾＇＝－２０－：■ｃｏｎｔｒｏｌｒｆ＾，，劝〇■＂下ＡＡ’ｉＬｆｉｌＱｌｏｖｅｒｃｏｎｔｒｏｌｓｔａｒｖａｔｉｏｎｎｏｒｍａｌ图１４细胞调ｔ：３０ 讨论第四章讨论ｉｎ／ｃ４０－存在，且不具有翻译成蛋白质的能力－－ｄｓｉｆｉ－本文通过ｓｔｒａｎｃＰＣＲ的方法，证明了．生ｐｅｃｑＲＴＵＣ．４０能够参与转录Ａ７Ｉ／ＣＷ－－－成ＲＮ。虽然ＵＣ．４０所在编码基因的全长及巧７ＣＷ（目前己知序列的长度是２４７ｎｔ）的全长尚不清楚，但是作为高保守区域，它们的功能想必是核也－ｎｃ的，／，。ＣＰＣ分析提示７ＩＣＷ不具有翻译出蛋白质的能力因此它符合ＩＲＮＡ的定义。４＾１自２００４年ＵＣＥｓ数据库被发现后，很多学者围绕这个主题展开了研究１一２００７－年，Ｃａｌｉｎ等的篇文章提出了ＴＵＣＲｓ的概念，首先，他们将ＵＣＥｓ扩大到ＵＣＲｓ，其中增添了许多保守的能够编码ｍｉＲＮＡ的基因组片段，然后将这些片段进行生物信息学分析，发现其中的绝大多数都能发生转录，因此就有了Ｔ－ＵＣＲｓ的定义，在该文中，有１６条在白血病及癌症组织中差异表达的ＵＣＥｓＷＷ被筛选出来。Ｗａｔｔｅｒｓ等的研巧中，ＴＴ／ＣｊＯＭ被证明与神经巧细胞瘤的侵袭性４９１１－－化这个超保守区域中转录生成的ｎ它能反过来参有关。在Ｄｌｘ５ｃＲＮＡ仍／２，Ｐ０１－化增强子的转录活化即发挥了上文提及的与増强Ｄｌｘ５ｅｌｎｃＲＮＡ的作用。与１５肝癌相关的ｒ１１ｃ／ｃ＾ｓ，能够导致人及小鼠的肝癌细胞增殖加快。上例子均表－且作为ｎｃＲＮＡ能发挥诸多功能明，ＴＵＣＲｓ是广泛存在的。，２ＵＣ－．４０在物种之间有突出的保守性，提示功能的保守性如上述Ｕ－，Ｃ．４０在核巧酸序列、基因组位置、转录因子结合位点Ｈ个水平都表现出保守性。Ｋａｔｚｍａｎ等的研巧证明，通过计算衍生的新基因频率（ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｗａｌｌｅｌｅｆｒｅｕｅｎｃ，ＤＡＦ）来推断基因组片段经历了多大强度的自然选择发现，遗ｑｙ传对ＵＣＥｓ的选择力相对于虽白编码区域更强，而ＵＣＥｓ区仍然保持保守，提示ｎ其功能的重要性ｉｉ。既往有研究表明，用ＵＣＥｓ构建进化树，进而推断出的物种的演化关系，可信度较高因此本文中利用核巧酸序列多重比对后构建的进化树关系，不仅Ｃ－说明了Ｕ．４０在物种之间保守性较高，还可Ｗ提示物种的进化关系。众所周知，分析蛋白编码基因的序列保守性有助于推断其功能。例如对Ｐ５３Ｐ一基因家族Ｐ５３／Ｐ６３／７３的进化分析发现，该基因家族在亿年的进化中基本保持５４了结构和功能的保守性［，在高级动物中还演化出了更多其他的功能１但是序列保守性分析在ＩｎｃＲＮＡ领域的应用却频频受阻。两个典型的例子是，Ｍａｔｏｆ／序列在人、小鼠和斑马鱼中呈现高度保守，但是在小鼠中Ｍａ／ＷＪ敲除证ｆ明其与人的功能迴异；尽管小鼠和人的ｉｆｏｔｏｒ序列及编码基因结构的保守性均〇？很差１＞，但是功能学却证实两个物种中月化的功能有很大的相似度。这两个例子说明，仅通过序列是否保守（进化树）来推断功能是否保守在ＩｎｃＲＮＡ领域？是片面的，那么，ＩｎｃＲＮＡ在物种间是否有験系？是怎样联系起来的呢在最新有关ｎｃＲＮＡ的研巧中，将ｎｃＲＮＡ的保守性扩展到序列，结构，功３１ 东南大学硕±学枉论文能Ｗ及共线性表达四个水平，说明对于ｎｃＲＮＡ保守性的判断，不能仅局限在核５５［］巧酸水平。上述ＵＣ－－．４０生物信息学分析发现，ＵＣ．４０在人及小鼠的基因组中位置相同。其他ＩｎｃＲＮＡ物种间的位置保守性也有报道：ＳｗａｒａＢａｓｕ等的文章中，利用小ｊ一鼠的，ＩｎｃＲＮＡ基因组表达谱在鱼中找到了相应的基因狙保守区域，进步分析ｓｔｙ发现，这些保守区域周围的蛋白编码基因在ＧＯ分析中呈现出相似的作用。与一ｎ－ＡＫ１，互为反义的对之类似的是ＩｃＲＮＡＰｌｄｉ５８８１０在进化上出现于哺乳动物一一这分支中，并且这基因区域（包括其两端的基因片段）在哺乳动物当中是保５７守的［１。因，暗示着种属间此相同的基因姐位置ＩｎｃＲＮＡ可能发挥类似的作用。关于转录因子结合位点的保守性，笔者利用关键词检索，尚未找到相关文献，由于转录因子结合位点存在正义链，、反义链的差异故而这部分内容需要更多研究来证实。除此之外，二级结构在ｎｃＲＮＡ中常作为功能域存在，除了人们熟知的ｍｉＲＮＡ的茎环结构，ＩｎｃＲＮＡ的二级结构也是发挥功能的基础。例如Ｘｉｓｔ中的ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔＡｒｅＡ结构，通社招募ＰＲＣ２，使染色体构象发生转变，从而导致染色（ｐ）体失活，通过ＲＮＡ二级结构算法，科学家证明了这个ｒｅｐＡ结构域在物种间是５８１１高度保守的７Ｉ／ＣＷ－。由于的全长尚未确定，故而二级结构的分析尚不能实施。综上所述－，ＴＵＣＲ在物种么间的俱守性不可Ｗ随意推断，需要功能学实验来证明。３化－．４０的表达具有时空特异性一大量研巧表明，时空特异性表达是ｃＲＮＡ，Ｉｎ的基本特征之几个经典的例子是：最早被发现与也脏巧胎发育相关的ＩｎｃＲＮＡＦｅｎｄｒｒ，它特异性表达于中胚ＰＳ一层侧页，这部分细胞而后发育为小鼠的体壁和也脏等组织器官；另个与病３８理性也肌肥大相关的ＲＮＡＭ［］Ｉｎｃｊ灯，其表达谱证明了它時异性地表达于也脏；一另外个高度保守的，与胚胎干细胞多能性及神经系统发育相关的ＩｎｃＲＮＡ５９［］２ＴＷ儿它在干细胞发育早期及脑、脊柱中是高度富集的。Ｗ上的例子表明，ＩｎｃＲＮＡ的时空特性，对其功能有很强的提示作用。－达两个时间点，ＵＣ．４０表达量最髙的是脑，在Ｅ１４，然而在本研巧中．５及ｎｅｏ‘、－－巳脏中ＵＣ‘．４０的表达量在五种脏器中只排在第四位，因此ＵＣ．４０并不是在。脏中－－，，且仅凭ＵＣ特异性表达的但ＵＣ．４０在脏器中的表达的确是存在时空特异性的．４０不是也脏特异性的ＩｎｃＲＮＡ，也不能否定其可能的功能。－由于本研巧只是探索性的，芯片结果中还有许多其他ＴＵＣＲｓ，因此关于也脏胚胎发育相关的ＵＣＥｓ的研巧，需要逐个去探索，Ｗ求找到相关性最髙的ＵＣＥ。－本文聚焦的，是ＵＣ４０．在必脏胚胎发育中可能发挥的作用。、４在胚Ｐｂｘｌ呈ＵＣ－胎屯化发育过程中现上升趋势．４０的表达，量与其呈负相关一在篇阐述ａｎｔｉｓｅｎｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｉｉ的文章中，提到了ＳＡＳａｉｒｓ转录本表达量ｐ３２ 讨论之间变化多端的相关性Ｗ，有些ＳＡＳａｉｒｓ之间并没有明显的相关性。ｐ－０Ａａ在既往研巧中，提示两者呈正相关的有：／ＦＷ；Ｓ（白介素１的反义长一－ａ链非编码ＲＮＡ），它能够竞争性与ＩＦＮ１ｍＲＮＡ的二级结构中的段单链区域结合－ａ，使其稳定性増加，増加ＩＦＮｌｍＲＮＡ的出核转运，从而发挥正性作用；与之相仿的还有与胃癌相关的基因ＷＤＲ８３及其ａｎｔｉｓｅｎｓｅＩｎｃＲＮＡ饼化Ｓ，两者通过复合物形成，増加了各自的稳定性，从而发挥双向的正性调节作用，相似的作Ｗ１用方式不仅在胃癌中存在，还在其他很多肿瘤中存在。ＳＡＳａｉｒｓ呈负相关的有：ＰＵ／＾与ＰＵ．１形成复合物，阻碍ＰＵ．１的翻译，ｐ－－导致脂肪生成増多与ｔｉｅ１两者形成复合物，导致ｔｉｅ１降解，从而６导致血管内皮细胞生成障碍Ｉ３，发挥了负性作用。除了上述通过形成ＳＡＳ复合物后发挥的作用，ａｎｔｉｓｅｎｓｅＩｎｃＲＮＡ还可＾＾通过－－其他途径发挥负性调控作用，例如白介素化１６（正１目）的ａｎｔｉｓｅｎｓｅｌｎｃＲＮＡａｎｄ－化公能够通过减少前者启动子区域的Ｈ３Ｋ４Ｈ甲基化水平（转录活跃基因－的标志），来改变忙１Ｐ启动子的染色体结构，从而减少ＲＮＡｐｏｌｙｌｌ的结合，减ｗｔｉ－少正ｌｅ的生成，发挥负向调控作用。综上所述，通过研巧ＳＡＳ表达量变化的相关性，来探究它们的巧互作用趋ｂｘ－势及作用方式在ＩｎｃＲＮＡ的研巧中是十分重要的。本文的研巧对象Ｐｌ／７Ｔ／ＣＷ就可能呈现负性关系。５化－．４０在Ｐ１９细胞中过表达导致化ＸＩ失去上升趋势ｘｌ如实验结果所述：Ｐｂ在小鼠胚胎必脏发育过程中呈现上升趋势；而在细－胞水平，ＵＣｘｌ，巧．４０过表达能够使Ｐｂ的上升趋势消失。如综述中所述ＸＩ已经被证明与胚胎发育密切相关，包括肾上腺，肢体，骨骼系统，牌脏，甲状腺，泌ｔＷ、，尿生殖系统胚胎造血等等。其中，它与屯脏大血管的胚胎发育也被广泛证一－实。ＣｈｉｎｇＰｉｎＣｈａｎｇ这个团队直致力于该方向的研巧，在动物实验水平，将Ｐｂｘｌ敲除会导致异常的大血管生成Ｉ缘于咽聘弓尾部血管分支形成障碍，还会６２６３导致也脏流出道分隔形成障碍，３，其中包括ＶＳ扣。