人组织激肽释放酶5抗体制备及双抗体夹心elisa检测方法的建立

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1、泰山医学院硕士学位论文人组织激肽释放酶5抗体制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立姓名：吴艳花申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：胡成进2012-03人组织激肽释放酶5抗体制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立研究生：吴艳花专业：免疫学导师：胡成进教授中文摘要目的人组织激肽释放酶基因家族(Kallil(reins，KLKs)是一种新型肿瘤标志物家族，包括15个成员(KLKl．KLKl5)。人组织激肽释放酶基因5(KalIil(rein5，KLK5)是该家族成员之一，既往研究证实KLK5在激素相关肿瘤中异常表达且与肿瘤的形成、发展、转移有高度相关性。本课题以

2、人组织激肽释放酶5(humaJlKallikein5，hK5)重组蛋白为抗原制备兔抗hK5多克隆抗体和鼠抗hK5单克隆抗体，并建立双抗体夹心酶联免疫检测(enzyme—linkediHununosorbentassay，ELISA)方法；通过对多种肿瘤血清和健康体检血清标本的检测，对其临床应用价值进行初步评价。方法1．通过表达条件的优化使hK5重组蛋白高效表达，并通过Ni．NTA柱纯化出重组hK5蛋白；经SDS—PAGE分离检测目的蛋白的纯度和分子量；Westemblot方法检测目的蛋白的特异性和BCA方法测定蛋白浓度。2．以目的蛋白为抗原对新西兰大白兔进行皮下多

3、点免疫，末次免疫一周后，应用间接ELISA方法检测抗体效价；对新西兰大白兔进行心脏采血并分离血清，一80℃保存备用；以重组蛋白免疫BALB／c小鼠，通过杂交瘤技术诱生含单克隆抗体的腹腔积液并收集。用ProteinA纯化试剂盒纯化抗血清及腹腔积液，所得抗体进行免疫组化(immunohistochemistry，IHC)和Westemblot检测。3．以单克隆抗体为捕获抗体，辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体为检测抗体；采用棋盘滴定法确定最佳工作浓度，建立双抗体夹心ELISA检测方法；通过对临床血清标本的检测对检测方法进行初步评价。结果1．通过对诱导条件的优化，最终确定在

4、28。C条件下，IPTG终浓度为lmM诱导18h时目的蛋白的表达量达到峰值，重组蛋白是以可溶性形式存在细菌裂解液中。目的蛋白分子量约为28∞。Westemblot结果显示重组蛋白可以与anti-his抗体特异性的结合。2．分离免疫兔血清，间接ELISA方法检测血清效价约达1：106；westemblot结果证实了所得多克隆抗体可以特异性的与目的蛋白结合，具有较高的特异性；IHC结果分析表明：1水5定位于细胞浆内，在卵巢癌、胃癌组织细胞中均有表达。利用杂交瘤技术筛选出4株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为284，2D4，386，3F8；通过动物体内诱生方法

5、制各了含大量单克隆抗体的腹腔积液，间接EUsA方法检测腹水效价达1：105，通过纯化得到高纯度的单克隆抗体。westemblot和IHc结果证实单克隆抗体有高度特异性。3．双抗体夹心ELISA方法的最佳工作条件为：包被抗体浓度为7．5pg／mL，酶标抗体最佳稀释比例为l：1000(1“g／mL)，该方法的检测范围为O．45．125ng／mL，检测下限为0．2ng／mL。对临床血清标本的检测结果显示：hK5在卵巢癌血清中含量为(3．77±1．47)ng／mL，显著高于健康女性血清(0．86±0．45)ng／mL(P<0．01)，40例卵巢癌患者血清其中有27例(67

6、．5％)hK5含量升高(>1．76ng／mL)；在结直肠癌血清中含量为(0．50±0．18)ng／mL，显著低于正常血清(0．72±0．41)ng／mL(P<0．05)。结论1．制备了高效价、高特异性的兔抗hK5多克隆抗体和鼠抗hK5单克隆抗体。2．构建了双抗体夹心ELISA检测方法，可定量分析血清中hK5含量。3．hK5在大部分卵巢癌患者血清中含量显著高于健康女性血清，而在大部分结直肠癌患者血清中表达量较正常血清下降。关键词：人组织激肽释放酶；人组织激肽释放酶5；抗体制备；ELIsAPREPARATIONOFANTI_hK5ANTIBODIESANDESTABL

7、ISHMENTOFSANDWICHELISAMETHODMajor：IHunun0109yPostgraduate：YanhuaWuSuperVisor：ProfChen卤inHuABSTRACTobjectiVeThehumankallikreingenefl锄ilyhasrecentlybeendiscoveredasanewcancerbiomarkerwhichconsistsof15genes．Humankallikrein5(hK5，encodedbytheKLK5gene)isanewmemberofthekalliheingenefamily，wh

8、ichha