烟曲霉二肽基肽酶v肽段抗体检测方法建立及应用

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1、分类号R446．5UDC616密级坌五编号1029921114003@江艨大擎硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目幽酋鐾三丛基邀醒y丛匮拉签．捡测左洼建童区应田学科专业监废捡验途逝堂作者姓名莹悬赶指导教师奎羞丞熬援答辩日期．2Q羔垒生鱼旦里Q旦分类号盥璺鱼：主UDC616密级公珏编号如299Zll14003硕士学位论文烟曲霉二肽基肽酶V肽段抗体检测方法建立及应用ESTABLISHMENTANDAPPLICATIONOFANELISAFORDETECTINGASPERGILLUSFUMIGATUSDIPEPT

2、IDYLPEPTIDASESVFRAGMENTANTIBODY作者姓名：指导教师：小组成员：申请学位：学科专业：论文答辩日期：学位授予单位：学位授予日期：答辩委员会主席：评阅人：韩丹丹李芳秋教授史利宁副教授硕士学位临床检验诊断学2014年6月10日江苏大学2014年6月20日邵启祥学位论文版权使用授权书f螋嬲炒江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和

3、借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数据库》并向社会提供查询，授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。论文的公布(包括刊登)授权江苏大学研究生处办理。本学位论文属于不保密口学位论文作者签名：锄毋yf≮年∥月cf日指导教师签名：杉纵加(￥年G月ff曰独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出

4、重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：墨为开日日期：≯k年e月¨日江苏大学硕士学位论文摘要曲霉是一类经呼吸道传播的常见条件致病性真菌，其中以烟曲霉最为常见，其感染引起的侵袭性曲霉菌病(认)在免疫抑制和恶性肿瘤患者中的发病率和死亡率逐年上升，其中侵袭性肺曲霉病若不及时治疗，死亡率极高。但是，由于n的临床表现多不具有典型性，曲霉培养敏感性很低，病理学检查不易常规开展，循环中真菌抗原检测法的敏感性和特异性还不足满足临床需求，因此，研究开发快速、无创、敏感性强、特异性高

5、的实验室诊断方法具有重要意义。本实验室前期研究发现，认患者血清中针对曲霉优势抗原的抗体水平升高，检测这些特异性抗体，有助于认的诊断。其中二肽基肽酶V(DPPV)是优势抗原之一，其特异性抗体对丛诊断的价值，尚需探讨。研究目的选择抗原性强的烟曲霉DPPV肽段进行原核表达；建立检测人血清中抗DPPV肽段IgG类抗体的间接ELISA法；评估其在从中的早期诊断价值。研究方法对烟曲霉DPPV全长序列进行生物信息学分析，选取与人和其他生物同源性低、抗原决定簇密集的区域分段表达。分别采用生物合成和PCR扩增技术，获得DPPV19～144、145-

6、446及19~447位氨基酸肽段的编码序列。构建重组表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌，IPTG诱导表达获得重组肽段DPPV19—144p、DPPV145．447p及DPPV19—447p；纯化后三个DPPV重组肽段与确诊n患者血清进行Westernblot分析，筛选抗原性最强的DPPV19．447p肽段作为包被抗原，建立抗DPPV抗体的间接ELISA法；评估该检测方法对侵袭性曲霉病(认)的T烟曲霉二肽基肽酶肽段V抗体检测方法建立及应用诊断价值。研究结果(1)烟曲霉DPPV同源性分析显示与人源和其他病原菌蛋白的同源

7、性低，结合结构域和抗原决定簇密集分布区域，我们选择对烟曲霉19～144、145-447禾H19～447位氨基酸肽段进行克隆表达基因进行克隆。构建了相应的工程表达菌株并诱导表达，获得带有His标签的DPPV19．144p、DPPV145-447p)及DPPV19—447p肽段，分子量分别约为15kD、35．4kD和47kD。(2)经Westernblot鉴定表明烟曲霉DPPV19—144p、DPPV145—447p及DPPV19．447pN．幺Ft肽段均可与认患者血清发生特异性反应，其中DPPV19．447p抗原性最强。以重组烟曲霉

8、DPPV19-447p肽段抗原作为建立的的ELISA方法批内变异系数(C功均值为4．1％和8．6％，批间C啪均值分别为7．1％和10．9％，阻断试验阻断率>90％，显示该方法稳定性和特异性良好。(3)以该法检测认患者组、非认患者组和健康组血清抗DP