除了Ｐｂｘｌ，Ｐｂｘ家族也被证明与屯、脏胚胎发育相关，且与之相关的Ｍｅｉｓｌ能够编码Ｐｂｘ家族与ＤＮＡ结合的伴侣蛋白，其敲除能够模拟Ｐｂｘ家族失效发挥的作用－结合本实验结果及相关研究，我们推断，ＵＣ．４０过表达导致必肌细胞增殖、一ｂｘ一分化障碍的个可能机制就是阻碍了Ｐｌ的表么其机制还需要进步探讨。６－ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＩｎｃＲＮＡ的作用方式及Ｐｂｘｌ／ｒｔ／Ｃ４０相互作用方式的猜测关于ａｎｔｉｓｅｎｓｅＩｎｃＲＮＡ的作用方式，在讨论的第四部分己有较多叙述，但上一ＳＡＳ部分的讲述主要集中在复合物的形成上，最新越来越多的研巧证明，ａｎｔｉｓｅｎｓｅＩｎｃＲＮＡ还能在染色体水平通过表观遗传的手段发挥诸多作用，且不仅仅局限于顺式作用，还有影响远处基因表达的反式作用，下面举例详述。ＤＨＲＳ４和ＤＨＲＳ化２、ＤＨＲＳ化１是在进化过程中通过基因复制产生的三个５７－ｔｉｓＩＮＡ同源基因０掛泌／是０１１艮５４基因的，它同时具有顺式和。＾ａｎｅｎｓｅｎｃＲ３３ 东南大学硕±学位论文反式作用，其发挥顺式作用的原理是将ＤＨＲＳ４去Ｈ３乙醜化，去Ｈ３Ｋ４甲基化；，Ｈ３Ｋ２７特异的组蛋白甲基转移酶Ｇ９ａ而其发挥反式作用的原理是与Ｈ３Ｋ９、ＥＺＨ２Ｃ一（ＰＲ２的部分）相互作用，定标于下游的两个基因：ＤＨＲＳ４Ｌ２和ＤＨＲＳ４Ｌ１，导致局部的抑制性的Ｈ３Ｋ９ｍｅ２和阻Ｋ２７ｍｅ３狙蛋白修饰形成，从而影响同源性的ＤＨＲＳ４Ｌ２，ＤＨＲＳ化１的表达。这个例子很好的从顺式、反式两个方面阐述了ａｎｔｉｓｅｎｓｅＩｎｃＲＮＡ通过表观遗传的手段，影响姐蛋白修饰而改变染ｔｎｉ色质的活性状态，进而调控相关基因的表达。２一相似的作用机制还见于仿沪，它是转录自Ｄ５化ａｎｉｓｌｘ保守区域的个ｔｅｎｓｅＩｎｃＲＮＡ，它通过招募ＤＬＸ和甲基化ＣｐＣ岛结合蛋白２（ＭＥＣＰ２），作用于０１ｘ５ＰＷ的增强子区域，发挥负性调控作用。综上所述，可Ｗ发挥于转录前，ａｎｔｉｓｅｎｓｅＩｎｃＲＮＡ的作用方式有顺式、反式（染色质）｜转录中及转录后（复合物形成）等水平，作用方式多样。一－在本研究中，我们证明了７Ｉ／ＣＷ对Ｐｂｘ，ｌ发挥了负性调控作用作为个探一一索性研巧，该仅仅提出了个可能的结论，还缺乏进步机制方面的探讨。由于ｂｘＲＮＡ失去应有的上升趋势－细胞实验证明过表达使Ｐｌｍ，因此我们推测７Ｉ／ＣＷ在转录前和／或转录水平发挥了负性调控作用。７过表达导致心肌细施分化能力减弱如结果所述，也肌细胞标志性基因ＧＡＴＡ４及ｃＴｎＴ在过表达组中没有上升趋势或在诱导尾声出现下降－，说明过表达导致分化障碍，这提示过表达ＵＣ．４０的必肌干细胞分化为必肌细胞的能力减弱。我们推测，这种分化能力的减弱，可ｂｘｌ－能是缘于Ｐ受到过表达的影响，进而产生的连锁效应，也可能是７Ｉ／Ｃ４０直接发挥的反式作用Ｉ４。在本文选择的Ｈ个标志性基因中ＧＡＴＡ在过表达姐中的变，而巧合的是化最为明显，ＧＡＴＡ４在屯脏化胎发育过程中的地位也是核也性的。在流行病学水平一，曾有学者证明，在个ＣＨＤ家系中，患者均有ＧＡＴＡ４的变异，而健康者均没有，提示了ＧＡＴＡ４与家族遗传性的ＣＨＤ相关还有、研究证明，在小鼠，ＧＡＴ４的杂合突变和房缺Ａ、室缺、也内膜垫缺损、右也室、肌病有关发育不良和屯；在人ＧＡＴＡ４变异的患者中，改变Ｗ和必内膜垫缺损，房缺还有右也室发育不良有关，，同时这些变异在正常对照人群中没有发现，提ｓｔｗＰ１９、示运些变异与疾病有关。在细胞模型中，抑制ＧＡＴＡ４能够阻碍屯肌细胞、的分化，而ＧＡＴＡ４的过表达加速也肌细胞的分化，使得诱导成功的跳动的屯肌细胞，数目増加了十倍在动物实验水平，除了上述证明ＧＡＴＡ４的变异与一、系列ＣＨＤ的表型相关外，ＧＡＴＡ４在生后对于维持也脏功能也有很强的作用，其在必肌肥大及负荷所致的也衰过程中有保护作用综上所述，ＧＡＴＡ４在巧胎也脏发育，、乃至生后必脏功能方面都起到了至关重要的作用。在本研巧中－，Ｈ次Ｗ上的生物学实验证明，过表达ＵＣ．４０的Ｐ１９细胞在诱导分化为也肌细胞的过程中，在ＲＮＡ和蛋白水平，ＧＡＴＡ４没有出现明显的上升－趋势，提示诱导失败，提示ＵＣ．４０过表达在必肌细跑分化中的负作用。３４ 讨论８过表达导致细胞周期阻滞，阻碍细胞增殖－在上述的实验结果中己经叙述到，ＵＣ．４０过表达可能导致细胞周期阻滞，进而影响了细胞増殖。－与本文的发现类似的是，ＵＣＲｓ的ｒｃ／ｃｊ站同样为Ｔ，被证明与人和小鼠肝癌细胞的増殖相关，其敲除实验与Ｇ１／Ｓ期阻滞有关，从而导致癌症细胞生长延？ｔＷｎ缓。与许多类型肿瘤相关的ＩｃＲＮＡ片ｏｔｅｚＶ，在神经胶质瘤中能促进姐胞周期’７３ｆ１进程，２５作用域（ＥＺＨ２）结合而加快细胞增殖通过与ＰＲＣ复合物的。线粒体相关的ＩｎｃＲＮＡ与细胞周期阻滞Ｇ２／Ｍ期阻滞有关，机制尚未ＰＷ完全证实。细胞周期是通过许多Ｃｙｃｌｉｎ家族蛋白及相关蛋白进行调控的，例如Ｇ１／Ｓ调－控点的关键蛋白是ＣｙｃｌｉｎＤ和Ｅ，Ｇ２／Ｍ调控点的关键蛋白是Ｃｙｃｌ础。Ｕｃ．４０一具体影响了那个期别的阻滞，还需要进步相关蛋白的检测来进行证明。９过表达导致细胞易于发生饥饿诱导的调亡－本文实验证明，ＵＣ．４０过表达的Ｐ１９细胞，更易发生调亡。既往研巧证实，有许多ＩｎｃＲＮＡ通过影响调亡进程，从而发挥功能。例如ＩｎｃＲＮＡＣＡＲＸ（ｃａｒｄｉａｃ－Ａ）－ａｏｔｏｓｉｓｒｅｌａｔｅｄ，被证明能够通过与ｍｉＲ５３９ｐｐＩｎｃＲＮＷ及ＰＨＢ２相互作用，而ｍＲ－减少线粒体调亡Ｉ其发挥作用的机制在于作为ｉ５３９的ｓｐｏｎｅ，减少了ｇ－－ｍｉＲ５３９的作用，ｍｉＲ５３９的祀标是ＰＨＢ２，它能够抑制线粒体的裂变和调亡，口５ｌ－因此心ｉ化通过影响ｍｉＲ５３９的表达量，从而对线粒体调亡发挥作用，ＬｎｃＲＮＡ－ｆ心ＭＸ４皮－，通过与ＲＮＡ结合蛋白ＮＦＹＡ作化影响了Ｂｃｌ２的表达，从而影响７６］了非小细胞肺癌细胞的表边。王的￡况心■（ｌｏｎｉｉ，＜２／ｇｎｔｅｒｇｅｎｉｃｎｏｎｃｏｄｎｇＲＮＡ２１）ｈｎ－被证明与ＲＮＡ结合蛋白ＲＮＰＫ相互作用，影响其在细胞内的定位，影响了７７［１５３。上例证证明ＲＮＡ能够通过与ｍｉＲＮＡ、蛋白等结ｐ介导的细胞调亡，Ｉｎｃ合，而发挥对细胞调亡的调节作用，也即是ＩｎｃＲＮＡ通过这些媒介，与细胞调亡的信号通路发生联系，从而发挥了作用。一本文中ＵＣ－．４０是通过何种机制，而影响了细胞洞亡，尚需进步实验验证。３５ 东南大学硕±学位论文第五章结论Ｕ－－１ｃ．４０序列参与编码了ＩｎｃＲＮＡ７Ｔ／ＣＷ；２ＬｎｃＫＮＡ几Ｏ０－在小鼠胚胎发育过程中有时空恃异性表达，在胚也发育中与其ｓｅｎｓｅ基因Ｐｂｘｌ的表达呈反向趋势，Ｐｂｘｌ在胚也成熟过程中呈现上升趋势；３ＬｎｃＲＮＡ巧７ＣＷ－过表达导致Ｐ１９细胞诱导分化过程中Ｐｂｘｌ的上升趋势消失；４过表达导致也肌细胞诱导效率降低；５过表达使Ｐ１９细胞増殖减慢（可能细胞周期阻滞有关），且容易发生调亡；－－６ｒＵＣＷ．在小鼠必肌细胞模型中发挥了负性作用，结合其编码片段ＵＣ４０在人－和小鼠之间多水平的保守性，我们推断ｒＵＣＷ可能与人胚胎也脏发育及ＶＳＤ（ＣＨＤ）的形成有关。３６ 问题与展望第六章问题与展望－ｉｒＡＣＥ实验来明－ｕｃｗ的全长尚未确定，需要后续行Ｒ确其序列；７Ｔ７ＣＷ编码，需要分子克隆等方法来实现基因的全长尚未确定；２本／ｃｗ－ｂｘｉ文虽证明了ｒｃ对Ｐ存在负性调控作用，但是其相互作用机制有待进一一－步明确：ＳＡＳ／需探巧是否有复合物形成进而发挥作用，并进步研究３ＴＣＷ与基因Ｐｂｘｌ的启动子、增强子、抑制子等调控序列是否存在表观遗传水平的相一互作用且需要敲低或敲除实验来从另－；个角度验证ＵＣ．４０的作用；３本文在细胞水平证明了ＵＣ４０－．过表达能够对小鼠也肌细胞的増殖、分化发挥负性作用，并促进调亡发生，但是在在体水平是否具有类似作用尚有待动物实验进一步证明；４本文在核巧酸序列－，基因组位置及相关转录因子等水平证明了ＵＣ．４０在人和小－鼠之间的保守性，但是其功能的保守性，即ＵＣ．４０在人胚胎也脏发育过程中的作一用，尚有待进步验证。３７ 东南大学硕±学位论文参考文献Ｄ－．Ｍ．ＡｎｄｅｒｓｏｎＫ．Ｍ．ＡｎｄｅｒｓｏｎＲＢａｓｓｅｌｄｕｂＥ．Ｎ．ＯｌＪ．Ｒ．Ｍｅ細ａｌｌ，．，ｓｏｎ，ｙ，川，ｙ＂Ｊ－ＰＬ民．ｌ．ＫａｓａｒａｇｏｄＪ．Ｍ．Ｓｈｅｌｔｏｎ．ｉｏｕ．ＢａｓｓｄｄｕｂａｎｄＥ．