烟曲霉果胶裂解酶a抗体检测方法的建立及应用

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3、学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材。料均是真实的本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。？学位论文作者签名；家／句劳曰期：兴枝丈学位论文使用授权声明研究生在校攻读学位期间文工作的知识产权单位属南京师范大＾学。学校有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可Ｗ借阅或上

4、网公布本学位论文的部分或全部内容，、复印等手段保存可Ｗ采用影印、汇编本学位论文。学校可Ｗ向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅。（俱密论文在解密后遵守此规定）保密论文注释：本学位论文属于保密论文，密级：保密期限为年。１学位论文作者签名；指导教师签名：糸火藻Ｉ身＾曰期日期：滅Ｔｊ，％户Ｉ摘要摘要，随着糖皮质激素和化疗药物的广泛应用，实体器官移植近年来、造血干细胞ａｓｅｏｓｉｓＡ）的发病移植等的广泛开展，侵袭

5、性曲霉病（ｉｎｖａｓｉｖｅｐ墙ｌｌ，Ｉ率显著上升，且死亡率极高。早期诊断对ＩＡ的成功治疗至关重要，但是目前的ＩＡ诊断方法存在检测周期长，ＩＡ、敏感性低等缺点不能满足临床需要。国内外学者正努力寻找用于一批免疫优势抗原早期诊断的生物标志物，首次发现果胶裂解。课题组前期筛选了酶Ａ（ｐｅｃｔａｔｅｌｙａｓｅＡ，ＰｌｙＡ）与ＩＡ患者血清存在免疫反应，有望作为ＩＡ的诊断标志物。研究目的原核表达烟曲霉ＰｌｙＡ蛋白，建立检测人血清中抗ＰｌｙＡ蛋白ＩｇＧ类抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法Ｉ

6、Ａ。，评估其在诊断中的潜在价值研究方法对烟曲霉Ｐ，选ｌｙＡ的基因序列进行生物信息学分析择大肠埃希菌偏爱的密码子，进行基因序列优化。委托生物公司合成编码ＰｌｙＡ的ＤＮＡ序列，并连接到ｐＥＴ２８ａ表达载体，构建重组表达质粒。将重组质粒转化大肠埃希茜ＢＬ２１（ＤＥ３），ＩＰＴＧ诱Ｈ－导表达ＰｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｓｔａｌｙＡ重组蛋白；Ｗ分析重组蛋白质与抗Ｈｉｓ标签蛋白（ｇ）单克隆抗体和侵袭性曲霉病患者血清中相应抗体的反应性。用重组ＰｌｙＡ包被微孔板，Ｉ建立检测抗Ｐ，Ａ病人血清

7、，评估该方法对ＩＡ的ｌｙＡ抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法检测诊断价值。分析了联合检测抗烟曲霉ＰｌＡ、ＴＲ和ＤＰＰＶ抗体的诊断效果。ｙ研究结果（１）同源性分析显示烟曲霉ＰｌＡ与人蛋白质不存在同源性，与其他常见病原菌ｙ蛋白质的同源性较低。ＰｌｙＡ基因的密码子优化后，在保持氨基酸序列不变的条件下，ＤＮＡ序列中有１８．８４％的核昔酸改变。合成基因并成功构建了重组ＰｌｙＡ表达载体，并诱导表法获得带有Ｈｉｓ标签的ＰｌｙＡ蛋白。（２）Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明烟曲霉ＰｌｙＡ可与抗Ｈｉ

8、ｓ标签抗体、ＩＡ患者血清发生待异性反应，但与其他侵袭性真菌感染病人（如侵袭性念珠菌病）血清和健康人血清无反应。（３）ｌＡ抗体的ＥＬＩＳＡ方法批内变异系数ＣＶ５．３％，建立了检测抗烟曲霉Ｐｙ，（）为批间ＣＶ为１０．９％＞９％，显示该方法具有良好稳定性和特异性。，阻断试验阻断率０（４）０．５３３该方法检测ＩＡ患者血清时，该方法对ＩＡ诊断的敏，选择临界值为感性５１５．ＩＡｌＡ抗体阳性率高．％，特异性９４３％。在非中性粒细胞缺乏的患者抗Ｐ