ＮＯｓｏｎＡ，，，ｙ，，Ｍｉ灯ｏｐｅｐｔｉｄｅＥｎｃｏｄｅｄｂａＰｕｔａｔｉｖｅＬｏｎＮｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡＲｅｕｌａｔｅｓＭｕ化ｌｅｙｇｇｇＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＡｒｔｉｃｌｅＡＭｉｃｒｏｐｅｐｔｉｄｅＥｎｃｏｄｅｄｂｙａＰｕｔａｔｉｖｅＬｏｎｇＮｏｎｃｏｄｉｎｇ，，ＲＮＡＲｅｌｔＭｌＰｒｆｒＣ／／１－１２２０１５ｕａｅｓｕｓｃｅｅｏｅ．ｇｍａｎｃｅ，，ｐｐ．，＂［２］Ｊ．Ｔ．Ｙ．Ｋｕｎｇ，Ｄ．Ｃｏｌｏｇｎｏｒｉ，ａｎｄＪ．Ｔ．Ｌｅｅ，ＬｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓ：Ｐａｓｔ，’，ｒｅｓｅ打ｔａｎｄｅｖｏＬ－２０ｆｔｉｔｕｒ〇６巧６船１９３ｎｏ．３．．６５１６６９１３．ｐ，，，，ｐｐ，ＧｔｔＩＡｉｔＭＧａｒｂｒＣＦｈＭＦＬｉＤＦｌｄＭＨｔ口．ｕｍａｎ．ｍ．ｅ．ｒｅｎｃ．．ｎ．ｅｓｅｒ－ｕａｒｅ］Ｍ，，，，＾，，Ｏ．ＺｕｋＢ．Ｗ．ＣａｒｅＪ．Ｐ．ＣａｓｓａｄＭ．Ｎ．ＣａＷｌｉ民．ＪａｅｎｉｓｃｈＴ．义Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，ｙ，ｙ，，，，Ｔ．Ｊａｃｋｓ，Ｎ．Ｈａｃｏｈｅｎ，Ｂ．Ｅ？目ｅｍｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｋｅｌｌｉｓ，Ａ．Ｒｅｇｅｖ，Ｊ．Ｌ．Ｒｉｎｎ，ａｎｄＥ．＂Ｓｄｈｉｎｉｎａｕｒｈｉｈｌ．ＬａｎｅｒＣｒｏｍａｔｓｔｅＫｖｅａｌｓｏｖ巧ａｔｈｏｕｓａｎｄｃｏｎｓｅｒｖｅｄ，ｇｇｙ＇－ｌａｒｅｎｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡｓｉｎｍａｍｍａｓａｕｒｅｖｏｎｏ．ｌ．／Ｎｔｌ．４５８．７２３５ｇｇ，，，ｐｐ２２３－２２７２００义，［４］Ｓ．Ｋａｔａｙａｍａ，Ｙ．Ｔｏｍａｒｕ，Ｔ．Ｋａｓｕｋａｗａ，Ｋ．Ｗａｋｉ，Ｍ．Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｃ．Ｃ．Ｙａｐ，Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｊ，Ｋａｗａｉ，Ｈ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｐ．Ｃａｍｉｎｃｉ，Ｙ．Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ，Ｃ．Ｗｅｌｌｓ，Ｍ．Ｆｒｉｔｈ，Ｔ．Ｒａｖａｓｉ，Ｋ．Ｃ．Ｐａｎｇ，Ｊ．Ｈａｌｌｉｎａｎ，Ｊ．Ｍａｔｔｉｃｋ，Ｄｕｍｚｕｎｏａ．ａＨｅＬ．ＬｉｏｖｉｃｈＳ．ＢａｔａｌｏｖＰ．Ｇ．ＥｎｓｔｒｏｍＹ．ＭｉＭ．ａＦｈｉｈｉ，ｐ，，ｇ，，ｇ，ａｎ－ＬＬａｎｄＳａｎｄｅｌｉａＭ．ＣｈａｌｋＳ．ＭｏｔｔａｕｉＴａｂａｒＺ．ｉａｎＢ．ｅｎｈａｒｄＣ．，，ｇ，ｇ，，＂Ａ’’Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ，ｎｔｉｓｅｎｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎ化ｅｍａｍｍａｌｉａｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ．，ｉＳＷｅｗｃｅｌ３０９５．１％Ｓ２００５，ｖｏ．ｎｏ．７４０４＾．．，，，ｐｐ巧ｏｎＫ．Ｗ．ＫｉｎｚｌｅｒＣ．Ｂ．ＴｈｏｍｓＳ．ａｃｈｈａＫ．ＩＣ．ＳｉｎｈＩ．Ｔ．Ｍｔｈ民？Ｓ．口］Ｋ，ｐ，ｐ，ｇ，ａｇｒａ，ＢａｌａｂａｎＬ．ａＤｏｎｅｈｏｗｅｒＫ．ＩｓｈｉｈａｒａＫ．ＴａｎａｋａＫ．ＩｎｏｕｅＴ．ＦｕｓｈｉｋｉＨ．，，，，，，ＨｏｕｓｔｋｏｖＯｊＨ．Ｈａｎｓｉｋｏｖａ＾Ｊ．Ｚｅｍａｎ，Ｊ．Ｈｏｕｓｔｅｋ，Ｄ．Ｌａｎｅ，汪Ｊ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｃ．Ｒａｇｏ，Ｃ．Ｌｅｎｇａｕｅｒ，Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｚ．Ｆｅｎｇ，Ｔ．Ｗ．Ｍａｋ，Ｈ．Ｙｏｕ，Ｓ．Ｊｉｎ，Ｓ，Ｐ．Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｃ．Ｃ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｃ．ＰｒｉｖｅｓＬ．ＧｕａｒｅｎｔｅＳ．ＮｅｍｏｔｏＴ．ＦｉｎｋｅｌＯ．ＳｔｅｈａｎＨ．Ｄ．，，，，ｐ，＂Ｏｓｉｅｗａｃｚ，Ｃ．Ｍｃｌｅｏｄ，Ｉ．Ｐａｇｅｌ，Ｍ．Ｎ．Ｓａｃｋ，Ｎ．邱ｓｔｅｉｎ，ａｎｄＮ．Ｈｅａｒｔ，ＴｈｅＸｉｓｔＲＮＡＧｅｎｅＥｖｏｌｖｅｄｉｎＥｕｔｈｅｒｉａｎｓｂＰｓｅｕｄｏｅｎｉｚａｔｉｏｎｏｆａｙｇ＇－－－Ｐｒｏｔ，．．Ｊｕｎｅ１６５１ｅｉｎＣｏｄｉｎＧｅｎｅ／Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０ｎｏ．３６５５２００６．ｇ，，，）ｐｐ３８ 参考文献＂Ｊ－ｍ６．Ｂ．ＨｅｏａｎｄＳ．ＳｕｎＶｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎｅｄｉａｔｅｄｅｉｅｎｅｔｉｃｓｉｌｅｎｃｉｎｂａｌｏｎ［］ｇ，ｐｇｇｙｇ’’ｎ－ｉｎｔｒｏｉｃｎｏｎｃｏ逝ｎＲＮＡ．ＳＷｅｍｒｅ，ｖｏｌ．３３１，ｎｏ．６０１３，．７６７９，２〇｝ｌ．ｇ，ｐｐ＂７Ｓ－ｉｉｈｉｆｄＬｏｎ．ＯｕｎｚａｎａｎｄＴ．ＰｅｄｒａｚｚｉｎＴｅＰｒｏｍ巧ｏＥｎｈａｎｃｅｒＡｓｓｏｃｉａｔｅ［］：ｇｄ＇ＮｏｎｃｏｉｎｇＲｎａｓｉｎＣａｒｄｉａｃＲｅｅｎｅｒａｔｉｏｎ／ＴｒｅｎｄｓＣａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ２０１５．，ｇ阿Ｓ．Ｏｕｎｚａｉｎ，Ｉ．Ｐｅｚｚｕｔｏ，Ｒ．Ｍｉｃｈｅｌｅｔｔｉ，Ｆ．Ｂｕｒｄｅｔ，Ｒ．Ｓｈｅｔａ，ＭＮｅｍｉｒ，Ｃ．Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ａ．Ｓａｎｅ，Ｍ．ＡｌｅｘａｎｉａｎＭ．Ｊ．ＢｌｏｗＤ．ＭａＲ．ＪｏｈｎｓｏｎＪ．，，ｙ，，＇ＤａｕｖｉｌｌｉｅｒＬ，ａ．ＰｅｎｎａｃｃｈｉｏａｎｄＴ．ＰｅｄｒａｚｚｉｎｉＴｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｍｏｒｔａｎｃｅｏｆ，，，ｐｃａｒｄ－ｉａｃｅｎｈａｎｃｅｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｎｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡｓｉｎｈｅａｒｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｇ＂ｄｉｓｅａｓｅＪ；Ｍｏ／．Ｃｅ化ＣａｎｉＺｏ／．Ａｕ．２０１４．，，ｇＭ＇＇９．ＮｅｋｒａｓｏｖＢ．ＷｉｌｄａｎｄＪ．ＭｌｌｅｒＮｕｌｂｉｎｄｉｈｉ［］，，ｕ，ｃｅｏｓｏｍｅｎｇａｎｄｓｔｏｎｅ＇ｍｅｈｌｔｒａｎｓｆｉｖｉｆＤｒｏｈｉｌａ．．ｖｏｌｔｙｅｒａｓｅａｃｔｔｙｏｓｏｐＰＲＣ２／ＥＭＢＯＲｅｐ，．６，ｎｏ．４，ｐｐ．３４８—３５３２００５．，１０Ａ．．．．．Ｃ．ＭａｒｕｅｓＪ．ＨｕｈｅｓＢ．ＧｒａｈａｍＭＳＫｏｗａｌｃｚｋＤ．Ｒ．ＨｉＰ［］ｑ，ｇ，，ｙ，ｇｇｓ，ａｎｄＣ＇＇ｎＰｏｎｔｉｎｇ，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎｓｉｇａｔｕｒｅｓａｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｓｔａｒｔｓｉｔｅｓｓｅｐａｒａｔｅｔｗｏｕ，，ｅｑｕａｌｌｙｏｌａｔｅｄｅｔｄｉｓｔｉｎｃｔｃｌａｓｓ巧ｏｆｉｎｔ灯ｅｎｉｃｌｏｎｎｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡｓ．ｐｐｙｇｇｇ，Ｇｅ巧０说ｅ化〇／．，ｖｏｌ．１４，ｎｏ．１１，ｐ？艮１３１，２０１３．１Ｃｈｈｅｎ．ｈ．．ｅｎＨ．ＣＤＺｅｎＣＫｕａｎ吐ＦａｎＢ．ＺｏｕＷ．ＺｈｕＧ．ＢｕＴ．［ＵＱ，，ｇ，ｇ，ｇ，，，，ＪｉｎＺＦｅ．ＲＷｈｏｕＹ．Ｗａｎ义ＺｈａｎＪ．ＣｈｅｎＬ．Ｊ．ｉｌｄＭｕｂａｒｔ．Ｓａｎｄ．Ｃｈｅｎ，ｇ，ｇ，，，，，，＂＂＊ｕＳｍａｄ７ｉｓｉｅｉｒｅｄｆｏｒｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｆｔｍｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｈｅａｒｔ．Ｊ５沁八ｑ，－ＣＴｚｅ前？ｖｏ．ｎｏ．ｌ２８４１．２９２３００２００９．，，，ｐｐ，＇１２ＳＰ．．Ｔａｎ．ＳｎｉｄＡ．ＢＦｉｒｌｌｉａｎｄＳ．Ｊ．ＣｏＴｒｉｉｌ［］ｇ，ｅｒ，ｕ，ｎｗａｙｅｎｃｎｅｕｒａ，ｇｒｅｓ－ｒｅｓｒｉｄ－ｃｔｔｃｔｅＳｍａｄ７ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｓｕｌｔｓｉｎｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌａｎｄ？，’－ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｄｅｆｅｃｔｓＤｅｖ．执〇／．ｖｏｌ．３４４ｎｏ．１．２３３２４７２０１０．，，，，ｐｐ，ＤＥＷｕａｎＫｉｉＬＪｎ［］．ａｎｇＷ．ＪｉｎＷ．ＤｕａｎＢ．ｉａｏＳ．ＳｕｎＧ．Ｈ．Ｓｌ．ｉａｎｄ吐，，，Ｑ：，ｇ，，；＇＇ＡｗＷａｎｇ，ｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆＴｗｏＶａｒｉａｎｔｓｉｎＳＭＡＤ７ｉｔｈｔｈｅＲｉｓｋｏｆＣｏｎｅｎｉｔａｌｇｕ，，ＤｉｅＨａｎｎ化ＯｗｅｎｏＨｅａｒｔｓｅａｓｅｉｎｔｈＣｈｉｅｓｅＰｏｌａｔｉｏｎｖｏｌ．８．９ｐ，，，，．ｐｅ７２４２３２０１３．，＂１４Ｇ．Ｃ．Ｔ．Ｐｉｅｓ，Ｅ．Ｅ．Ｃｒｅｅｍｅｒｓ，ａｎｄＥ．Ｎ．Ｏｌｓｏｎ，Ｔｈｅｍｙｏｃａｒｄｉｎｆａｍｉｌｆ［］ｐｙｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｃｏａｃｔｉｖａｔｏ。：Ｖｅｒｓａｔｉｌｅｉｒｅｕｌａｔｏｉｒｓｏｆｃｅｌｌｒｏｗｔｈｍｉｒａｔｉｏｎａｎｄｇｇ，ｇ，＇ｏｅｎｅｓ－ｍｉｓ／ＧｅｎｅｓＤｅｖ．ｖｏｌ．２０ｎｏ．１２５４５１ｙｇ．１５５６２００６．，，，，ｐｐ３９ 东南大学硕±学位论文＂ｎｎｄｗ民ｍｅｎ－１５Ｃ．Ｙ．ＣｈｅａＲ，ＸＳｃｈａｒｔｚｅｃｒｕｉｔｔｏｆ出ｅｔｉｎｍａｎｈｏｍｏｌｏＮｋｘ２．５［］，ｇ＂－ｒｉｔｉｂｓｃｒｕｍｉｒｃｓｏ打巧ｆａｃｔｏｒ过ｃｔｉｖ过ｔｓｓｃａｒｄｉａｃｄｐｉ化ａｃｔｉ打ｓｎｓｔｒａｎｓｃｏｎ．ＭｏＺ．ｙｐｇｐ，？。化执〇／－．ｖｏｌ１６ｎｏ．１１６３７２６３８４１９９６．．．，，，ｐｐ，１化Ｓ．Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ，Ｗ．Ｗａｎ，Ｓ．Ｂｅｉｎ，Ｒ．Ｍｅｔｚｅｒ，Ｐ．Ｍ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｎ．［巧ｇｇｇ．ＭｒｖｅＴｉｄｏｗＢ．ＢｒａｎｄｔＨ．ＢｕｅｒｅｒＥＢｕｌｋ．ＴｈｏｍａｓＷ．Ｅ．ＢｅｄｅｌＨ．Ｓｅｒ，，，，，，，ｇ＂－ａｎｄＭｒ－Ｃ．ｉｉｌｌｅＴｉｄｏｗＭＡＬＡＴ１ａｎｏｖｅｌｎｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡａｎｄｔｈｙｍｏｓｉｎ，，ｇ，－ｕｎｂｔｒｅ化ｃｔ－ｅａ４ｍｅｔａｓｔａｓｉｓａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌｉｎｅａｒｌｓｔａｅｎｏｎｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｐｙｇｇ，，ｒ－ｃａｎｃｅ．Ｏ巧ｃｏｅｎｅｖｏｌ３９８０３８０４．２２ｎｏ．．１１２００３．，ｇ，，，ｐｐ，１７Ｖ．ＴｒｉａｔｈｉＪ．Ｄ．ＥｌｌｉｓＺ．ＳｈｅｎＤ．Ｙ．Ｓｏｎ．ＰａｎＡ．Ｔ．Ｗ抓Ｓ．Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ［］ｐ，，，ｇ，Ｑ，，，Ｃ．ＦａＢＪｎ．．ＢｅｎｎｅｔｔＡ，ＳｈａｒｍａＰ．ａ．Ｂｕｂｕｌ．．ＢｌｅｃｏｗｅＳ．Ｇ．ＰｒａｓａｎｔｈａｎｄＫ，，ｙ，，，＂Ｖ－ｒｅｕ．ＰｒａｓａｎｔｈＴｈｅ打ｕｌｔｉｅｄｎｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡＭＡＬＡＴｌｌａｔｅｓ，ｃｅａｒｒｅａｎｇｇ，’ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｌｉｃｉｎｂｍｏｄｕｌａｔｉｎｇＳ艮ｓＵｃｉｎｆａｃｔｏｒｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎＡｆｏ／．ｐｇｙｙ，ｐｇｐｐｖｏｌ－０／／．３９ｎｏ６９２５９３８２０１０．．．，，，，ｐｐ［巧］Ｌ．Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｌｉ打，Ｗ．Ｌｉｕ，Ｊ．Ｚｈ抑ｇ，ｆＣ．ａ．Ｏｈｇｉ，Ｊ．Ｄ．加ｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．Ｃ．Ｄｏｒｒｅｓｔｅｉｎ，＇＊ａｎｄ－ｎ－Ｍ．Ｇ．ＲｏｓｅｎｆｅｌｄＮｃＲＮＡａｎｄＰｃ２ｍｅｔｈｌａｔｉｏｄｅｅｎｄｅｎｔ，ｙｐｇｅｎｅ＂ｒｅｌｏｃａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅ打ｎｕｃｌｅａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｍｅｄｉａｔｅｓｃｎｃａｃｔｉｖａｔｉｏｎｒｏｒａｍｓ，Ｇｃ／／：ｇｐｇｎｏ－ｖｏ．ｌ．１４７．４７巧７８８２０１１．，，ｐｐ，１ＩＣｉｌｉＹＭｉｄｄａｂａｌｒ．ＺＯｍｉＴＢｒ．Ｍ．Ｍｃｈａｋ义Ｙｏｕ．ａｎａｖｓｋＡ．ＤｏｌａｕＭ．ａｕｎ［，，，，，，刊ｐｇ口ＪＹｎｏｍａｒｅｖａｉ．ｏｈｎ．ＰｏＷ．ＣｈｅｎＳ．ＵｃｈｉｄＯ民．ａ．旦〇〇峰ａｎｄＳ．Ｄｍｍｅｌｅｒ，＾，ｊ，＂ＬｏｎｎｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡＭＡＬＡＴｌｒｅｕｌａｔｅｓｅｎｄｏ化ｅｌｉａｌｃｅｌｌｆｉｉｎｃｔｉｏｎａｎｄｖｅｓｓｅｌｇｇｇ＇ｒｉｒｃｎｏ－ｏｗｔｈ／Ｃ．Ｒｅｓ．ｖｏｇｌ．１１４．９．１３８９１３９７２０１４．，，，ｐｐ，－Ｍａｒ２０Ｌ．Ｋｕｒｉａｎａ．ＡｕｉｒｒｅＩＳａｎｃｈｏｔｉｎｅｚＣ，目ｅｎｎｒＴＨｉｈｉｄａＴ．Ｂ．Ｎｕｙ：．，ｅ．ｓ，ｅｎ［］ｇ，，ｇ，Ｐ．Ｒｅｄｄ，Ｅ．Ｎｉｖｅｔ，Ｍ．Ｎ．Ｋｒａｕｓｅ，Ｄ．ａ．Ｎｅｌｌｅｓ，Ｃ．ＲｏｄｒｉｕｅｚＥｓｔｅｂａｎ，Ｊ．Ｍ．ｙｇ＇＇ＣａｍｉｓｔｏｌＧ．Ｗ．ＹｅｏａｎｄＪ．Ｃ．ＩｉｕａＢｅｌｍｏｎＩｄｉｆｉｉＮｏｖｅｌ，，ｚｓｔｅｅｎｔｃａｔｏｎｏｆｐｐ，－ＣＬｏｎｇＮｏｎｏｄｉｎＲＮＡｓＵｎｄｅｒｌｉｎＶｅｒｔｅｂｒａｔｅＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｇｙｇＤ＾ｅｖｅｌｏｍｅｎｔ／Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ２０１５．ｐ，＂２１Ｊ．Ｖｉｅｒｅｃｋ，Ｒ．Ｋｕｍａｒｓｗａｍｙ，ａｎｄＴ．Ｔｈｕｍ，ＬｏｎＮｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡｓａｓ［］ｇｇ＂ｎｄｒｍｎａ＇Ｉｎｄｕｃｅ。ａＴｅｉｔｏｒＳｏｆＶａｓｅ山ａｒＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｚ＞ｃ＂／幻化９Ｍ２０１５．，，４０ 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东南大学硕±学位论文＇＇３０ｎ－Ｍ．ＶａｕｓｏｒｔＤ．Ｒ．Ｒ．ＷａｅｒＹ．ＤｅｖａｕｘａｎｄＣ．ＲｅｓＬｏｎＮｏｎＣｏｄｉｎ［］，ｇ，，，ｇｇ＂ＲＮＡｓｉｎＰａｔｉｅｎｔｓＷｉｔｈＡｃｕｔｅＭｙｏｃａｒｄｉａｌＩｎｆａｒｃｔｉｏｎ，２０１４．３１Ｓｌ．ＨｒＪ．ＴｒｉｍｒｈｉＬ．ＣｉＨ．ＨｕＷ．Ｐ．ＫＧ．［］．Ｂａｃｋｓｈａｗ，Ｓａｐａｖａｔ，ａｃ，ａ，ａｎｇ，ｕｏ，ｂｅＲＥＦｒ－ＭｒＫｉｌｉＨ．ＣｈＲＹｕｎＥＡｈＬＯｈＷｅ．Ｌｅｅ．．ａｏＳ．ｏ．．ｓｃ．ｎｏａｃｈａｄｏ，，，，ｇ，，，＂Ｗ．Ｈ．Ｗｏｎｇ，ａｎｄＣ．Ｌ．Ｃｅｐｋｏ，Ｇｅｎｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｏｕ化ｒｅｔｉｎａｌ＇ｖｏＬｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ／ＰＬｏＳＢｉｏｌ，２，ｎｏ．９，２００４．＂．Ｓｋ．ＳｏｎｅＴＨａａｓｈｉＨ．ＴａｒｕｉＫ．ＡａｔａＭ．Ｔａｋｅｉｃｈｉａｎｄ．ＮａａａｗａＴｈｅ口巧Ｍ，ｙ，，ｇ，，ｇ，－ｍＲＮＡｌｉｋｅｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡＧｏｍａｆＵｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｓ泣ｎｏｖｅｌｎｕｃｌｅａｒｄｏｍａｉｎｉｎａ’’－ｓｕｂｓ巧ｏｆ．．１．ｎｅｕｒｏｎｓ．乂ＣＷ／沉Ｚｖｏｌ２０ｎｏ．巧１５．２４９８２５０６２００７，，，，，ｐｐ３ＮｈｉｉｚａｋｉＨＳｚｕｎｏＳｕＳｉ．ＴｋｈｉＹ口］．ＩｓＫ．Ｏ．ａｔｏＨ．ＭｉｓｕｍｕａｔｏＡａａａｓｈ．，，，，，，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｓ．Ｉｋｅｇａｗａ，Ｎ．Ｋａｍａｔａｎｉ，Ｍ．Ｈｏｒｉ，ＳａｔｏｓｈｉＳａｉｔｏ，Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，＂－ａｎｄＴ．ＴａｎａｋａＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ过ｎｏｖｅｌｎｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡＭＩＡＴｔｈａｔｃｏｎｆｅｒｓ＾ｇ，，＊ｕｍ－ｒｉｓｋ．ｅｎｅｔｖｏＬ．ｏｆｍｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ／Ｊ．ＨＧ．５１．１０８７１０９９２００６ｙ，，，ｐｐ＂３ｈｄ－ＪＺｌｔ．ＬｉＪ．ＹａｏＸ？化义ＷａｎＹ．化ａｎ．ＴａｏＬｎｃＲＮＡＭＩＡＴＲｅｕａｅｓ［Ｗ，，ｇ，，ｇＭｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒＤｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｂｙＦｕｎｃｔｉｏｎｉｎａｓａＣｏｍｐｅｔｉｎＥｎｄｏｅｎｏｕｓｇｇｇ＊ＲＮＡ／ｎｏ．Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０１４２０１５．，＂３５Ａ．Ｌ．ＨｒｄａｎｄＡ．Ｈｅｌｌｓ任加１Ｏｎｓａｆｅｔｈａｒｍａｃｏｋｉ打ｅｔｉｃｓａｎｄｄｏｓａｇｅｏｆ［］，ｙ，ｐ＂■如化戶幻ｅ成幻化疏ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂｉｎ民ＯＰｔｒｅａｔｍｅｎｔＡｒｅｖｉｅｗ．Ｊ戶ａｅ诚幻化，，－ｖｏｌ１５１１．１００ｎｏ．１２．１５２３２７２０．，，，ｐｐ６Ｐ．Ｇｒｏｔｅ．．ＫＡ．Ｂ．ＷｉｔｔｉｅｒＤＨｅｎｄｒｉｘＦｏｃｈＳ．ＷａｈｒｉｓｃｈｅｉｓａｗＫ．Ｍａｃｕｒａ口，Ｌ，，，，，，］＇＊Ｇ－．ＢｌａｓｓＭ．ＫｌｌｉＭ．ＷｄＢ．Ｇ，ＨｅＴｈｔｉｉｆｉ，ｅｓ，ｅｒｂｅｒ，ａｎｒｒｍａｎｎｅｓｓｕｅｓｃ，ｐｅｃ打ｃＲｅｎｄｒｒ打ｒｅｅａｒｎｄ１ＮＡＦｉｓａｎｅ巧ｅｔｉａｌｇｕｌａｔｏｒｏｆｈｔａｂｏｄｙｗａｌｌｄｅｖｅｌｏｍｃ打ｔｉ打ｐ，，ｍｏｕ）ｅｖ－ｔｈｅｓｅ．ｅｖｏ．ＺＣｌ．２４ｎｏ．２．２０６１４Ｊａｎ．２０１３．，化，，ｐｐ，＂’’７ＹＤ－ｎｃ．Ｗ．ＺｈｉｈｕａＷａｎａｗｎｏｆＴｈｅＥｉＬＲＮＡｓＮｅｗＰａｔｈｆｒｏｍＭｈｔ口，ｅａｒ］ｇｐｙ，－．１３１４２０１４．ｐｐ，ｎ－ｎｎａｎＷ３ＨａＷ．ＬｉＣ．Ｈ．ＬｉＪ．ＹａＣ．Ｓｈ．Ｔ．ＮｕｅｒｎｂｅｒＫ．Ｋ．Ｊｉｎ．Ｘｕ［，，，，ｇ，Ｓｇ，，：Ｗｇ－－Ｙ－ｎＣ．ＬｉｉｉＬＹＸｎＨ．．．Ｃ．Ｊ．ｉｎ．ｉｏＣ．Ｃｈｉｅ目ＺｈｏｕＥ．ＡｓｈｌｅＤ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎｊ，ｇ，，，ｙ，，－－Ｐ－ｓａｎｄａｎｎ．Ｓ．ＣｈｅｎＨ．Ｓ．Ｖ．ＣｈｅｎＴ．ｕｅｒｔｅｒｍｏｕＣ．Ｐ．Ｃｈｌｏ，，Ｑ，ｇ，ｇｎ＇ｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｒｏｔｅｃｔｓｔｈｅｈｅａｒｔｆｒｏｍａｔｈｏｌｏｉｃａｌｈｙｐｅｒｔｒｏｈｙ／Ｎａｔｕｒｅ，ｐｐｇｐＡｕ２０１４．ｇ．４２ 参考文献［３９］Ｓ．Ｚｈｕ，Ｌ．Ｃａｏ，Ｊ．Ｚｈｕ，Ｌ．Ｋｏｎｇ，Ｊ．Ｊｉｎ，Ｌ？巧ａｎ，Ｃ．Ｚｈｕ，义Ｈｕ，Ｍ？化义Ｇｕｏ，＂Ｓ．Ｈａｎａｎｄ左ＹｕＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍａｔｅｒｎａｌ巧ｍｍｍｉｃｒｏＲＮＡｓａｓｎｏｖｅｌ，，－ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｒｅｎａｔａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｆｅｔａｌｃｏｎｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔｐｇ，，－紀ｖｏ．４２４ｄｅｆｅｃｔｓ．Ｃ７扔ｌ．６６７２Ｓ．２０１３．．，，，），ｐｐｑ４０民．Ｋｕｍａｒｓｗａｍ，Ｃ．Ｂａｕｔｅｒｓ，Ｉ．Ｖｏｌｋｍａｎｎ，Ｆ．Ｍａｕｒ，Ｊ．Ｆｅｔｉｓｃｈ，Ｇ．Ｌｅｍｅｓｌｅ，Ｆ．［］ｙｙ＂Ｐ－ｉｎｅｔＴ．ＴｈｕｍａｎｄＣＲＣｉｌｏｎＮｏＣ出ｎＲＮＡ，．ｅｓＴｈｅｒｃｕａｔｉｎＬｎｏ，，ｇｇｇ＂ＬＩＰＣＡＲｉｒｅＰｒｅｄｉｃｔｓＳｕｒｖｖａｌｉｎＨｅａｒｔＦａｉｌｕＰａｔｉｅｎｔｓ２０１４．，＂４．Ｎ．Ａ．Ｐｏｕｂｉｏｍａｒｋｅｒｆｏｒｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｅｓｏｐｈａｅａｌｓｕａｍｏｕｓｃｅｌｌ［。民，ｇｑ，ｃａｒｃｉｎｏｍａ／２０１５．＂４２Ｈ．Ｔａｎｇ，Ｚ．Ｗｕ，Ｊ．Ｚｈａｎ，ａｎｄ目．Ｓｕ，ＳａｌｉｖａｒｙＩｎｃＲＮＡａｓａｏ化ｎｔｉａｌｍａｒｋｅｒ［］ｇｐ，，ｆｏｒＭｏ／．乂ｖｏＯｒａｌｓｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ（ｄｉａｎｏｓｉｓ．ｌ．７ｎｏ．３．ｑｇ，巧，，，ｐｐ７６１－７６６２０１３．，＂４；３ＤＷｒｘ扛ａｃｅａｒｎｃｏｄｉｎ．Ｔ．Ｗ．ｏｎＳａｌｉｖａＥｌｌ山ＮｏＲＮＡ：Ｅｍｅ巧ｉｎ［］ｇ，ｙｇｇ＇ｉｒｓｒｅｃｕａｒｓｃｉｎ－Ｂｏｍａｒｋｅｆｏ．．ＭｏｌｌＤｉａｎｏｔｉｓ／ＣｌＴｈｅｒ．１１２２０１５．ｇ＾ｐｐ，＂Ｖ－ｆｏ４．Ｓ．ａｓｕｄｅｖｎｄＡ．民？ＲｎｏｌｄｓＡｎｔｉａｎｉｉｃｔｈｒｃａｎｃｅｒ：ａｅ，ｏ呂ｅｎｅｒａｐｙ［叫ＮｙｇＣｕｒｒｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓ，ｕｎｒｅｓｏｌｖｅｄｑｕｅｓｔｉｏｎｓａｎｄｆｕｔｕｒｅＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｖｏｌ．１７ｎｏ．３．４７１＾９４２０１４．，，，ｐｐ４５－Ａ．ａａｂｕｒａｍｚ．ＢａｎｉＣ．Ｊ．ＥｋＤ．Ｗ．ＷａｌｋｅｒａｎｄＭ．ＣａｓｔｉｌｌｏＭｅｌｅｎｄｅ，，，，［］＂Ｖｕ－ｌｎｅｒａｂｉｌｋｙｆｔｈｅｄｅｖｅｌｏｉｎｇｂｒａｉｎ化ｈｘｉｃｉｓｃｈｅｍｉｃｄａｍａｇｅ：ｏｐｙｐｏ’’＊Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏ打．ｏｆｔｈｅｃｅｉｒｅｂｒａｌｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ化ｉｎｕｒａｎｄｒｅａｉｉ？仍ｏｒｔ／户ｊｙ，ｐｖｏｌ－．３ＮＯＶｎｏＮｒ１２１２０１２．ｏｖｅｍｂｅ．．，，，ｐｐ４６Ｄｓ－Ｎｅｒ－Ｖｉｗａｂｒｏｆｆ．Ｎ．ＮｕｎｅｓＥ．ＤｉａｔｏＭ．ＣａｄｄｌａＪ．Ｋ．ＥｄｒｄｓＡ．Ｓ．ＤｏＲ．Ｊ．，，＾，，［］Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｊ．Ｍａｎｄｅｌｉｎ，Ｈ．Ｐ．Ｂｒｅｎｔａｎｉ，Ｃ．Ｈａｓｓｅｌｇｒｅｎ，Ｖ．Ｊ．Ｙａｏ，Ｓ．Ｍａｒｃｈｉｏ，Ｃ．ａ．Ｂ．ＰｅｒｅｉｒａＦ．ＰａｓｓｅｔｔｉＧ．ａ．ＣａｌｉｎＲ．Ｌ．ＳｉｄｍａｎＷ．Ａｒａａｎｄ民．Ｐａｓｕａｌｉｎｉ＾，，，ｐ，ｑ，＂Ｓｒ－－ｎｎｃｈｏｎｏｕｓｄｏｗｎｍｏｄｕｌａｔｉｏ打ｏｆｍｉ民１７ｆａｍｉｌｙｅｍｂｅ。ｉｓａｅａｒｌｙｍｙ＂ｃａｕｓａｔｉｖｅｅｖｅｎｔｉｎｔｈｅｒｅｔｉｎａｌａｎｉｏｅｎｉｃｓｗｈｃｈ，／Ｖｏｃ．？如幻社航ｖｏｌ．ｇｇ，１１２ｎｏ．１２．２０１５００００８２０１５．，，，ｐ［４７Ｇ．Ｂｅｊｅｒａｎｏ，Ｍ．Ｐｈｅａｓａｎｔ，ＬＭａｋｕｎｉｎ，Ｓ．Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ｗ．Ｊ．Ｋｅｎｔ，Ｊ．Ｓ．Ｍａｔｔｉｃｋ，］＂＂ａｎｄＤ．Ｈａｕｓｓｌｅｒ，ＵｌｔｒａｃｏｎｓｅｒｖｅｄＥｌｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅ，ｖｏｌ．１３２１，ｎｏ．２００４，２００４．４３ 东南大学硕±学位论文４８ＧｌＣ．ＬｉｕＭＦｉＴ．Ｈｌ民ｉｚｚ，ＳｉｎｉＭ．Ｆｒｉ［］．ａＣａｍ，．ｅｒｒａｃｎｓｏ，．ＳｏＣｅｖａｎ，ａｂｂ，，，ｙｐｐ，ｇＡ．Ｃｉｍｍｉｎｏ，Ｅ．Ｊ．Ｌｅｅ，Ｓ．Ｅ．Ｗｏｊｃｉｋ，Ｍ．Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｅ．Ｔｉｌｌ，Ｓ．Ｒｏｓｓｉ，Ｃ．Ｔａｃｃｉｏｌｉ，Ｆ．Ｘ．Ｌｒ巧ｃｈｉｏｒｒｉｉｕＳ．ＺｕｏＶ．ＨｅｌｅａＬ．ＧｒａｍａｎｔｉｅｒｉＧ．ＬａｎｚＯＨ．ＡｌｄｅｒＬ．，，ｐ，，，ｊ，ＲａｓｓｅｎｔｉＳ．．ＶｏｌｉｎｉａＴ．Ｄ．ＳｃｈｍｉｔｔｅｎＴ．Ｊ．ＫｉｓＭ．ＮｅｒｉｎｉａｎｄＣＭ．，，ｇ，ｐｐ，ｇ，＂Ｃｒｏｃｅ，Ｕｌｔｒａｃｏ打化ｒｖｅｄｒｅｇｉｏｎｓｅｎｃｏｄｉｎｇｎｃＲＮＡｓａｒｅａＵｅｒｅｄｉｎｈｕｍａｎ，’ｌｅｕｋｅｍｉａｓｉｎｏｍａ丹ｃｅｒｖｏＬ打０２１５—２９Ｓｅａｎｄｃａｒｃａｓ．Ｇ１２．３．．，，，ｐｐ，ｐ２００７．４９Ｋ．Ｍ．Ｗａｔｅｎ，Ｋ．Ｂｒｙ細，Ｎ？比Ｆｏｌ巧，Ｍ．Ｍｅｅｈａｎ，ａｎｄＲ．Ｌ．Ｓｔａｌｌｉｎｇｓ，［］＂ｘｒｅｓｓｏｎａ－－Ｅｐｉｌａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉｎｆｌｍｃｔｉｏｎａｌｕｌｔｒａｃｏｎｓｅｒｖｅｄｎｏｎｃｏｄｉｎｍａｓｉｎｇ■－：０ａｌｌｉｉｄｉｆｉｉｌＫｓｐｏｎｓｅ１ｔｒａｎｓｒｅｔｎｏｉｃａｃｉｄｎｄｕｃｅｄｅｒｅｎｔｉａｔｏｎｎｎｅｕｒｏｂａｓｔｏｍａ’，ｃｅｌｌｓ２０１３．，口０］Ｅ．Ｇ．Ｂｅｒｇｈｏｆｆ，Ｍ．Ｆ．Ｃｌａｒｋ，ＩＳ．Ｃｈｅｎ，Ｉ．Ｃａｊｉｇａｓ，Ｄ．Ｅ．Ｌｅ化，ａｎｄＪ．Ｄ．Ｋｏｈｔｚ，＂ＥｖｆＺＤｌｘ６ａｓＩｎｃＲＮＡｒｅｕｌａｔｅｓｕｌｔｒａｃｏｎｓｅｒｖｅｄｅｎｈａｎｃｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅ（）ｇ’，ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆａｄａｃｅｎｔｅｎｅｓ．，Ｄｅｖｅ／ｏ／ｗｚｅｎｆｖｏｌ．１４０ｐｊ，，ｇｎｏ－．２１．４４０７１６２０１３．，ｐｐ，５１ＣＮ．ＶＰ．．ＢｒａｃｏｎｉｌｉＴ．Ｋｏｉｘｒｅ．ＧｒｉｉＮ．ＨｕａｎＧＪ．ＮｕＬ．［］，ａｅｒ，ｇ，ａｓｐａｎ，ｇ，ｏｖｏ，Ｔ＇＇ｅｒｒａｃｃｉａｎｏＣ．Ｍ．ＣｒｏｃｅａｎｄＴ．ＰａｔｅｌＥｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｏｌｅｏｆａ，，，ｐｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｗｉｔｈａｎｕｌｔｒａｃｏｎｓｅｒｖｅｄｅｌｅｍｅｎｔｉｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ＇－ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｐｒ．．．．．．２．７８６９１Ｊａｎ．／ｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｅｔＵＳＡｖｏｌ．１０８ｎｏ，，，，ｐｐ２０１１．５２ＳＫＡＤＫＧｒａｎｏＧＦｌｌｌｏｎＲ．Ｋ．ｉｌ．．ａｔｚｍａｎ．．ｅｍ．Ｂｅｅ．ｅｗｅＬ．Ｆｕｔ：ＷｓｏｎＳ？艮［］＾，ｊ，，，＂ＳａｌａｍａａｎｄＤ．ＨａｕｓｓｌｅｒＢＲＥＶＩＡＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＵｌｔｒａｃｏｎｓｅｒｖｅｄＥｌｅｍｅｎｔｓ，，Ａ，，ｒｅｒｌ．３１４２００７Ｕｌｔａｓｅｅｃ化ｄ．，ｐ，口引Ｂ．Ｃ．Ｆａｉｒｃｌｏｔｈ，Ｊ．Ｅ．ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，Ｎ．Ｇ．Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｍ．任Ｈａｒｖｅｙ，Ｒ．Ｔ．＇＇Ｂｒｕｍｆｉｅｌｄ，ａｎｄＴ．Ｃ．Ｇｌｅｎｎ，Ｕｌｔｒａｃｏｎｓｅｒｖｅｄｅｌｅｍｅｎｔｓａｎｃｈｏｒｔｈｏｕｓａｎｄｓｏｆ，’ｅｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒｓｓａｎｎｉｎｍｕｌｔｉｐｌｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｔｉｍｅｓｃａｌｅｓ．，ｆ．化〇／．ｖｏｌ．ｇｐｇ如，－６１．．，ｎｏ．５７１７２６，Ｏｃｔ２０１２．，ｐｐ－ｕ５４ＶａＢｅｌｉＰａｒｋｅｒ．ｕＡｅｒ．．ＡｋＥ．ＭｔＨＷａｎＷ．Ｈ．ＰｕｚｉｏＫｔａｎｄＡ．Ｊ．，，，，，，［］ｙｇ＂’’Ｌｅｖｉｎｅ，Ｔｈｅｏｒｉｇｉｎｓａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆ化ｅｐ５３ｆａｍｉｌｙｏｆｇｅｎｅｓ．，ＣｏＷ尸柄容成ｅｃｔ．Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．２ｎｏ．６．ａＯＯｌ１９８Ｊ２０１０．，，，，ｕｎｐｐ４４ 参考文献Ｓ（，，５５．ＤｉｅｄｅｒｉｃｈｓｆｂｕｒｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓｏｆｎｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡ妃［］ＴｈｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎＴＶｅ巧，ｇ，Ｇｅｎｅｆ．，Ｍａｒ．２０１４．＂５６Ｓ．ＢａｓＡＦ．Ｍ社Ｈｅｒ，ａｎｄ民？Ｓａｎｅｓ，Ｅｘａｍｌｅｓｏｆｓｅｕｅｎｃｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ［］ｇｐｑａｎａｌｙｓ巧ｃａｐｔｕｒｅａｓｕｂｓｅｔｏｆｍｏｕｓｅｌｏｎｇｎｏｎ乂ｏｄｉｎｇＲＮＡｓｓｈａｒｉｎｇｈｏｍｏｌｏｇｙ？’，ｗｉｔｈｆｉｓｈｃｏｎｓｅｒｖｅｄｅｎｏｍｉｃｅｌｅｍｅｎｔｓ．公ＭＣｚｒ／ｎｚｖｏ．ｕ方饥ｎｂａｆｃｓｌ１４Ｓｌ７，ｇ，ｙ，ｐｐｎｏ．Ｓｕｌ７．Ｓ１４Ｊａｎ．２０１３．ｐｐ，ｐ，５７Ｙ．Ｄａｉ，Ｓ．Ｕ，Ｘ．Ｄｏｎｇ，Ｈ．Ｓｕｎ，Ｃ？Ｚ．ＬｉｕＢ．ＹｉｎｇＧ．Ｄｉｎｇ，ａｎｄＹ．Ｌｉ，［］化，，＊－Ｔｈｅｄｅｎｏｖｏｓｅｑｕｅｎｃｅｏｒｉｇｉｎｏｆｔｗｏｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｅｎｅｓｆｒｏｍａｎｇｇ＊－ｍｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｒｅｉｏｎ．／ＢＭＣＧｅｎｏｉｃｓ，ｖｏｌ．１４Ｓｕｌ８，ｎｏ．Ｓｕｌ８，．Ｓ６，２０１３．ｇｐｐｐｐｐＰ＇＾５８．．ＶＭ．ＪｏｈｎｓｓｏｎＬＬｉｏｖｉｃｈＤＧｒａｎｄｅｒａｎｄＫ．ｏｒｒｉｓＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒ［］，ｐ，，，ｙ’，ｃｏｎｓｅｒｖａ－ｔｉｏｎｏｆｌｏｎｎｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡｓ化ｕｅｎｃｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｆｉｉｎｃｔｉｏｎ．ｇ；，，，ｇｑＢｉｉ－ｏｃｈｍ．Ｂｉｏｈｓ．Ａｃｔａｎｏ１０６３７１２０１４ｖｏｌ．１８４０．３．．ｐｙ，，，，ｐｐ＊＇５９ＮＬｉＫＣｈＺＬｉＫＧｔＺＣ．ｎ．ａｎｇ．，ａｅｓａｎｄ．ＲａｎａＡｎＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｏｎｓｅｒｖｅｄ［］，，，，，ｙＬｏｎＮｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡＴＵＮＡＣｏｎｔｒｏｌｓＰｌｕｒｉｏｔｅｎｃａｎｄＮｅｕｒａｌＬｉｎｅａｅｇｇｐｙｇ＂ｍｅｎ－ＣｏｍｍｉｔｔＭｏ／．Ｃｅ．１１５Ｆｅｂ．２０１４．，化ｐｐ，－６０Ｙ－－－Ｗ．．ＳｕＪ．Ｔ．ＬｉＹ．ＣｕｉＪ．ＨｏｎＷ．ＤｕＹ．Ｃ．ＷａｎＹ．Ｗ．ＬｉｎＨ．Ｘｉｏｎ，，，，，，，，［］ｇｇｇ＂Ｊ－－－－．Ｌ．ＷａｎｇＫｏｎ．Ｙ．ＧａｏＬ．Ｐ．ＷｅｉａｎｄＪ．Ｙ．ＦＢｉｄｉｒｅｃｉｏｎａｌ，ｇ，Ｑ，，ａｎｇｔ，ｒｅｇｕｌａｔｉｏ凸ｂｅｔｗｅｅｎＷＤ民８３ａｎｄｉｔｓｎａｔｕｒａｌａｎｔｉｓｅｎｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｔＤＨＰＳｉｎｇａｓｔｒｉｃｐ，，ｃａｎｃｅｒＣ／／－ｉ？ｌ．２２．９．１３７４１３８９２０１２．，ｅ化，ｖｏ，ｎｏ，，ｐｐ－－ｎ－Ｗ－６．Ｊ，Ｐａｎｇ．Ｇ．ＬｉｎＹ．ＸｉｏＮ．ＷｅｉＹ．Ｗａｎ．．ＳｈｅｎａｎｄＧ．Ｓ．，Ｌ，ｇ，，，，［ＵＷｇＱ＂Ｙａｎｇ，ＫｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆＰＵ．ｌＡＳＩｎｃＲＮＡｉｎｈｉｂｉｔｓａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈ，，ｅｎｈａｎｃｉｎＰＵ．ｌｍＲＮＡｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．，ｙ．ＣＷ／．丑ｉｏｃＡｅ说．，ｖｏｌ．１１４，ｎｏ．１１，．ｇｐｐ２５００－１２Ｎｏｖ２０１３．．，６ｌｋＬｅｉＺｕｎ．ＢｕｍＡ．ＶｅｒｍａＺ．ＬｉｕＫ．ＰｒａｍａｎｉＮ．艮？ｈＣ．．ＣｈＧ．Ｖ．［３広化Ｙ，＾，，ｇ＾，Ｓａｍａｎｔ，Ｂ．Ｚｈａｏ，Ｍ．Ｋ．Ｇａｍａａｓ，Ｍ．Ａ．Ｈｏｒｓｗｉｌｌ，Ｓ．Ａ．Ｓｔａｎｈｏｐｅ，Ｅ．Ｎｏｒｔｈ，＂民？．Ｍｉａｏ０？Ａ．ＷｉｌｋｉｎｓｏｉｉＭＡｆｏｌｔｅｒａｎｄＲ．ＲａｍｃｈａｎｄｒａｎＡｎｏｎｃｏｄｉｎＱ，ｓ：，ｇ，，－ＮＡ－ａｎｔｉｓｅｎ化Ｒｉｎｔｉｅ１ｌｏｃｕｓ化ｇｕｌａｔｅｓｔｉｅ１ｆｉｍｃｔｉｏｎｉｎｖｉｖｏ巧ｖｏｌ．１１５，，ｎｏ－．ｌ．ｌ＾１３９２０１０．，ｐｐ，４５ 东南大学硕±学位论文＇＇Ｘｉｉｖ６３Ｊ．Ｌｕ．ＷｕＭ．ＨｏｎＰ．ＴｏｂａｓａｎｄＪ．ＨａｎＡｏｔｅｎｔｉａｌｓｕｒｅｓｓｅｅｆｆｅｃｔ［］，，ｇ，，，ｐｐｐ－－ＩＬ１ｏｎａｅ－ｎｄｕｏｆｎａｔｕｒａｌａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡｌｉｏｏｌｓａｃｃｈｒｉｄｉｃｅｄＩＬｉｐｐｐｐｙ，７ｖｏ－ｅｘｒｅｓｓｉｏｎ．／Ｊ／ｗ饥ｗｎｏ／．ｌ．１９０．６巧０８２０１３．ｐ，，ｐｐ，６４ＮＲｌＬＳｅｌｌｅｒｉｄｏｌＭＬＣｌ．．Ｍａｎｅｙ．Ａ．ＢｒｅｎａｎＪ．Ｇｏｒｄｏｎａｎｄ．．ｅａｒｙ［］，，，，，＂ＡｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓｏｆｃａｕｄａｌｈａｒｎｅａｌｏｕｃｈｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｉｎＰｂｘＩｋｎｏｃｋｏｕｔｐｙｇｐｐ＂ｌｓｆ－ｍｉｃｅｍｉｍｉｃｏｓｏＨｏｘ３ａｒａｌｏｓｖｏｌ２７６３０１３１２２００４ｇ．．．ｐ，，ｐｐ，［６５Ｃ．Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｓｔａｎｋｕｎａｓ，Ｃ．Ｓｈａｎ，Ｓ．Ｋａｏ，Ｋ．Ｙ．Ｔｗｕ，ａｎｄＭ．Ｌ．Ｃｌｅａｒｙ，］ｇｇ＇ｘｕＴｂｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｄｉｓｔｉｎｃｔｒｅｌａｔｏｒｎｅｔｗｏｒｋｓｔｏａｔｔｅｒｎｔｈｅｒｅａｔａｒｔｅｒｉｅｓａｎｄｇｙｐｇ＂—ｃａｒｄｉａｃｏｕｔｆｌｏｗｔｒａｃｔｖｏＬ３５８６．３５７７３５８６２００８．，，ｐｐ，６６Ｋ．ＳｔａｎｋｕｎａｓＣ．ＳｈａｎＫ．Ｙ．ＴｗｕＳ．ＫａｏＮ，Ａ，ＪｅｎｋｉｎｓＧ．ＮｅａｌＭ．Ｓａｎａｌ［，，，，，，，］ｇｙ＂Ｌ．．ＳｅｌｌｅｒｉＭＬ．ＣｌｅａｒａｎｄＣ．ＣｈａｎＰｂｘ／ＭｅｉｓＤｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓＤｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ，ｙ，ｇ，＊ｕ－ｌｔｉｅｎｅｔｉｃＯｒｉｇｉｎｓｆ．７０２ＭｏＣｏｎｅｎｉｔａｌＨｅａｒｔＤｉｓｅａｓｅ／７０９２００８．ｇｇ，ｐｐ６７．ｌｉ，Ｚ．Ｓｕ，义Ｘｕ，Ｇ．Ｌｉｕ，义Ｓｏｎ，Ｒ．Ｗａｎｇ，义Ｓｕｉ，Ｔ．Ｌｉｕ，义Ｃｈａｎ，ａｎｄ［］Ｑｇｇ＇＇－ＤＨａｄ－ｈｌｎｃｅｓ．ｕａｎＡＳ１ＤＨＲＳ４ｈｅａｔｏｅａｄｎａｔｕｒａａｎｔｉｓｅｎｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｔｓｉｌｅｇ，，ｐ，＾ｖｔｈｅＤＨＲＳ４ｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｃｉｓａｎｄｔｒａｎｓ／Ｐｒｏｃ，ＮａｔｌＡｃａｄＳｅｔ，ｏｌ．１０９，．ｇｐｐ－１４１１０１４１１５２０１２．：６Ｖ．ＧａｒＩ．ｈｉｒｉａｉＡＢｕｌ．ＳＫａｔ民？ＢａｒｎｅｓＭ．Ｋ．ＳｃｈｌｕｔｅｒｍａｎＩ．Ｎ．ＫｎＣ．．ｔｅｒ［刊ｇ，ｙ，，，ｇ，，＂ｎｎｄ－ＣｒｏｃＳｍｕａｎ．Ｒ．民ｏｔｈｋ艮．．ＢａａＫ．ＨｉｒａａｍａａｍａｄａＧＡＴＡ４ｔｔｉｏｓ，ｐｅ，ｙｙ，，，ｃａｕｓｅｈｕｍａｎｃｏｎｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔｄｅｆｅｃｔｓａｎｄｒｅｖｅａｌａｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏ打ｗｉｔｈＴＢＸ５ｇ，－＾４７ｖｏＬ２１．４４３２００３．，ｐｐ，ＳｕＡ－６９．Ｋ．Ｒａｊａｇｏｐａｌ．ＭａＤ．ＯｂｌｅｒＪ．ＳｈｅｎＡ．Ｍａｎｉｃｈａｉｋｌ．ＴｏｍｉｔａＭｉｔｃｈｅｌｌ［］，Ｑ，，，，，ｏａｒｄｍａｎＣｓ．ｖａＥＧｏｍｕｎｚＫＷ．ＢｒｏｍａｎＫ．Ｂ．百ｒｉＶＧａｒＤ．Ｓｒｉｓｔａｖａ．ｌｄｔ．，ｇｇ，ｇ，＾，，＂Ｄ．ＷｏｏｄｒｏｗＢｅｎｓｏｎ，Ｌ．Ｂ．Ｓｍｏｏｔ，ａｎｄＷ．Ｔ．Ｐｕ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｈｅａｒｔ化化ａｓｅ＂ａｓｓｏｃ■ｉａｔｅｄｗｉｔｈｉｍｉｒｉｎｅａｎｄｈｕｍａｎＧＡＴＡ４ｍｕｔａｔｉｏｎＪＭ？／．Ｃｅ化Ｃ口／成〇／．，，ｖｏ－ｌ．４３．６７７６８５２００７．，，ｐｐＭ＂［７０Ｃ．Ｇｒ６ｉｎ，Ｌ．Ｒｏｂｉｔａｉｌｌｅ，Ｔ．Ａｎｔａｋｌ，ａｎｄ．Ｎｅｍｅｒ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ］ｐｙ，，＊ｆａｃＡＴＡ－４ｒｓｃｅｅｒｅｎｔｏｒＧｅｘ）．ｉｅｓｓｉｏｎｂｌｏｃｋｓｉｎｖｉｔｏｃａｒｄｉａｃｍｕｌｄｉｆｆｔｉａｔｉｏｎ．Ｍ／ｐ，ｖｏ－。化公沁／．ｌ．．１５ｎｏ．８４０Ｗ４１０２１９％．，，，，ｐｐ４６ 参考文献＂７１Ｃ．Ｇｒ６ｐｉｎ，Ｇ．Ｎｅｍｅｒ，ａｎｄＭＮｅｍｅｒ，Ｅｎｈａｎｃｅ过ｃａｒｄｉｏｅｎｅｓｉｓｉｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃ［］ｇ’，－ｗｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓｏｖｅｒｅｘｒｅｓｓｉｎ４ｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎｆａｃ化ｒｖｏ．化ｅＧＡＴＡ．如雌ｌｐｇｐ，－７１２４．．２３８７２３９５１９９，ｐｐ，７２ＥＢｉｉＳ化ＳＷＫ０ＴｉＮＢｏｄ民ＭＭ山ｌＳ．ｓｎ．ｅｄａ．．ｏｎ？ａｍａｖｓｋ．ａｋＪ．？ｃｅｎ．［］ｐｇ，，ｇ，，ｙ，，ＲａａｏａｌＪ．ｎｒ．ＫＳｏｎ．ＭａＺ．ＳｐｒｉＰ．Ｍ．ＫａｎＳ．ＩｚｕｍｏａｎｄＷ？了？Ｐｕｊｇｐ，，Ｑ，ｇｅ，ｇ，，，＇＇Ｇａｔａ４ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｏｆｏｓｔｎａｔａｌｃａｒｄｉａｃｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｒｏｔｅｃｔｉｏｎｐｐ，，ｆｒｒｅｒ－ｏｍ巧ｕｅｏｖｅｒｌｏａｄｉｎｄｕｃｅｄｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅ．ｉＶｏｃ．ｉＶｆｌ化幻ｄ．紀ｆ．＆ｉ４．，，ｐｖｏｌ—．１０３ｎｏ３９．１４４１１４４．，７７６２００６．，，ｐｐ＊＇ｎＸｕｎＸ－７３Ｋ．Ｚｈａ．Ｓ．ＺｈｏｕＬ．ＨａｎａｎｄＬ．ＣｈｅｎＬｏｎｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡ［］ｇ，，，，，ｇＨＯＴＡＩ民ｒｏｍｏｔｅｓｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｃｅｌｌｃｃｌｅｒｏｒｅｓｓｉｏｎｉｎａｎＥＺＨ２ｄｅｅｎｄｅｎｔｐｇｙｐｇｐ＂ｍａｎｎｅｒ，ｖｏｌ．６，ｎｏ．１．’７．ＢｉａｎｃｈｅｓｓｉＩ．ＢａｄｉＭ．ＢｅｒｔｏｌｏｔｔｉＰ．ＮｉｒｏＹ．ＤＡｌｅｓｓａｎｄｒａＭ．Ｃ．［叫Ｖ，，，ｇ，＾Ａ＂ＣａｏｒｏｓｓｉＧ．ＲａｕＡ．ＬａＴｈＭ．Ｚａｎｏｂｉｎｉ．Ｐｏｍｉｌｉｏｃｃｉａｎｄｕｒｉｅｐｇ，，ｐ，，，ｃＲＮＡＡ－ｎｒｅｖｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＩｎＡＳｎｃｍｔＲＮ２ｉｓｉｎｄｕｃｅｄｉｎａｇｉｇａｎｄｌｉｃａｔｉｐ＂ｓｅｎＭｏ—ｅｓｃｅｎｃｅｉｎＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌｓ／．Ｃｅ化Ｃａｒ况〇／．ｖｏｌ８１．６２７０，．，，，ｐｐ２０１５．－－－－７５ＫｎＢ．．ＺＹ．ＺＹＹＦａｎｄ［］．Ｗａｇ．ＬｏｎＬＹｈｏｕＦ．Ｌｉｕ．ｈｏｕＣ．Ｙ．Ｌｉｕ．．ａｎ，ｇ，，，Ｑ，，，＂Ｐ－－．ＦＬｉＣＡＲＬＩＲＮＡｉｉｂｉｔｓｉｉｉｈｏｎｄｒｉａｌｆｉｉａｎｄ．ｎｃｎｈａｎｏｘａｎｄｕｃｅｄｍｔｏｃｓｓｏｎ，－ｍｍ－ａｏｔｏｓｉｓｉｎｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓｂｙｉａｉｒｉｎｉＲ５３９ｄｅｅｎｄｅｎｔＰＨＢ２ｐｐｐｇｐ＾ｕｎ＾ｄｏｗｎｒｅｌａｔｉｏ．Ａａ／．Ｃｏｍｍｕｎ．ｖｏｌ／．５．３５９６２０１４．ｇ，，，ｐ７６Ｌ．ＨａｎＥ．Ｚｈａｎ．ｉ．ｎＴ．．ｈｅ打．Ｓｈ，ＤＹ打，ＲＫｏＸｕ，ＷＣ民？记江ＹｕａｎｄＷ．［，ｇ，，，，］ｇ＂Ｄｅ，Ｌｏｗｅｘｐｒｅｓｓｉｏ打ｏｆｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡＰＡＮＤＡＲｐｒｅｄｉｃｔｓａｐｏｏｒｎｏ－ｕｐｒｏｇｓｉｓｏｆｎｏｎｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒａｎｄａｆｆｅｃｔｓｃｅｌｌａｏｔｏｓｉｓｂｒｅｌａｔｉｎｐｐｙｇｇ＊－ｈＢｃｌ２／Ｃｅｌｌ１５ＤｅａｔＤｉｓ．ｖｏｌ６．ｅｌ６６５２０．，，，ｐ７７Ｄ．Ｆｅｌｄｓ．ＧａｒｂｅｒＪＤＭ．ＨｕａｒｔｅＭ．Ｇｕｔｔｍａｎ．Ｍａｄａｌｅｎａ．［］，，化Ｍ，ｇ＾Ｋｅｎｚｅｌｍａｎｎ－ｂｒｏｚ，Ａ．Ｍ．Ｋｈａｌｉｌ，０．Ｚｕｋ，Ｉ．Ａｍｉｔ，Ｌ．Ｄ．Ａｔｔａｒｄｉ，Ａ．Ｒｅｇｅｖ，Ｅ．Ｓ．＂ＬａｎｄｅｒＴ－．ＪａｃｋｓＬ．ＪＡｌａｒｉｎｔｒｉｃｏｄｉｎＲＮＡｉｎｄｂ，ａｎｄｏｈｎ，ｅｅｃｎｏ打ｕｃｅｄ，ｇｇｅｎｇｙ’’５３ｍｅｄｉａｔｅｓｌｏｂａｌｅｎｅｒｅｒｅｓｓｉｏ打ｉｎｔｈｅ５３ｒｅｓ打化ｖｏｌ．１４２，ｎｏ．３．ｐｇｇｐｐｐｏ，，ｐｐ４０９－４９２０１１１．，４７ 东南大学硕±学位论文致谢时光飞逝，，三年的硕±研巧生学习即将结束，回顾这Ｈ年来的点点滴滴自己幸运地得到多位老师、同学的指导和帮助，也中充满感恩。我的导师蒋舉教授，是我学业的导师，更是我人生的导师，从我成为她学生一的那刻起，无时无刻不被她的精神力量所感染，。蒋舉教授科研与临床并重除一外法定假期，，坚持每周抽出个晚上的时间和大家交流、学习，从不间断。在学习Ｗ外的生活中，她常常带我们旅行出游，给予我们深深的人文关怀。她的关爱，让我不仅在学业上进步，、包容和严厉让我在Ｈ年的研巧生生活中成熟了许多更在生活和人生态度上有了坚实，阳光的塑造．！感谢我的师兄兼老师余章斌老师，他在我的课题设计、落实Ｗ及文章撰写方面给余了悉屯、指导，用他的专注、勤奋深深影响着我，帮助我塑造了严谨、创新、大胆的科研精神！感谢朱丽华、钱丽娟、史悦华、凤尔翠、韩季楠、王靖、叶锦坤师姐，感谢摆翔、张毅、赵瑞斌师兄，感谢我的同口好友王诗雨，感谢谢佳丽、刘慧娟、戴王娟、虞大凡、康树敏、毕布、马赫思、希拉里、莫妮卡、阿里、亚达、白杨的关怀和支持！感谢中大医院儿科乔立兴主任，黄莉副主任，唐月华，王巧，钱钻好，钱丽娟，，，，？尹丽萍，王海英，徐南李函韩季楠张毅老师还有两位护±长＾及许多护±老师对我临床实践的指导和帮助！感谢南京医科大学郭锡烙、韩概萍教授，感谢季晨博、崔县伟老师，感谢宋桂仙师兄，感谢儿科研究所的各位老师和同学：潘晓勤老师，朱莎莎．刘雪华，！，白眯，宣小燕，倪佳佳，陆顺梅，徐红，，赵敏，周瑶张昕张佳敏等等感谢我的父母和家人还有男友给予我的支持鼓励，感激他们对我学业的支持和激励！、衷也感谢所有帮助！、支持和关也我的朋友４８ 作者简介作者简介基本情况：李慧娟，女，，９９２８，２（Ｕ２没族１９８年月日出生江苏南京人。年毕业于东）南大学医学院临床医学（五年制专业，师。同年进入东南大学医学院儿科学系从蒋型教授攻读临床医学儿科学硕±学位，从事先天性必脏病相关的长链非编码ＲＮＡ的研巧。攻读研究生期间，修满学分３３分（要求３０分），顺利完成科研及临床实践。攻读硕±期间成果：＜Ｌ－－１．ｏｎｎｏｎｃｏ山ｎｇＲＮＡＴＵＣ４０ｒｅｄｕｃｅｓＰｂｘｌｅｘｒｅｓｓｉｏｎｓｌｏｗｓｄｏｗｎｇｐ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｉｎｈｉｂｉｔｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓｄｕｒｉｎｇｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ（ｉｉ报ｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎ化ｅＰ１９ｃｅｌｌｍｏｄｅｌ＞己修回；２ＲＮＡＴＵＣ－．《长链非编码４０的组织表达谱及其生物信息学分析》投稿中：３－．《长链非编码ＲＮＡＴＵＣ４０在胚胎也脏发育中作用的初步研巧》摘要录用于《第五届国际新生儿大会汇编》；－４ＮＰ－－．协助导师申报省自然科学基金《正ＰＯｓ通巧犯Ｆ１／ＣＸＣＲ４对于ＭＳＣｓ治疗早产儿脑白质损伤的归巢研巧》并申报成功。４９
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